Magnetic Resonance elastografi Metodik för utvärdering vävnadstekniska Construct tillväxt

Summary

Förfarandet visar metodiken för magnetisk resonans elastografi för övervakning av manipulerade resultatet av fett-och osteogena vävnadstekniska konstruktioner genom icke-invasiv lokal bedömning av de mekaniska egenskaper med hjälp av mikroskopiska magnetkamera elastografi (μMRE).

Abstract

Traditionella mekaniska tester resulterar ofta i förstörelsen av provet, och i fallet av långsiktiga vävnadstekniska uppföra studier är användningen av destruktiva bedömning inte acceptabelt. En föreslagen alternativ är användningen av ett bildgivande förfarande kallas magnetisk resonans elastografi. Elastografi är en icke-förstörande metod för att bestämma konstruerade resultatet genom att mäta lokala mekaniska fastighetsvärden (dvs. komplex skjuvmodul), vilka är viktiga markörer för att identifiera struktur och funktionalitet av en vävnad. Som en icke-invasiv medel för utvärdering, har övervakningen av tekniska konstruktioner med avbildningsmetoder såsom magnetisk resonanstomografi (MRT) ses allt större intresse under det senaste decenniet ^1. Till exempel har de magnetiska resonans (MR) tekniker för diffusion och relaxometry kunnat karakterisera de förändringar i kemiska och fysikaliska egenskaper under manipulerade vävnaden utveckling ^2. Den metod som föreslås iFöljande protokoll använder mikroskopisk resonans elastografi (μMRE) som en icke invasiv MR baserad teknik för att mäta de mekaniska egenskaperna hos små mjuka vävnader ^3. MRE uppnås genom koppling av en sonisk mekaniskt manövreringsorgan med vävnaden av intresse och registrering av den skjuvningsvåg förökning med en MR skanner ^4. Nyligen har μMRE använts i tissue engineering förvärva grundläggande tillväxt information som traditionellt mäts med hjälp av destruktiva mekaniska makroskopiska tekniker ^5. I det följande förfarandet är elastografi uppnås genom avbildning av konstruerade konstruktioner med en modifierad Hahn spinn-eko-sekvensen kopplad till en mekaniskt manövreringsorgan. Såsom visas i figur 1, synkroniserar den modifierade sekvensen bildförvärv med överföring av externa skjuvningsvågor, därefter är rörelsen sensibiliseras genom användning av oscillerande bipolära par. Efter samling bilder med positiva och negativa rörelser sensibiliseringning, komplex division av de data som producerar en skjuvningsvåg bild. Därefter bilden utvärderas med användning av en inversion algoritm för att generera en skjuvstyvhet karta ^6. De resulterande mätningar vid varje voxel har visats korrelera starkt (R ^2> 0,9914) med data som insamlas med användning av dynamisk mekanisk analys ^7. I denna studie är elastografi integreras i vävnaden utvecklingsprocessen för övervakning av mänskliga mesenkymala stamceller (h MSC) differentiering till adipogena och osteogen konstruktioner som visas i figur 2.

Protocol

1. Tissue Construct Preparation

Vävnaden bygger beredningsprocessen består av tre steg: expansion av cellpopulation, sådd av celler på ett biomaterial ställning och differentiering genom användning av kemiska signalmolekyler. Förfarandet för konstruktionen beredning bygger på metoder som utförs av Dennis et al. Hong et al. Och Marion och Mao ^8,9,10.

1. Efter odling och expansion av cellinjen, frö de humana mesenkymala stamceller (MSCs h) på en gelatinsvamp (4 mm diameter, 3,5 mm tjocklek) vid en densitet av 1x10 ⁶ celler / ml för ben-och 3x10 ^ ⁶ celler / ml för adipos-bildning.
2. För differentiering av h MSCs till adipös, applicera medierna adipösa induktion bestående av 1 | iM dexametason, 0,5 pM isobutyl-metylxantin, 10 | ig / ml humant rekombinant-insulin och 200 | iM indometacin i cellexpansion medietgång celler visas sammanhängande på schavotten. Efter tre dagar ersätta mediet med 10 | ig / ml humant rekombinant-insulin i expansion medier under 24 timmar därefter återgå till induktion medier. Upprepa cykeln tre gånger och sedan utbyta bara i underhåll media varannan dag.
3. Att inducera osteogenes, framställa osteogena induktion medier genom att en slutlig koncentration av 0,1 | iM dexametason, 50 pM av L-askorbinsyra-2phosphate och 10 mM β-glycerofosfat i cellexpansion mediet. Ersätt med färska osteogena media var två dagar.

2. Manövreringsorgan Karakterisering

Karakterisering av ställdonet är ett viktigt steg för MRE experimentet. MRE förlitar sig på spridning av mekaniska skjuvningsvågor att bedöma lokala värden av mekaniska egenskaper och därför är dessa mekaniska vibrationer måste alstras och kännetecknas i vävnaden av intresse med användning av en piezo-elektriska aktuatorn. En illustrerad EXAmple av den analys visas i Figur 3. Målet med detta förfarande är att optimera rörelse i ställdonets för att skapa ofarliga skjuvningsvågor med betydande amplituder (~ 250 mikron).

1. Före experimentet, applicera 0,5% agarosgel för att innesluta konstruktionen i en 10 mm provrör. Temperaturen för gelén bör vara ungefär 37 ° C för att minimera skada på konstruktionen.
2. Efter att ha låtit agarosgelen fem minuter för att ställa in vid rumstemperatur, in spetsen av den piezoelektriska motorn böjning in i ytan av gelén.
3. Fästa röret innehållande provet och manövreringsorganet till en styv bärare, och orientera strålen av laserdoppler Vibrometerprobe mot spetsen av den mekaniska ställdon. Justera placeringen av systemet för att optimera den reflekterade signalen, använda reflekterande tejp vid behov.
4. Baserat på den förväntade resonansfrekvensen hos den mekaniska manöverdonet, som funktionsgeneratorn att svepa desired frekvensområdet (dvs. 20 till 2000 Hz i detta experiment) med användning av en driftspänning av 20 Vpp med en vit brussignal.
5. Se kännetecknad spektrum på Polytec Vibrosoft programmet för att identifiera resonansfrekvensen hos det system och sätt för att FFT och hastighet som y-axeln.
6. För förskjutning mätning in ställdonet för att leverera en kontinuerlig sinussignal vid den angivna resonans frekvensen med en driftspänning på 200 Vpp, och notera den genererade förskjutningen levereras till ytan av gel. Inställd Vibrosoft att visa FFT med förskjutningen som y-axeln.

3. Bild Acquisition

1. Efter avslutad ställdon karakterisering, placera provet och ställdon i mitten av magnetkamera. För experiment vävnadskonstrukt, använda en liten och känsligare RF-spolen (dvs. 10 mm i detta experiment) för sändning och mottagning av RF-signalen. (Det som visas använder en 9,4 Tvertikala hål magnet försedd med tredubbla axel gradienter, 100 g / cm).
2. Skaffa en scout bild för identifiering av konstruktionen platsen.
3. Ställ in parametrar för förvärvet. En typisk in vitro-sagittala avsökning kommer att ha en repetitionstid av 1000 ms, ekot tid av 20-40 ms, skivtjocklek av 0,5-1,0 mm, och synfältet för 12x10 mm ² med en matris storlek av 128x128 bildpunkter.
4. För elastografi parametrar in ställdonet frekvensen till det värde som bestäms av Laser Doppler Vibrometerprobe karakterisering. I den aktuella studien, var en bipolär par behövs med en gradient amplitud av 50 g / cm. Andra parametrar för att justera omfattar den försening som ska vara inställd på noll millisekunder för det första förvärvet.
5. Ändra funktionen generatorn att brista och justera parametrarna för funktionen generatorn för att matcha dem i parametrarna elastografi förvärvet inklusive frekvensen och antalet cykler. Ställ också in FUNCning generator för att vara externt utlösas.
6. För en sagittal bild som rörelsen sensibilisering att vara i positiva slice riktning och starta skanningen. Efter förvärvet kontrollerar bilden och ändra sensibilisering mot den negativa slice riktning.
7. Kör MATLAB program som kommer att utföra komplicerade Avdelningen för generering av skjuvningsvåg bilden.
8. Bedöma bilden med avseende på närvaro av skjuvningsvågor och eventuella artefakter, såsom fas omslag.
9. Om inga justeringar av bilden är nödvändigt, justera storleken arrayen till åtta jämnt fördelade värden från noll sekunder till en full period av karakteriseras resonansfrekvensen.
10. Förvärva en avsökning i både de positiva och negativa skiva orienteringar.
11. När bilderna är förvärvad, använda en MATLAB program avsett för generering av skjuvningsvågen data från en uppsättning av bilder.

4. MRE Experiment Bildbehandling

1. The slutliga steget av MRE är att beräkna skjuvstyvhet från den skjuvningsvåg bilder. Placera data i MATLAB program som kommer att bedöma den tredimensionella dataset (2 spatial, 1 temporal).

Obs: Genom att anta en plan skjuvningsvåg de rörelseekvationerna frikoppla möjliggör beräkning av komplex-värderade skjuvmodul som en funktion av förskjutningen och Laplace. Algoritmen approximerar rumsliga andra derivata med ändlig skillnad och beräknar skjuvmodulen på en bildpunkt-för-pixelbas. Från denna komplexa talet, kan många mekaniska parametrar härledas såsom skjuvningsvåg hastighet, våg dämpning, skjuvstyvhet, skjuvelasticitet, skjuwiskositet, etc Algoritmen tillåter också urval av regioner av intresse för vilken medelvärdet och standardavvikelsen för varje parameter beräknas.

2. De imaging parametrar måste anges i början av programmet. Dessutom: ee övre gränsen för elastogram kan justeras för att förbättra kontrast i provet.

Obs: Programmet ger delresultat (våg efter lågpassfilter, våg efter riktade filtrering, temporal FFT, linje profiler etc.) som hjälper användaren uppskatta trofasthet i återhämtningen.

3. Vissa parametrar kan justeras baserat på denna information, såsom den grad av lågpass-filter, den temporala frekvensen för rörelse är riktningen för fortplantning av den våg etc. Standardavvikelsen för en parameter i en specifik region av intresse är också en indikator på kvaliteten av beräkningen.

5. Representativa resultat

Figur 4 noterar förändringen i mekaniska egenskaper under hela fyra veckor osteogen och adipogena konstruktion utveckling. MRE utfördes vid 730-820 Hz. Även om båda seedade svamparna började på ca 3 kPa, osteogenic riktade vävnader resulterade i en styvhet av 22 kPa, medan fett riktad vävnader minskade styvhet till 1 kPa. Vidare visade de osteogena konstruktionerna en noterbar minskning i storlek i jämförelse från början till slutet av studien. Ytterligare egenskaper härledda från elastografi studie visas i Tabell 1.

Figur 1. Bilden förvärvsprocessen för magnetisk resonans elastografi. Under bildinhämtning, styr en pulssekvens (a) synkronisering (b) från funktionsgeneratorn med bipolära pulser gradienter av magnetkameran. Efter förvärvet av bipolär gradienter växlas i positiva och negativa riktningar, (c) en skjuvningsvåg bild produceras med användning av komplex division.

Figur 2. Flödesdiagram av MRE förfarande för vävnad motornväderbitna konstruktioner. Första, celler (a) först odlas och expanderas till populationsstorlek väsentlig för utformad projektet. Därefter Cellerna sås (b) på ett biomaterial byggnadsställning och kemiska reagens används för att signalera differentiering. Ställningar kännetecknas med MRE, vars första steg (c) är bestämningen av resonansfrekvensen hos manövreringsorganet är kopplad till konstruktionen. Därefter MRI-bilder (d) förvärvas för att generera en skjuvningsvåg bild (e). Slutligen är en algoritm tillämpas för erhållande av en elastogram (f) som avbildas styvheten hos konstruktionen. Samtidigt konstruktioner är sektionerad för histologisk utvärdering (g) för att validera differentiering.

Figur 3. Actuator karakterisering förfarande. Gelatinet ställningen är omsluten av en 0,5% agarosgel. För att karakterisera den rörelse som överförs in i provet ett vitt brus sänds först in i systemet(1a) och den resulterande rörelse detekteras med användning av en Laser Doppler Vibrometerprobe (1b). När väl resonansfrekvensen bestäms, (2a) en kontinuerlig sinusvåg-signal vid resonans sänds för att bestämma förskjutningen (2b) som överförs till gelatinet miljön.

Figur 4. Konstruera utvecklingen karta över fyra veckor. Adipogena (A) och osteogen (O) konstruktioner visas från vänster till höger med motsvarande storlek och skjuv bilder våg, elastogram och genomsnittlig skjuvstyvhet. Den färgkarta för elastogram motsvarar med färgschema stapeldiagrammet och felstaplar representerar standardavvikelsen inom varje konstruktion har regionen av intresse.

Tabell 1. Mekaniska egenskaper hos fett-och osteo-konstruktioner under en fyra veckors period av tillväxt.

Discussion

Vid detta förfarande är förfarandet enligt MRE för vävnadsutvecklade konstruktioner demonstrerats från cellberedning till genereringen av en elastogram. Genom att tillämpa en icke-förstörande mekanisk bedömning metod till tissue engineering rörledningen är det nu möjligt att utvärdera förändringar i modifierade konstruktioner under flera stadier av utveckling. Dessutom kompletterar MRE andra MR-metoder för övervakning vävnadsteknisk konstruerar som diffusion, magnetisering överföring, och kemisk skift analys ^1.

När du utför MRE experiment bör några begränsningar noteras. Bedömningen av in vitro prover är en tid känsligt studie. Därför rekommenderas att studier bör pågå längre än en timme så att eventuella skador på vävnaden konstruktionen minimeras. Dessutom kan trogen återvinning av styvheten kartan äventyras på grund av konstruktioner är antingen för små eller hård ^6. Påe möjlig lösning på detta problem är att arbeta vid högre frekvenser (> 2,5 kHz), som våglängden är omvänt proportionell mot frekvensen. Piezoelektriska stack aktuatorer drivna av hög spänning förstärkare kan leverera tillräckligt med rörelse vid sådana frekvenser för att ge en fullständig skjuvning våglängd i provet. En annan möjlig ändring av protokollet är att använda snabbare sekvenser som snabbt spinn-eko och eko plan avbildning ^{11, 12.}

Utöver möjligheterna att MRE för vävnadstekniska konstruktioner in vitro, är nästa steg i pre-klinisk bedömning för att utvärdera utvecklingen av implanterade vävnader i ett levande system. Tillämpningen av MRE som mus studier skulle ge ytterligare en möjlighet för icke-förstörande utvärdera utvecklingen av vävnaden konstruktioner. Förlängning av elastografi för behandling av ben eller brosk defekter potentiellt skulle ge en bättre förståelse för hur man producerar mer varaktig funktionell implantat feller användning i regenerativ medicin. Magnetisk resonans elastografi har potential att spela en allt större roll i valideringen av tekniska konstruktioner både in vitro och in vivo.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
MSCGM-Bullet Kit	Reagent	Lonza Inc.	PT-3001	Store at 4°C
1X DPBS	Reagent	Invitrogen	21600-010
0.05% Trypsin-EDTA	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25300-054	Store at -20°C
Dexamethasone	Reagent	Sigma-Aldrich	D2915
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Reagent	Sigma-Aldrich	I5879	Store at -20°C
Insulin-bovine pancreas	Reagent	Sigma-Aldrich	I6634	Store at -20°C
Indomethacin	Reagent	Sigma-Aldrich	I7378
Β-Glycerophosphate	Reagent	Sigma-Aldrich	G9891
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Reagent	Sigma-Aldrich	A8960
Gelfoam	Scaffold	Pharmacia Corporation (Pfizer)	09-0315-08
Human mesenchymal stem cells	Cell Line	Lonza Inc.	PT-2501
9.4T MR Scanner	Equipment	Agilent Technologies		400MHz WB
10mm Litz Coil	Equipment	Doty Scientific
Laser Doppler Vibrometer	Equipment	Polytec	PDV-100
Vibrosoft (20)	Software	Polytec
Function generator	Equipment	Agilent Technologies	AFG 3022B
Amplifier	Equipment	Piezo Inc.	EPA-104-115
Piezo Bending motor	Equipment	Piezo Inc.	T234-A4Cl-203X
Computer-Linux	Equipment	Intel		Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G
Computer-Windows	Equipment	Intel		Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G
MATLAB	Software	Mathworks		2009b