Summary
Multipel-Target Sporingen er en hjemmelavet algoritme udviklet til sporing individuelt mærkede molekyler i plasmamembranen af levende celler. Effektiv opdage, vurdere og sporing molekyler over tid ved høj densitet giver et brugervenligt, omfattende værktøj til at undersøge nanoskala membran dynamik.
Abstract
Vores mål er at opnå en omfattende beskrivelse af molekylære processer finder sted på cellemembraner i forskellige biologiske funktioner. Vi stræber efter at karakterisere den komplekse organisation og dynamikken i plasmamembranen på enkelt-molekyle niveau, ved at udvikle analytiske værktøjer dedikeret til enkelt-partikel Tracking (SPT) ved høj tæthed: Multiple-Target Tracing (MTT) 1. Enkelt molekyle videomicroscopy, giver millisekund og nanometrisk opløsning 1-11, tillader en detaljeret afbildning af membranen organisation 12-14 ved nøjagtig kortlægning deskriptorer såsom celle-receptorer lokalisering, mobilitet, indespærring eller interaktioner.
Vi fornyet SPT, både eksperimentelt og algoritmer. Eksperimentelle aspekter omfattede optimering opsætning og celle mærkning, med særlig vægt på at nå den højest mulige mærkning tæthed, for at skabe en dynamisk øjebliksbillede af molekylær dynamik ens det forekommer inde i membranen. Algoritmiske problemer pågældende hvert trin anvendes til at genopbygge baner: toppe detektion, estimering og gentilslutning, behandles af specifikke værktøjer fra billedanalyse 15,16. Implementering deflation efter afsløring giver redde toppe i første omgang skjult af tilstødende, stærkere toppe. Det skal bemærkes, direkte forbedre afsløring påvirker gentilslutning, ved at reducere huller i baner. Forestillinger er blevet evalueret ved brug Monte-Carlo simuleringer for forskellige mærkning tæthed og støj værdier, som typisk udgør de to store begrænsninger for parallelle målinger med høj spatiotemporal opløsning.
Den nanometrisk nøjagtighed 17 opnået for enkelte molekyler, enten ved hjælp af successive on / off photoswitching eller ikke-lineær optik, kan levere udtømmende observationer. Dette er grundlaget for Nanoscopy metoder 17, såsom STORM 18, PALM 19,20, RESOLFT 21 eller place 22,23, whiCH kan kræver ofte billeddannende faste prøver. Den centrale opgave er at afsløre og vurdering af diffraktion-begrænsede toppe stammer fra enkelt-molekyler. Derfor giver tilstrækkelige forudsætninger, såsom håndtering af et konstant positionsnøjagtighed i stedet for Brownsk bevægelse, er MTT ligefrem velegnet til nanoskopiske analyser. Endvidere kan MTT fundamentalt anvendes i enhver skala: ikke blot molekyler, men også for celler eller dyr, f.eks. Derfor MTT er en effektiv sporing algoritme, der finder anvendelse på molekylære og cellulære skalaer.
Protocol
I denne video, præsenterer vi en helt enkelt partikel sporing eksperiment, ved hjælp af kvante-prikker målrettet til en specifik membran receptor. Hovedmålet med dette eksperiment består i kræsne forskellige typer molekylær diffusion adfærd målt i plasmamembranen af levende celler. Faktisk kan molekylære bevægelser, der opstår på membranen typisk afvige fra Brownsk diffusion ved at blive lineært rettet eller begrænset i nanodomains 26-29, f.eks. Vi stræber efter at samtidig efter så mange receptorer som teknisk muligt, at give et øjebliksbillede af sorten opstår i den dynamik, der opstår på membranen af en levende celle. Dette sidste ende forventes at muliggøre dechiffrering af de mekanismer, der regulerer celleoverflade-receptor signalering.
1. Cellekultur
- Forberede cellulær prøve: bruge adhærente COS-7 celler, der endogent udtrykker epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) 30. Hvornårarbejde med levende celler uden antibiotika sørg for ikke at have nogen latent sub-påvises forurening ved hjælp af ordentlig sterile teknikker på ethvert tidspunkt under forberedelsen.
- Dyrke celler i komplet medium (DMEM med 10% kalveserum, 1% glutamin, 1% HEPES og 1% natriumpyruvat, se tabel specifikke reagenser nedenfor) ved 37 ° C med 7% CO2, idet man have dem i sub-sammenflydende, eksponentiel vækst før at sprede dem i Lab-Tek.
- På dagen før forsøget, spredes 5000 celler / brønd i 8 brønde kamre (Lab-Tek) og inkuber natten over. Tælle celler sikrer en konstant celletæthed dermed en reproducerbar forhold kvante-prikker per celle.
2. Cellemærkning
Forberede kvante-prikker med en specifik coating. Kvante-prikker er fluorescerende nanopartikler består af halvledere. Disse nanopartikler udgør en stor interesse, fordi de er meget lyse og fotostabilt i forhold til klassiskfluorescerende prober 31,32, hvilket tillader opnåelse af et passende signal til støj-forhold (SNR) for enkelt molekyle billeddannelse.
- Før eksperimentet fremstilling af Fab-fragmenter mod EGFR fra hybridom-cellelinie (mAb 108, ATCC HB-9764) ved fordøjelse med papain som tidligere beskrevet 21.
- Konjugatet Fab med biotin, ifølge producentens instruktioner (EZ-Link sulfo-NHS-LC-biotinyleringskit, Thermo Scientific, figur 1A.).
- Anvende kvante-prikker funktionaliseret med streptavidin (Invitrogen) og emitterer ved 605 nm (optimal emissionsbølgelængde for glans, påvisning og adskillelse fra cellulær autofluorescens).
- Fremstille mærkning opløsning i komplet medium (se tabel specifikke reagenser) med henblik på at mætte streptavidins foreliggende omkring kvante-prikker, såvel som at forebygge aggregering og ikke-specifik binding til cellerne og dækglasset.
- Forbered to mellemliggende løsninger:en med kvante-prikker-streptavidin og et andet med biotinyleret Fab, hver på 20 nM.
- Blande et lige volumen af disse to opløsninger: Bland kvante-punkter med Fab i forholdet 1:1 til opnåelse af en endelig bearbejdning koncentration på 10 nM Fab: kvante-prikker kompleks. Brug et ækvimolært forhold favoriserer dannelsen af mono-funktionaliserede komplekser sammensat af en kvante-prik og en biotinyleret Fab-fragment. Dette fremmer monovalent mærkning, begrænser artifact observationer på grund af receptor krydsbinding 33,34.
- Inkuber i 15 minutter ved 25 ° C under anvendelse af et rysteapparat ved 1.200 omdrejninger i minuttet for at forhindre aggregering. Blandingen er derefter klar til brug på levende celler.
- Cellerne inkuberes i 100 pi blanding i 5 minutter ved 37 ° C med 7% CO2.
- Vask cellerne med ikke-autofluorescerende billeddannende medium (HBSS-buffer, 1% HEPES, se tabel specifikke reagenser) præ-opvarmet til 37 ° C.
- Fjern forsigtigt det overskydende af etiketter for at forhindre FNnødvendigt at ødelægge SNR ved ubundne, ude af fokus kvante-prikker, som omfattende vask af hver brønd med billeddannende medium, typisk 5 gange ved stuetemperatur med mindst 5 minutters forsinkelse før den sidste vask.
3. Optiske opstilling
Den video-mikroskopi setup består af fire dele:
- Et inverteret mikroskop med en specifik fluorescens kubus (FF01-457/50 excitation, FF495-DI02 dikroisk og FF01-617/73 emissionsfiltre, Semrock) og en høj numerisk blænde (1,3 eller 1,49) olie-neddypning 100x mål.
- En 100 W kviksølvlampe (koblet til mikroskopet gennem en optisk fiber, undgå at forstyrre termoregulering).
- En 512 x 512 pixels høj følsomhed EMCCD kameraet for at opnå en tilstrækkelig SNR.
- En inkubator for at holde biologiske prøver ved 37 ° C under forsøget.
4. Køb
- Vælg isolerede og godt-spredning celler. Dettegår ind for udvidelse af pæn, flad lamellipodia, bedst egnet til at lede efter plane bevægelse af membranmolekyler.
- Vurdere cellulære fysiologiske status ved sit udseende både i lys og fluorescens: intens vesikulær trafik, fravær af nekrotisk eller apoptotisk tegn, lav autofluorescens og gennemsnitlig stærk kvante-dot mærkning (typisk op til 1.000 kvante-dots per celle, se fig. 1B, C).
- Vælge en høj mærkning tæthed, hvilket er kritisk for samtidig overvågning mange receptorer som muligt. Dette er faktisk begrænset af både fysiologiske (flade udtryk, epitop tilgængelighed, lateral bevægelse) og algoritmiske parametre (ikke-overlappende point-spread-funktioner (PSF), også under hensyntagen til sløring på grund af bevægelse, for at tillade korrekt detektion og genåbning).
- For hver celle, får først en lysfelt felt billede (fortrinsvis ved hjælp af DIC, hvis de findes), der yderligere kan tillade kontrol af cellen aspektog rumlige grænser for lamellipodia.
- Gem dette billede med samme navn som video-stack (såsom cell1.tif & cell1.stk for eksempel), i en undermappe ved navn DIC, da disse konventioner, kan algoritmen automatisk finde tilbage matchende billedet for hver stabel.
- Anskaf 1 til 3 videoer per celle, kontinuerligt, typisk ved 36-ms sats, den hurtigste hastighed opnås i full frame med dette kamera. Imidlertid kan man opnå ved højere frekvenser op til 1-ms hastighed, ved hjælp af dedikeret CCD med forøget følsomhed og / eller mindre pixel. Rammen-transfer teknologien giver minimal forsinkelse mellem rammer.
- Elektron multipelt forbedring bør altid være indstillet til maksimal (lige under mætning, hvis relevant) for at tillade nå enkelt molekyle følsomhed med en tilstrækkelig SNR, mindst over 20 dB (for effektiv topdetektion 1), typisk omkring 25-30 dB.
- Typisk får 300 frames per video, syndce baner er rekonstrueret på ~ 100 frames i gennemsnit, oftest begrænset af lange blinkende begivenheder. Video frekvens og længde kan tilpasses til en bestemt foranstaltning, som kan kræve længere spor f.eks.
5. MTT Analyse
- Vælg stien til den mappe, der indeholder de videofiler til at vurdere en given datasæt med Matlab eller Octave.
- For at starte den fuldt automatiseret analyse 1,35, skriv kommandoen detect_reconnex23 i oktav, eller MTT23i i Matlab. Dette program står for "version 2,3, med brugergrænseflade" og er tilgængelig for download, sammen med den tidligere version 2,2. Det første viser en grafisk grænseflade liste over alle de anvendte parametre, som vist i fig. 2.
6. Repræsentative resultater
MTT automatisk analyserer hver optager video, til at levere spor af fundne og anslået mål, suppleret med yderligere ivestigations såsom indeslutning detektion. Dette sidste ende tillader kortlægning spor over celle-billeder (figur 1C og 3).
MTT Beskrivelse
Kernen MTT Analysen udføres over hver frame, påberåber 3 hovedopgaver (Fig. 3):
- Detektion af tilstedeværelsen eller fraværet af en mål (kvante-dot) i en glidende underområde successivt centreret omkring hver pixel, hvor to hypoteser sammenlignes: tilstedeværelse af enten et signal med polyesterfibre Modelvarslingssystem som en bi-dimensional gaussisk peak eller kun støj, med en tærskelværdi forsikring tilstrækkelig lav falsk alarm med mindre end en falsk detektion per ramme. Dette fører til et kort påvisning sandsynlighed. Hver lokal maksimal betragtes som en putativ mål, hvilket sikrer, at dens sandsynlighed er højere end en minimal værdi, der ifølge den ønskede sandsynlighed for falsk alarm (PFA). Denne grænse er sat lavt nok til effektivt at diskriminere SIGnaler fra støj, undgå på bedste falske registreringer (PFA på 10 -6 som standard, for at sikre mindre end én fejl i 512 x 512 pixel billeder), mens det stadig tillader en tilstrækkelig stor sandsynlighed for, at nå teoretisk forudsagt optimalt 1. Bemærk, at kravet om anvendelse af en sub-region antyder, at billeddata grænser (3 pixel, for en standard vindue på 7 x 7 pixel) ikke kan evalueres.
- Estimering for hver detekteret mål af de relevante parametre, såsom sub-pixel position og signalintensitet. For hver detekteret mål er en mindste kvadraters Gauss-Newton egnet siden udføres for at estimere den position, bredde og højde af det detekterede gaussisk. Dette giver især sub-pixel position farvestof (10 til 20 nm nøjagtighed for typiske SNR værdier og immobile eller langsomt sprede farvestoffer, stigende op til ~ 100 nm for farvestoffer diffuserer på 0,1 um 2 / s).
- Genåbning af de nye mål medspor allerede bygget over de tidligere rammer. Sættet af nye mål er matchet med sættet af tidligere spor. Til dette formål, med henblik på at tildele hvert mål til et spor, hvis det er muligt, er alle tilgængelige statistiske oplysninger indhentet fra påvisningstrinnet anvendes, ikke kun position, men også intensitet, bredde, blinkende og tilhørende statistik. Derfor er målene ikke blot knyttet til nærmeste spor: I tilfælde af krydsende spor, intensitet, hastighed, bredde og blinkende vil blive overvejet. Dette giver den statistisk optimale gentilslutning score. Denne strategi undgår, når det er muligt, forspænder genetablering mod de nærmeste naboer.
Registrerede toppe kan være en efterfølgende afvist, hvis deres vurdering eller gentilslutning mislykkes. En særlig test håndterer påvisning af nye toppe, som vil tage initiativ til nye spor. Denne test bruger en mere stringent PFA (10 -7), da tilslutte en top til et spor kan tolkes de facto som en validering o f dets relevans (dette kriterium er per definition ikke gælder for nye toppe).
Trajectory Analyse
Mulig forbigående indespærring næste gang vurderes af en funktion omvendt relateret til lokal diffusion 24-29. Påføring af en tærskelværdi tillader at definere begrænset eller ikke episoder. Ved iteration disse over alle spor, kan vi kortlægge membran dynamik i form af forbigående indespærring / bremse begivenheder. Dette kan alternativt repræsenteres ved hjælp af enten binære eller diskrete værdier af denne indespærring indeks.
Som standard, automatisk MTT udfører disse opgaver, sparer 8 peak parametre i en tekstfil: stelnummer, i og j position, signalintensitet, radius, offset og blinker, for hver video frame (gruppe 7 rækker) og spor (kolonne) . Disse output parametre kan genindlæses i Matlab eller Octave bruge fread_data_spt script for yderligere at analysere, dvs spor eller signal intensiteter, som eksemplificeret i "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt"> MTT_example script i appendiks.
Yderligere analyser fører til at kortlægge spor i hver celle (fig. 1C og 3) og give histogram fordeling for relevante parametre (såsom topintensiteter, SNR eller lokale diffusions værdier). For hver fil, betyder og standardafvigelse for hver parameter gemmes i en tekstfil, sammen med et billede af histogrammer. Logaritmiske fordelinger, såsom kvadratiske forskydninger R2, føre til geometriske middelværdi. Den diffusionskoefficient D beregnes fra et lineært fit over de fem første punkter i MSD kurven. Disse værdier giver et overblik over et eksperiment involverer for eksempel kinetik af cellulære reaktioner eller farmaceutiske / enzymatiske behandlinger påvirker membran organisation. Da MTT er en open source-kode, kan dette aspekt kan let tilpasses enhver dedikeret undersøgelse.
599fig1.jpg "alt =" Figur 1 "/>
Figur 1. Overvågning membranreceptorer dynamik ved MTT (a) membran-komponenter, såsom EGFR, er kodet med kvante-prikker koblet til biotinylerede Fab-fragmenter (skematisk tegning med tilnærmelsesvis korrekt skalering af hvert molekyle). (B) Typisk fluorescerende billede er indsamlet fra et levende COS-7 celle med 36 ms eksponeringstid, der afbilder diffraktionsbegrænset toppe svarende til individuelt mærket receptor. (C) Produktion af MTT-analyse viser de rekonstituerede baner af receptorer, som ligger oven på brightfield billede af cellen.
Figur 2. MTT inputparametre. Løb MTT23i åbner en grafisk brugergrænseflade liste over alle input parametre, navne og standardværdier, som beskrevet i vores tidligere publikation 1. I algoritme, rum og tid parametre (søgning vinduer, peak radius, maksimal diffusion og blinker) er dimensionsløse standard enheder, pixels og rammer. Kalibreringer kan anvendes efterfølgende til at konvertere output resultater. Standardværdier, svarende til en Cascade 512BFT med 100x forstørrelse, er pixel størrelse: 156 nm / pxl og ramme forsinkelse: 36 ms / ramme.
Undersøgere bør optimere nogle kritiske parametre, såsom den maksimale forventede diffusionskoefficienten ("Diff max") og den maksimale blinkende forsvinden ("T off"). Disse to rum og frister er næsten de eneste, der skal overvejes for en given eksperimentel tilstand, mens de øvrige indstilles til robuste standardværdier. For eksempel er antallet af falske alarmer direkte indstillet til at sikre mindst én fejl per million pixels, således mindre end en per ramme, hvilket er tilfredsstillende i de fleste tilfælde. Alle parametre er gemt i en tekstfil i output mappe, giver brugerne mulighed for senere kontrollere hvilke indstillinger blev brugt til analyse.
s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg "alt =" Figur 3 "/>
Figur 3. Større skridt i MTT analyse. Start fra en eksperimentel stak af fluorescens billeder, toppe sekventielt og registreres automatisk, estimeret ved en gaussisk pasform og tilsluttes igen i løbet af frames (første række af operationer, øverste del af diagrammet). Spor kan yderligere analyseres for formodede indespærring, for eksempel, i sidste instans fører til en dynamisk kort relevante deskriptorer (andet område af operationer, nederste del).
Figur 4. Mærkning valens ikke påvirke MTT. At vurdere de mulige skævhed indført ved kulturgenstandsspor multivalent mærkning, blev MTT analyse udført for at spore endogen EGFR tagget med 2 forskellige ordninger, for at generere og analysere kort over baner. (A)-receptorer blev mærket med biotinyleret Fab og kvante-dots605-streptavidin, som beskrevet i protokollen.I dette tilfælde kan flere valensen af kvante-prikker og streptavidins resultere i kobling flere receptorer på en enkelt farve. (B) receptorer blev mærket med Fab direkte koblet til et organisk farvestof, Atto647N. I dette tilfælde kan man Fab dermed en receptor, være koblet til flere farvestof. (C) Mean Square forskydning (MSD) kurve blev beregnet for alle spor for hver celle, mærket enten med kvante-dot eller Atto farvestoffer (venstre og højre grafer, henholdsvis). Diffusionskoefficienter blev beregnet ved lineær fit i løbet af de fem første punkter i MSD (rød stiplet linie). Hver ordning for mærkning ført til lignende diffusions værdier (central graf). Qdot: kvante-dots605 (n = 5-celler), Atto: Atto647N (n = 7-celler), NS: ikke signifikant (Student t-test p-værdi> 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I enkelt-partikel tracking,, ved siden af de celle og mikroskopi aspekter analysen udgør en væsentlig del af arbejdet. Dette omhandler algoritme, der anvendes til at udføre de tre hovedopgaver: afsløre, estimering og tilslutte toppe over hver frame. Men den deraf følgende aspekter af dette arbejde ligger i udarbejdelsen af algoritmen selv, som måske skal tilpasses til en ny dedikeret undersøgelse, hovedsagelig i de sidste og ekstra skridt (såsom at dechifrere former for bevægelse, interaktion eller støkiometri).
Men når algoritmen er fuldt udviklet, kører det er ligetil, især da vi har betalt opmærksomhed på at holde antallet af inputparametre på minimum (fig. 3). Dette gør MTT meget robust og let at implementere. Forbindelse med udarbejdelsen af MTT, at vi med henblik på helt at genoverveje de analytiske muligheder, der anvendes for hver opgave. Vi ønskede at optimere processen langs to udfordrende akser:
- Dealing with høje tætheder af mærkning indeholder detaljerede geografiske informationer på sigt af cellens overflade prøvetagning. Ideelt ville man forsøge at følge en næsten komplet molekylær population samtidigt, for at opnå en samlet observation. Imidlertid ville sådanne udtømmende mærkning føre til et billede svarende til det klassiske opnået ved immunfluorescens uden enkelt molekyle opløsning, idet alle etiketter stærkt overlapper på grund af diffraktion. For typiske molekylær antal (dvs. -10 5 receptorer celle 30) og cellestørrelse (dvs. ~ 30 um), hvis vi antager homogen fordeling den gennemsnitlige mellem molekylet afstand er ~ 100 nm. Diffusion i købet bidrager også til at sprede PSF i et sammenligneligt omfang: typisk ~ 100 nm for Brownsk bevægelse på 0,1 um 2 / s under 30 ms. Bemærkelsesværdigt, denne spredning er isotropisk i gennemsnit og således stadig frembringer en Gaussisk-lignende polyesterfibre. Således op til 10% af populationen kunne teoretisk detekteres, da dette ville lead til en gennemsnitlig afstand på ~ 300 nm, som er forenelige med diffraktion og bevægelse grænser. Men det skal være moduleret ved at redegøre for inhomogenitet i den geografiske fordeling, mærkning begrænsninger (såsom steriske begrænsninger, epitop tilgængelighed osv.), øget og selv uløselige konflikter på grund af krydsende baner, og den samlede detektion effektivitet. Eksperimentelt, kunne vi nå og præcist overvåge en væsentlig del af den samlede befolkning, med tætheder på ~ 1000 etiketter inden for et synsfelt på 80 um bredde. Denne øvre grænse resultater fra et kompromis mellem behovet for individuelle opdagelser og målet om en udtømmende rumlig måling (se fig. 1C til at værdsætte den rumlige prøvetagning af celleoverfladen).
- Håndtering af svageste muligt SNR tillader billeddannelse enten ved lav belysning, hvilket er gavnligt for celler levedygtighed og / eller ved høj hastighed, hvilket giver bedre tidsmæssig information. Imidlertid indebærer dette lavere signalerpr billede, som følge af lavere antal af indsamlede fotoner. Bemærk, at den korteste timingen opnås ved EMCCD kameraer (1 ms) synes at svare til den lavest acceptable SNR (20 dB) for korrekt detektering og måling ved MTT.
Mærkning valens er et tilbagevendende spørgsmål i enkelt molekyle studier. Faktisk er direkte måling af farvestoffet / målforhold meget udfordrende 34. Men en alternativ måde til at undersøge den formodede skævhed indført ved kulturgenstandsspor multivalent mærkning består i at sammenligne foranstaltninger med enten kvante-dot tags (med angiveligt flere mål pr farvestof, overtalelse kulturgenstandsspor krydsbinding) eller organiske farvestof tags (med, i modsætning, formodentligt flere farvestoffer per mål. påvirke kun signalintensitet og blegning egenskaber) Vi og andre 6,36,37 har observeret lignende adfærd ved brug af enten kvante-prikker eller organiske farvestoffer (atto647N i vores tilfælde, fig. 4), i form af diffusion og overgang mellem modes af bevægelse. Variation i diffusions værdier mellem de to betingelser er mindre end den celle-til-celle ulighed (fig. 4C). Dette viser, at mærkning valens, selv om det ikke er strengt monovalent, påvirker ikke signifikant SPT resultater.
Indespærring og molekylære interaktioner
Forbigående eller stabil fødsel kan tolkes som undertegnelsen af affinitet eller interaktion 24-29. Biomembranes er faktisk stærkt uensartet, med lokale forsamlinger dikteret af strukturelle funktioner såsom hydrofobicitet, transmembrane størrelse og grænsefladespændingen. Disse drivkræfter føre til spatiotemporal ombygning af funktionelle enheder med kritiske roller, dvs signalering, vedhæftning eller menneskehandel. Kortlægning og kvantificere sådanne begivenheder forventes at give en nøgle til at dechifrere, hvordan en celle integrerer kontinuerligt præsenteret stimuli. Faktisk, for en celle, der udviser en passende tilpasning gennem et præcist svar REQuires tuning samspil mellem signalsystemer partnere og deres miljø. Membranreceptorer kan interagere enten med sub-membran cytoskeleton hegn, membran strukturer såsom endocytiske gruber eller fokale sammenvoksninger, eller også proteiniske / lipid partnere, der er involveret i signalering domæner f.eks. I vores repræsentation, kan sådanne begivenheder undersøges gennem indespærring styrke og dens variationer over tid og rum. Denne yderligere styrker vigtigheden af at arbejde på det højeste opnåelige rum-tid opløsning, at glemme de begrænsninger, der er forbundet til korte tider og høje tætheder, som omtalt ovenfor.
Komplementære teknikker
Det er en god ide at sammenligne sådanne dynamiske målinger med andre metoder. For eksempel andre dynamiske mikroskopi teknikker, ligesom FRAP og FCS give supplerende følsomhed og opløsning 4,38,39. FRAP giver et ensemble måling af molekylær diffusion, mens FCS kan nå sINDRE-molekyle følsomhed, med en meget god tidsopløsning. Imidlertid er begge metoder ifølge sagens natur begrænset til et lokalt mål (typisk inden for et konfokalt plet). Det motiverede os til at udnytte og skubbe de grænser, de rumlige muligheder for sømløse rør: undersøger et stort synsfelt, til at omfatte en hel celle på en gang, sammen med et lokalt relevant spatiotemporal nøjagtighed.
Yderligere Udviklingen og Undersøgelser
Ifølge vifte af biologiske spørgsmål, der kan løses ved hjælp af enkelt-molekyle målinger, kan MTT forlænges langs forskellige retninger, på hvert niveau: registrering, vurdering, gentilslutning og yderligere analyser. For eksempel kan man betragte behandle mere end én molekylær population, kræver flerfarvet påvisning - som kan udføres med dedikerede optiske eller analytisk ordninger. Estimering kan inkludere nye relevante beskrivelser, som enhver anden spektral eller polarisering oplysninger eller aksialez position, for at udvide opsporing i 3D-40.
For gentilslutning, kan de Brownske og blinker antagelser være helt op til fornyet overvejelse for et bestemt problem. Interessant nok, single-molekyle målinger er blevet udvidet i løbet af det sidste årti til det såkaldte nanoskopiske regime 17,22,23. Selvom MTT direkte fat enkelt-molekyle lokalisering, er det af afgørende betydning at overveje tilfælde af en fast prøve, som giver en sikker løsning til en udtømmende lokalisering af en molekylær befolkning. I et sådant tilfælde er den brownske antagelse ikke længere gyldig. Udskiftning af det ved præcist at håndtere en nanoskopiske foranstaltning, kun begrænset af SNR, er afgørende for at nå det bedste nanometriske opløsning.
Langs en sådan udvikling, baseret på enten flerfarvet, 3D og / eller udtømmende foranstaltninger, der fremtidige arbejde forventes at give et samlet overblik over molekylære statiske og dynamiske data. Dette vil have en direkte relevning for cellebiologiske studier, såsom at tyde de subtile nærmere regulerer ekstra og intracellulær signalering.
Download MTT
Kildekoden til MTT er tilgængelig som open-source software til akademisk forskning. Det kan downloades fra vores hjemmeside, på ciml.univ-mrs.fr , ved at navigere til vores team side, han & Marguet Lab, som giver et link til software-beskrivelse og download. Bemærk, at vi beder dig om dit navn og institution kun til information, for eksempel i tilfælde af yderligere samarbejde eller til at informere dig om en ny udgivelse eller opdatering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker medlemmer af vores team, især MC Blache for teknisk bistand samt M Irla og B Imhof, for deres støtte og frugtbare diskussioner. Tal for deflation og indespærring gengives udlånt af Nature Methods. Dette projekt er støttet af institutionelle tilskud fra CNRS, INSERM og Marseille Universitet, og ved hjælp af specifikke tilskud fra regionen Provence-Alpes-Côte-d'Azur, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-PCVI- 0034-02, ANR 2010 BLAN 1214 01) & Fondation pour la Recherche Medicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR understøttes af et fællesskab fra Ligue Nationale Contre le Cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cos-7 cell line | ATCC | CRL-1651 | 5,000 cells/well |
| HBSS without Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | 1 ml |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 1 ml |
| 8-well Lab-tek | Nalge Nunc international | 155441 | 1 |
| QDot-605 streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | 20 mM |
| Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21) | |||
| Fab from mAb 108 | ATCC | HB-9764 | 200 μg |
| NHS-Biotin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21435 | 18.5 μg |
| Complete medium | |||
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 41965 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | 50 ml |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | 5 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 5 ml |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | 5 ml |
| Imaging medium | |||
| HBSS with Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | 25 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 250 μl |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000U | |
| Fluorescent lamp | Nikon Instruments | Intensilight C-HGFIE | |
| 1.3 NA 100x objective | Nikon Instruments | Plan Fluor 1.30 | |
| 1.49 NA 100x objective | Nikon Instruments | APO TIRF 1.49 | |
| Camera | Roper Scientific | Cascade 512 B | |
| Thermostated box | Life Imaging Services | The Box | |
| Appendix: example Script of MTT supplementary analysis | |||
| function MTT_example(file_name) %%% Basic examples showing how to recover MTT output results %%% to plot each trace and to build the histogram %%% of fluorescence intensities |
|||
| if nargin<1 % no file_name provided? files = dir('*.stk'); if isempty(files), disp('no data in current dir'), return, end file_name = files(1).name; % default: first stk file disp(['using' file_name 'by default']) end |
|||
| file_param = [file_name '_tab_param.dat']; % output file | |||
| %% Load data cd('output23') % or (‘output22'), according to version used % Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters, % an extra parameter, noise, was added in version 2.3 |
|||
| % To read all parameters at once, in a single table % tab_param = fread_all_param(file_param); % tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = ... |
|||
| % To read all parameters (except frame_number) in separate tables % [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param); |
|||
| tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded! tab_j= fread_data_spt(file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8); |
|||
| %% Loop over traces N_traces = size(tab_i,1); % Tables are N_traces lines by N_frames colums |
|||
| for itrc = 1:N_traces No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index)) xlabel('i (pixel)'), ylabel('j (pixel)') title(['trace # ' num2str(itrc)]) disp('Please strike any key for next trace'), pause end |
|||
| %% Fluo histogram N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins xlabel('intensity (a.u.)'), ylabel('occurrence') title('histogram of particles fluorescence intensity') |
|||
References
- Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).
- Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H.
- Lommerse, P. H. Single-molecule imaging of the H-ras membrane-anchor reveals domains in the cytoplasmic leaflet of the cell membrane. Biophys. J. 86, 609-616 (2004).
- Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order. EMBO. J. 25, 3446-3457 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 373-399 (1997).
- Dahan, M. Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
- Harms, G. S. Single-molecule imaging of l-type Ca(2+) channels in live cells. Biophys. J. 81, 2639-2646 (2001).
- Iino, R., Koyama, I., Kusumi, A. Single molecule imaging of green fluorescent proteins in living cells: E-cadherin forms oligomers on the free cell surface. Biophys. J. 80, 2667-2677 (2001).
- Sako, Y., Minoghchi, S., Yanagida, T. Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells. Nat. Cell Biol. 2, 168-172 (2000).
- Schutz, G. J., Kada, G., Pastushenko, V. P., Schindler, H. Properties of lipid microdomains in a muscle cell membrane visualized by single molecule microscopy. Embo. J. 19, 892-901 (2000).
- Seisenberger, G. Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus. Science. 294, 1929-1932 (2001).
- Jacobson, K., Sheets, E. D., Simson, R. Revisiting the fluid mosaic model of membranes. Science. 268, 1441-1442 (1995).
- Saffman, P. G., Delbruck, M.
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
- Papoulis, A. Probability, Random Variables and Stochastic Process 277. , McGraw Hill. (2001).
- Van Trees, H. L. Detection, Estimation, and Modulation Theory, Wiley Inter-Science. , (1968).
- Moerner, W. E. Single-molecule mountains yield nanoscale cell images. Nat. Methods. 3, 781-782 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).
- Betzig, E. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Manley, S. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).
- Andrew, S. M.
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19, 780-782 (1994).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24, 954-956 (1999).
- Meilhac, N., Guyader, L. L. e, Salome, L., Destainville, N. Detection of confinement and jumps in single-molecule membrane trajectories. Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft. Matter Phys. 73, 011915 (2006).
- Saxton, M. J.
- Serge, A., Fourgeaud, L., Hemar, A., Choquet, D. Receptor activation and homer differentially control the lateral mobility of metabotropic glutamate receptor 5 in the neuronal membrane. J. Neurosci. 22, 3910-3920 (2002).
- Simson, R., Sheets, E. D., Jacobson, K. Detection of temporary lateral confinement of membrane proteins using single-particle tracking analysis. Biophys. J. 69, 989-993 (1995).
- Jacobson, K., Dietrich, C.
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).
- Livneh, E. Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility. J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).
- Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and. 4, 435-446 (2005).
- Wu, X., Bruchez, M. P. Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates. Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).
- Mohammadi, M. Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase. Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).
- Howarth, M. Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells. Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).
- Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Sergé, A. Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface. Protocol Exchange. , (1038).
- Groc, L. Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).
- Cui, B. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- He, H. T., Marguet, D. Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).
- Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).
- Kao, H. P., Verkman, A. S. Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position. Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).
