La détection de l'hypoxie dans le cortex de souris microrégionale cérébrale par imagerie à deux photons de fluorescence endogène NADH

Summary

Nous décrivons ici une méthode pour visualiser directement l'hypoxie tissulaire microrégionale dans le cortex de la souris

Abstract

La capacité du cerveau de fonctionner à des niveaux élevés de demande métabolique dépend de l'apport d'oxygène en continu par le biais du flux sanguin et la diffusion d'oxygène aux tissus. Ici, nous présentons un protocole expérimental et visualisées méthodologique de visualiser directement l'hypoxie tissulaire microrégionale et d'en déduire les gradients d'oxygène périvasculaires dans le cortex de la souris. Il est basé sur la relation non linéaire entre le nicotinamide-adénine-dinucléotide (NADH) endogène intensité de fluorescence et de la pression partielle d'oxygène dans le tissu, où le tissu observées NADH fluorescence augmente brusquement à la teneur en oxygène inférieure à 10 mmHg tissus ^1. On utilise deux photons d'excitation à 740 nm qui permet pour l'excitation simultanée de la fluorescence de tissu intrinsèque NADH et le plasma sanguin en contraste avec le Texas-Red dextrane. Les avantages de cette méthode par rapport aux approches existantes sont les suivantes: il profite d'un signal de tissu intrinsèque et peut être réalisée en utilisant la norme à deux photons in vivo imvieillissement des équipements, il permet une surveillance continue dans l'ensemble du champ de vue avec une résolution en profondeur de ~ 50 um. Nous démontrons que les zones les plus éloignées de tissus cérébraux vaisseaux sanguins cérébraux correspondent à des zones vulnérables des bassins versants qui sont les premiers à devenir fonctionnellement hypoxique après une baisse de l'apport en oxygène vasculaire. Cette méthode permet à l'image de l'oxygénation corticale microrégionale et est donc utile d'examiner le rôle de l'approvisionnement des tissus en oxygène est insuffisante ou restreinte dans les maladies neuro-vasculaires et accidents vasculaires cérébraux.

Protocol

1. Préparation de l'animal pour l'imagerie

Remarque: Nous utilisons des souris adultes C57BL. Différentes souches transgéniques peuvent être utilisés en fonction de la question de recherche. Chirurgies microvasculaires et l'oxymétrie de pouls sont facilitées chez la souris avec de la fourrure blanche (par exemple FVB souche).

1. Préparer le site chirurgical sur le banc. Tous les instruments chirurgicaux doivent être autoclavés ou désinfectés avec de l'éthanol 70%.
2. Insérez une sonde rectale, et mesurent en permanence la température du corps de l'animal tout au long de la procédure
3. Anesthésier la souris en utilisant d'abord 5% d'isoflurane. En 15-30 s, lorsque l'animal ne se déplace pas, placez-le sur un coussin chauffant (37 ° C), et d'appliquer un masque pour l'administration continue de l'air contenant 1.3 à 1.5% d'isoflurane). Assurez-vous que l'animal ne répond pas à un stimulus douloureux (pincement de la queue, par exemple).
4. Utilisez artificielle gel lacrymogène pour couvrir les yeux de la souris, pour prévenir l'exposition à l'air sec.
5. Utiliser un rasoir électrique, retirez f cheveuxrom de la tête et des deux cuisses. Appliquer épilateur (par exemple Nair) à la cuisse pendant 2 min, puis essuyez-le soigneusement pour éliminer le reste des cheveux. Cette cuisse sera utilisée pour l'oxymétrie.
6. Désinfecter le cuir chevelu avec un 10% de povidone-iode solution et l'éthanol à 70%.

2. Préparation de la fenêtre ouverte du crâne crânienne

1. À partir de 5 mm caudale du crâne, faire une incision dans le cuir chevelu avec des ciseaux, et de faire avancer d'un centimètre. Déplacer la peau sur les côtés pour exposer le crâne.
2. Pour supprimer les membranes sur le dessus du crâne appliquer 10% de solution de chlorure ferrique vers le haut du crâne. Essuyez l'excès de solution, et gratter les membranes loin avec 45 ° d'angle # 5 pincettes. Il est important de préparer soigneusement le site, afin de veiller à ce que la plaque de tête peut être solidement fixé sur le crâne (étapes n ° 4 à 6).
3. En utilisant un microscope à dissection, identifier la zone d'intérêt. Notez que les sutures crâniennes devrait être évité parce que la c crâneune rupture imprévisible le long de ces lignes.
4. Appliquez une fine couche de colle rapide (par exemple Locktite 454) sur les bords de la fenêtre de la plaque de la tête (figure 1). Positionner la plaque de tête de telle sorte que la zone d'intérêt est exposée dans la fenêtre. Appliquez une légère pression sur la plaque de tête. Appliquez une petite quantité de ciment dentaire pour polymériser la colle rapide. Maintenez la position pendant 10 secondes pendant que la colle est de polymérisation.
5. Appliquer une petite quantité de colle rapide sur les bords de la fenêtre pour sceller la plaque de tête et le crâne. Vissez la plaque de tête à la porte des animaux dans le champ d'application de dissection.
6. Aide de la perceuse Microtorque II a fixé à 6000 rpm et un peu IRF de forage 005, enlever toute trace de colle supplémentaire à partir du crâne et de la plaque de la tête. Toute la colle restant sur la plaque de tête devrait être supprimée, car elle sera autrement interférer avec la fixation de la couverture en verre.
7. Réglez la perceuse à 1000 rpm, et commencer à forer le crâne en faisant un cercle intérieur de la fenêtre plaque de tête, diamètre ~ 5 mm. Utilisez lissages légers, comme si vous dessinez avec un crayon très doux. Arrêter le forage toutes les 20-30 secondes pour enlever la poussière d'os à l'aide d'air comprimé.
   Note: La forme de l'ouverture dans la plaque de tête permet un accès supplémentaire pour la foret (pour le chirurgien-gauche et à droite), ce qui rend plus facile pour créer une fenêtre circulaire crânienne. En outre, les deux impairs trous en forme de fournir l'espace nécessaire pour insérer une électrode de Clark-ou en verre-électrode dans le tissu cérébral sous la fenêtre crânienne pour d'autres mesures polarographiques ou électrophysiologiques.
8. Comme le forage progresse, un terrier est formé autour du crâne intact dans le centre. Veillez à ne pas piquer à travers le crâne amincie, mais pour faire de ce terrier de même épaisseur. Soyez prudent supplémentaire autour de sang gros vaisseaux-ils ne devraient pas être compromise et, si possible, même pas touché.
9. Utiliser l'un "jambe" de pincettes N ° 3 pour soulever ("feuilleter OFF") de l'os dans le centre de la fenêtre. Appliquez une goutte de Artificial liquide céphalo-rachidien (ACSF) sur la fenêtre.
10. Essuyez doucement à l'aide aCSF un coin de mouchoir en papier doux (par exemple Kimwipe). Habituellement, la durée est endommagé dans un ou plusieurs endroits à travers le bord de la fenêtre. À partir de l'un de ces sites, soulevez doucement, puis retirez la durée de la surface du cerveau, en utilisant des pinces angle de 45 ° N ° 5. Au moment de choisir le site à partir duquel commencer à enlever la dure-mère, éviter les zones adjacentes aux gros vaisseaux sanguins. En cas de saignement, appliquez une goutte de aCSF et attendre pendant 2-3 min pour un saignement mineur pour arrêter.
11. Préparer 0,07% bas point de fusion d'agarose dissous dans aCSF) Amener la fondue d'agarose à la température corporelle. Essuyer l'excès de la surface de LCRa du cerveau. Verser l'agarose dans la fenêtre, et couvrir avec une lame de verre. Appuyez doucement le verre pour faire un contact entre le verre et la plaque de tête, et attendre 10-20 secondes jusqu'à ce que l'agarose est solide.
12. Enlever l'excès d'agarose de la couverture de verre en utilisant des pinces et du papier tissu mou.
13. Mettez une petitequantité de colle rapide autour du verre de coller le verre à la plaque de tête. Appliquez une petite quantité de ciment dentaire à solidifier la colle (Figure 1).

3. L'injection intraveineuse et la surveillance oxygénation du sang

Remarque: Nous avons régulièrement utilisé dans la veine fémorale pour l'application par voie intraveineuse du Texas rouge plutôt que la veine de la queue. C'est parce que les injections veine fémorale des injections en bolus sûre et reproductible de la teinture.

1. Activer l'animal partiellement au-dessus d'exposer l'intérieur de la cuisse gauche. Utilisez du ruban adhésif pour fixer l'animal dans cette position.
2. Appliquer nettoyant antiseptique, puis l'éthanol à 100% à la peau.
3. Faire une incision le long de la cuisse médiale du genou à la symphyse pubienne. Séparez les tissus mous par dissection à l'aide des pincettes n ° 5.
4. Remplir la seringue de 1 ml avec 130 ul de Texas Red (2,5 mg / ml). Fixez une nouvelle aiguille (calibre 30), et le plier soigneusement à 30 °, en gardant le biseau vers le haut. Remplissez le wi aiguillee Texas Red solution.
5. Sous un microscope à dissection, insérer l'aiguille dans la veine fémorale et injecter 100 ml de Texas Red. Retirez l'aiguille et appuyer légèrement sur la veine avec de la gaze pour arrêter le saignement.
6. Fermez la peau à l'aide de suture 4-0.
7. Pour la surveillance continue du sang SpO ₂ (pour assurer l'oxygénation du sang adéquat) placer la sonde d'oxymètre à la cuisse droite (à partir de laquelle les cheveux a été retiré).

4. Imagerie biphotonique

Remarque: Nous utilisons un Olympus Fluoview1000 multiphotonique système d'imagerie (debout) avec un Ti Spectra-Physics MaiTai HP femtoseconde DeepSee: Sa laser comme source d'excitation. Pour l'imagerie, nous utilisons × 10 NA 0,45 (Zeiss C-Apochromat), ou 25 × NA 1,05 (Olympus XLPlan N) de l'eau d'immersion objectifs. Nous prenons des images à 12 bits de profondeur à une résolution de 512 × 512 pixels avec un pixel temps de séjour de 2 ms. Le NADH et le Texas-Red-dextrane sont en même temps excité à 740 nm, et fluorescence est séparée de la lumière d'excitation à l'aide d'un miroir dichroïque / proche-IR bloquant la combinaison de filtres (FF665-DI01; FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, Etats-Unis), divisé en deux canaux en utilisant un miroir dichroïque (505DCXRU, Chroma , Rockingham, VT, États-Unis), et filtré passe-bande (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Puissance du laser mesurée après l'objectif de 10-20 mW pour l'imagerie dans la couche I et 20-50 mW pour l'imagerie dans la couche II.

1. Transfert de la souris chirurgicalement prêt à la platine du microscope. Prenez une première image du site en utilisant la fenêtre crânienne fond clair avec un grossissement 4x pour l'utiliser comme une carte de référence pour l'enregistrement avec un plus fort grossissement à deux photons angiographies.
2. Zoom sur la zone d'intérêt en utilisant un grossissement x 10. Sélectionnez une zone d'intérêt dans les couches corticales I ou II (jusqu'à 150 um en dessous de la surface piale). Si un plus fort grossissement est désiré, utiliser l'objectif × 25
3. Début de l'enregistrement de la série chronologique (Figure 2). Nous vous recommandons d'utiliser une moyenne de 3-5 cadres pour améliorer la qualité de l'image.
4. Provoquer une hypoxémie en ajoutant N2 50% à l'air que l'animal respire. Cela portera le niveau d'O2 à 10%. Vérifiez l'hypoxémie par la surveillance des données d'oxymètre.
5. Continuer pour enregistrer la série de temps grâce à une hypoxémie (par exemple, pour 30 secondes), et après niveau normal O2 est rétablie.
6. Recueillir des données pour le calcul de la distribution d'oxygène par la détection, la mesure et la quantification de la zone de cylindres de tissus hypoxie et oxygénée autour des vaisseaux sanguins.

5. Informatique

1. Déterminer la Krogh tissus cylindre de rayon R. Cela peut être fait manuellement (Figure 3) en mesurant la distance entre le centre du vaisseau sanguin et de la limite haute à laquelle la fluorescence du NADH est détecté.
2. Sinon, utilisez le calcul enquêteur indépendant semi-automatique de détermination du rayon R tissus cylindre et le blo centraler od navire qui a été décrit précédemment ^{1 sous} forme complémentaire et résumées dans la section discussion de ce protocole.
3. Déterminer la zone de l'hypoxie en utilisant un logiciel d'accès ouvert d'analyse d'image, par exemple ImageJ. Pour ce faire, utiliser le signal NADH, définir un seuil qui délimite la zone de haute intensité NADH, puis de mesurer la surface avec la fluorescence des tissus élevée NADH.

6. Les résultats représentatifs

La figure 2 montre une vidéo de NADH / angiographie images lors de l'hypoxémie transitoire (pour la version PDF de cette figure, les images sélectionnées ont été utilisées). La concentration d'oxygène inspiré a été abaissé de 21% à 10% pour une période de 3 min. Ce niveau d'hypoxémie induite expérimentalement est suffisante pour induire une hypoxie sévère dans le cortex cérébral. Hypoxie conduit à une augmentation de la fluorescence du NADH, d'abord dans les régions qui étaient la plus éloignée de l'irrigation sanguine artérielle. Notez le tissu NADH fortefrontières, qui représentent les limites observables de tissus diffusion de l'oxygène à partir de la microcirculation corticale. L'image de la figure 3 montre la géométrie des limites de diffusion d'oxygène entourant les vaisseaux cérébraux. Il est possible de déduire Krogh diamètres de cylindre de ces limites, comme décrit précédemment ^1.

Figure 1. (A) de souris avec fenêtre crânienne préparé pour l'imagerie. (B) Dimensions de la plaque de tête.

Figure 2. Endogène NADH fluorescence verte visualisées avec l'imagerie à deux photons à travers la fenêtre crânienne, environ 50 um en dessous de la surface piale. Les vaisseaux sanguins sont visualisées avec Texas Red dextran. Oxygène dans l'air inhalé a été réduit à 10% pendant 3 min, puis restauré pour 21%. La barre d'échelle: 50 um.

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Figure 3. Géométrie de NADH limites de fluorescence. Contour jaune montre la limite de l'hypoxie fonctionnelle; cercles bleus montrent projetées oxygénés (Krogh) cylindres. Les lignes bleues indiquent les rayons cylindre; chiffres montrent rayons en micromètres.

Discussion

Haute résolution spatiale des informations sur la diffusion d'oxygène est important de comprendre comment le flux sanguin dans le cerveau est régulé pour fournir l'oxygène aux cellules du cerveau, et de répondre à la demande métabolique. Traditionnelles mesures de l'oxygène en utilisant des électrodes polarographiques de verre de style Clark sont très envahissantes et ont une faible résolution spatiale ^2-3 et temps de réponse significative (deuxième plage). Jusqu'à présent, la seule méthode non-invasive pour la mesure de la pO ₂ dans le tissu cérébral est trempe phosphorescence, où le taux de décroissance de la sonde excité est proportionnelle à ⁴ la concentration en oxygène. Cette méthode fournit des concentrations d'oxygène précis, mais nécessite un colorant et un propriétaire techniquement sophistiqué système d'imagerie phosphorescence vie. Ici, nous démontrons une simple, approche plus simple qui peut être effectuée sur un système d'imagerie à deux photons en standard avec deux canaux flurescence. Notre approche tire parti d'un signal de tissu intrinsèque ⁵ ae ne nécessite que la visualisation contraste de la microcirculation corticale. En raison de la non-linéaire, augmentation essentiellement binaire de NADH fluorescence à fonctionnellement limiter les concentrations d'oxygène ^1, augmenté intrinsèque NADH fluorescence est observée seulement dans les zones importantes, limitant l'hypoxie métabolique. Une implication importante est que les limites des tissus de diffusion de l'oxygène à partir de microvaisseaux corticaux sont directement observables par les changements d'intensité de forme cylindrique de NADH fluorescence endogène. Nous nous référons à ces structures que les cylindres Krogh, parce que le concept de structures de forme cylindrique qui définissent le volume oxygéné du tissu environnant un vaisseau sanguin a été introduit par Krogh Août et a été récemment observé expérimentalement à l'aide de deux photons NADH imagerie ^1. Cylindres Krogh images peuvent être collectées en 3D en prenant un z-stack de trames d'image. Ils sont particulièrement marquée dans le voisinage des artérioles pénétrantes et elles sont l'esprit congrueh capillaire appauvri périartériolaires cylindres tissus ^1,4.

Pour fournir une détermination objective de la R tissus Krogh rayon du cylindre (voir section 5.2), nous avons mesuré leurs valeurs d'intensité de pixels radiaux dans un segment bien défini entre le centre du cylindre et la limite extérieure en utilisant la fonction Matlab "improfile". La limite externe du segment doit être choisi pour étendre avec une marge de sécurité au-delà de la limite visibles. Pour améliorer le niveau de signal sur bruit on averageed de toutes les lignes radiales nécessaires pour couvrir le segment visible cylindre à pas de 1 °. Le profil moyen résultant d'intensité radiale dans le segment présentait une forte augmentation qui correspond à la limite de tissu R visible. Le nous nous situons une fonction sigmoïde (par exemple Boltzmann fonction) pour le profil d'intensité radiale moyenne et a utilisé son point d'inflexion (aussi connu sous le nom x ₀₎ comme une définition de la R. Le correspondante de deux pHoton microangiographie (Texas-rouge) a révélé la section transversale d'un vaisseau sanguin central solitaire dans le centre du cylindre. Le diamètre du vaisseau sanguin centrale peut être appliquée directement à déterminer r.

Deux photons NADH imagerie fournit la même résolution spatiale que la concurrente imagerie à haute résolution de l'microangiographie corticale. Une caractéristique importante pour l'application quantitative de cette méthode est que p ₅₀ de l'augmentation de la fluorescence du NADH a été mesurée à 3,4 ± 0,6 de mm Hg ¹ et que l'intensité de fluorescence du NADH en fonction du tissu microrégionale pO ₂ peut être décrit mathématiquement avec une fonction sigmoïde. . Nous montrons que cette technique permet d'identifier les zones du cerveau qui sont les plus vulnérables à l'hypoxie (diminution de la teneur en oxygène de l'air à 10%). Nous montrons également que la diffusion d'oxygène suit un modèle géométrique simple périvasculaire.

Une critiqueétape iCal pour cette méthode est la qualité de la préparation fenêtre crânienne. La chirurgie devrait produire un minimum de dommages pour ne pas perturber le flux sanguin vers la zone exposée. Une préoccupation, c'est que dans une préparation chirurgicale compromise, le cortex sous la fenêtre peut être hypoxique, pour commencer, s'oppose à toutes les expériences significatives. Une fenêtre bien préparé crânienne devrait avoir intacts les vaisseaux sanguins majeurs et mineurs à la circulation sanguine vive dans tous les types de navires et aucun saignement important le long des bords. Dans des conditions normoxiques (PaO2 mmHg 80-100, Sp O2 97-99%) dans le parenchyme cérébral doivent présenter uniforme, la fluorescence du NADH homogène sans taches bien visibles, des tissus lumineux avec une fluorescence NADH élevée.

Une contrainte physique fondamentale de notre approche est limitée profondeur de pénétration. La fluorescence bleu-vert NADH dans le cerveau est rapidement atténué par l'absorption de l'hémoglobine et de diffusion tissulaire à ces longueurs d'onde. Même avec une ouverture numérique élevée (par exemple 1,05) de l'eaudes objectifs à immersion à deux photons NADH imagerie est actuellement limitée à corticale couches I et II. Cette limitation est scientifiquement pertinente, car le métabolisme de l'énergie dans ou à proximité de la substance blanche sera probablement différente de la matière grise. Toutefois, l'enquête de profondes structures corticales telles que des couches IV-VI ou des structures sous-corticales comme faisceaux de matière blanche ou le striatum exigerait l'utilisation de microlentilles spécialisées telles que décrites dans le cortex de la souris in vivo ^6.

NADH-mesure basée sur des limites diffusion de l'oxygène peut être particulièrement utile lorsqu'il est combiné avec d'autres mesures telles que les analyses d'hyperémie fonctionnelle, et la détection de taux de flux capillaires ^7. Par exemple, cette technique peut être adaptée pour visualiser l'hypoxie dans la course et la maladie d'Alzheimer (AD) des modèles. La géométrie simple de diffusion de l'oxygène permet de prédire le gradient d'oxygène dans des lits microvasculaires dans des circonstances où la densité capillaire est defroissé ⁸ (par exemple, AD ⁹⁾ et d'examiner si les régions de tissus cérébraux dont la densité capillaire réduite courent un risque accru pour les dommages en raison de l'hypoxie microstrokes. La capacité de l'image microregionally permet également à examiner la géométrie et les dimensions de microstrokes tissus et déterminer le volume de tissu dans laquelle l'hypoxie se produit, ainsi que la relation entre l'hypoxie tissulaire et postérieure mort neuronale ou remodelage capillaire ^10.

Enfin, puisque les augmentations de la fluorescence du NADH endogène sont la conséquence directe de la dysfonction mitochondriale aiguë, cette méthode crée la possibilité d'utiliser l'imagerie NADH en tant que journaliste pour le métabolisme énergétique spécifique de neurones ¹¹ et un proxy pour un dysfonctionnement mitochondrial.

En conclusion, l'imagerie à deux photons de fluorescence est endogène NADH un outil simple et peu exigeante qui peut être utilisé pour comprendre l'apport d'oxygène et la consommation dans le cerveau sous la normale à la foiset dans les états pathologiques.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heating pads	Beyond Bodi Heat
Ophthalmic ointment (Artificial tears)	Pfizer Pharma GmbH
Povidone-iodine 10% solution	Betadine Puredue Pharma
Ferric chloride 10% solution
Cement	Stoelting Co.	51456
Cyanoacrylate 454	Loctite
aCSF	Harvard Apparatus	597316
Microtorque II handpiece kit	Pearson Assessments	R14-0002
IRF 007 drill bits	Fine Science Tools	19008-07
Forceps #5	Fine Science Tools	11295
Forceps #5/45	Fine Science Tools	11251-35
#0 glass coverslip	Electron Microscopy Sciences	63750-01
Photomultiplier tube	Hamamatsu Corp.	HC125-02
Ti:Sapphire laser Mai-Tai	Newport Corp.