Summary
Basit bir metodu ile ilişkili epitel hücreleri üzerindeki doku fibroblastlann etkileri analiz etmek için tarif edilmiştir. Bu yöntem, üç boyutlu bir doku kültürü kombinasyonu 3D izole sonra hücrelerin analizi kolaylaştırabilir. Tekniği tümör hücreleri üzerindeki tümör-stroma etkileri ile ilişkili sistematik çalışma izin veren, habis potansiyeli değişen hücreleri için de geçerlidir.
Abstract
Muazzam çabaları kolay hücre manipülasyonu için izin klasik iki boyutlu hücre kültür modelleri kullanılarak çok bu işin yapılmıştır normal ve malign hücre davranışları 1-2, yer sinyal yolları ve moleküller girmiş iken. Bu hücre içi sinyal yollarının boyutluluğu ve 3-4 hücre yüzey gerilimi gibi ekstraselüler güçleri tarafından etkilendiğini açıkça ortaya çıktı. Çoklu yaklaşımlar daha doğru biyolojik mimari doku 3 temsil ettiği üç boyutlu modeller geliştirmek için alınmıştır. Bu modeller çok boyutluluğu ve mimari gerilmeler dahil ederken, hücrelere sonuç etkileri çalışma modellerinin sınırlamaları ve sonraki analiz için hücre ayıklanması zorluk nedeniyle iki boyutlu doku kültürü daha az becerikli olduğunu.
Tümörogenez ve tümör davranış tümörlerin yaklaşık mikroçevresinin önemli rol ilar giderek 4 tanınmış oldu. Tümör stromanın birden fazla hücre türleri ve hücre dışı moleküller oluşur. Tümör gelişimi sırasında tümör hücreleri ve stromal hücreleri 5 arasında çift yönlü sinyaller vardır. Tümör stromanın co-evrimi katılan bazı faktörler tespit edilmiş olmasına rağmen, sistematik olarak belirlemek ve bu sinyalleri 6 tam diziyi incelemek için basit bir teknik geliştirmek için hala gereksinim vardır. Fibroblastlar normal veya tümörle ilgili stromal dokularda en bol hücre tipi olup, birikimi ve bazal membran ve parakrin büyüme faktörleri 7 bakım katkıda bulunmaktadır.
Birçok grup tümör tedavilere yanıt, bağışıklık hücrelerinin işe alma, sinyal molekülleri, proliferasyon, apoptoz, anjiyogenez ve işgali 8-15 gibi çeşitli hücresel fonksiyonları üzerinde fibroblast rolünü incelemek için üç boyutlu kültür sistemleri kullanılmıştır. Biz eşek için basit bir yöntem optimizekarışık hücre popülasyonlarının (co-kültür) 16-22 üç boyutlu kültür oluşturmak için piyasada bulunan hücre dışı matriks modeli kullanılarak meme epitel hücreleri üzerinde meme fibroblastların etkileri Essing. Devam ko-kültür ile hücrelerin iç fibroblastlar kümeleme ve büyük ölçüde parçacıklarının dış ve matriks içine çok hücreli çıkıntılar oluşturan epitel hücreleri ile sferoidler oluştururlar. Değişmiş epitel hücre invaziv yol açar fibroblastların Manipülasyon kolayca numaraları ve epitel projeksiyonları 23 uzunluğu değişiklikler ile belirlenebilir. Dahası, epitel davranışı üzerindeki fibroblast maruz etkileri analizi kolaylaştırır, üç boyutlu bir ko-kültür epitelyal hücreleri izole etmek için bir yöntem geliştirmişlerdir. Biz ortak kültürün etkileri birden fazla testleri gerçekleştirmek için yeterli zaman tanıyarak, epitel hücre izolasyonu haftalar sonra devam bulduk. Bu metod ile hücrelerin uyarlanabilirmalign potansiyeli değişen ve hiçbir özel ekipman gerektirir. Bu teknik birden koşullar altında in vitro hücre modellerinde hızlı değerlendirme için izin verir, ve karşılık gelen sonuçları in vivo hayvan doku modelleri yanı sıra, insan doku örneklerine göre olabilir.
Protocol
1. Üç boyutlu Co-kültür oluşturulması
- Co-kültürler kuran bir gün önce, bir gecede 4 ° C'de buzdolabında buz üzerinde dondurucu ve çözülme gelen Matrigel çıkarın.
- % 10 bovin serumu, 5 ug / mL insülin ile DME/F12 orta: deney gününde, kullanılmak üzere epitelyal hücreleri için orta (bu örnekte HMEC orta karşılık gelen ortak kültürü için orta hazırlanması , 1 ug / mL hidrokortizon ve 1 ng / mL EGF). Önceden Matrigel ile karıştırılarak buz en az 1 saat orta tutun.
- Çözülmüş Matrigel sulandırmak için, Matrigel toplam istenilen miktar belirlemek: orta (300 uL başına da 24-iyi plakalar için) ve buz üzerinde steril bir tüpe buz HMEC orta yarısı bu birimde ekleyin. Daha sonra bir 1:1 seyreltme elde etmek için tüpüne çözülmüş Matrigel aynı yarı-toplam hacim ekleyin. Buz tüpü tutun.
- Yeri 50 Matrigel arasında uL: 24-kuyulu plakanın belirlenmiş kuyuların orta-iyi orta karışımı venemli hava ve% 5 CO2 içeren bir 37 ° C inkübatöründe 10 dakika süreyle inkübe edilir.
- Kuyuları, orta ve başka bir karışımı 60 dakika süreyle inkübe edilir: Matrigel ilave bir 450 uL ekleyin.
- Kuluçka sırasında, 0.5 x 10 arasında derişimde fibroblast (burada GFP ifade s-tert-ölümsüzleştirilmiş İndirgeme Meme fibroblastlar) ve epitel hücreleri (burada RFP ifade s-tert-ölümsüzleştirilmiş insan meme epitel hücre çizgisi) 1:1 lik bir süspansiyon hazırlamak 5 hücreleri HMEC orta 0.5 ml her.
- 60 dakikalık inkübasyon adım sonra, yavaşça katılaşmış jel üstüne hücre süspansiyonu bırakın ve inkübatör kültür dönün.
- 2 gün boyunca kültürlerin rahatsız etmeyin. Bundan sonra, orta nazikçe iyi ve yavaşça taze HMEC orta yerine bir taraftan orta aspire edilerek 2-3 gün her değiştirilebilir.
- Mikroskobu altında günlük sfero oluşumu izleyin. Kültürler 10-14 gün sonra genellikle olgun. Görüntü olarakışık veya floresan mikroskobu kullanarak uygun. Sfero boyutunu ve projeksiyon uzunluk ışık mikroskobu ile ölçülebilir.
2. Co-kültürler Sfero gelen Hücre İzolasyonu
- Steril 2 ml'lik cam pipet ile çok nazikçe, kültürünü Pipeti ve aşağı 10x. Alternatif olarak, kültür Pipeti için% 70 etanol içinde otoklav veya daldırma ile steril makas kullanırken, 1000 mikrolitre plastik pipet ucunu kesti. Cam pipet veya steril bir 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne kesme plastik pipet ucu ve oda sıcaklığında 2000 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüj ile ya kültürü transfer edin. Hücresel sferoidler tortu altında olacak.
- Yavaşça, santrifüj tüpünün üst kesintiye Matrigel kaldırmak için steril bir Pastör pipet kullanın.
- Pelet sferoidler 1 ml HMEC orta ekle, yukarı ve aşağı pipetleme 2-3 kez steril 2 ml'lik cam pipet ile, ve 24-iyi bir kuyuya kültürü aktarmakdoku kültürü plakası.
- Sferoidler orta değişen önce en az 48 saat çanak eklemek için izin ver. Zamanla hücreler küresel yapılar terk edecek ve mono tabakaları gibi büyür.
- Hücrelerinin% 50 izdiham ulaşmak Pasajı hücre kültürleri. İlk 100 mm çanak (yaklaşık 3-5 gün) sonra bir 35 mm çanak (yaklaşık 2-4 gün) kültür genişletin ve. Her geçiş adımı hemen önce, elle mümkün olduğunca çok sayıda kalıntı "hayalet sferoidler" olarak kaldırmak için steril bir Pastör pipet kullanın.
- Floresans hücre sıralama gerekirse, uygun hücre yüzey belirteçleri ve daha fazla ayrı ayrı hücre popülasyonu kullanarak nüfus saflık için akım sitometri ile hücrelerin analiz edin. Istediğiniz gibi izole hücreler daha fazla analiz için şimdi hazır.
3. Temsilcisi Sonuçlar
Co-kültürler üç boyutlu sfero olarak, mühendislik Tiam1 susturulması ile fibroblastlar ma içine arttı işgali nedenmeme epitel hücreleri tarafından trix (Şekil 1, D karşılaştırmak, E, A, F, B, C). Ile fibroblast Tiam1 aşırı ekspresyonu meme kanseri hücre hattı SUM159 (Şekil 1, G, H, I J, K, L karşılaştırın) azalarak matris işgaline neden mühendislik.
Şekil 2 de gösterildiği gibi bir kez co-kültüre sferoidler kurulmuş, hücresi grupları, iki boyutlu bir bağlamda yeniden kaplanması ile sferoidler izole edilebilir. Test edilen hücrelerin nispi büyüme oranları bağlı olarak, saf popülasyonlarının seri kanalı yoluyla ortaya çıkabilir (Şekil 3 içinde gösterildiği gibi) veya uygun bir hücre belirteçler kullanılarak sıralanabilir. Ko-kültür 3D izolasyon sonra, epitel hücreleri analiz için yeterli fırsat sağlayan, uzun süre üzerinde fibroblastlar ile ko-kültür öngördüğü özelliklerini korurlar. Bu örnekte, Tiam1 eksikliği fibroblastlar maruz hafta süreyle devam co-kültürlü HMECs artan göç indüklenen bir3D ko-kültür arası fter izolasyonu (Şekil 4).
Şekil 1. Işık ve floresan mikroskobu altında ortak kültürlerin kurulan sfero Görüntüleme. Sfero kültürleri meme epitel ve fibroblast hücre hatları ile kurulan ve 10-14 gün boyunca kültür büyümeye izin verilir. AF: epitel = HMEC-mCherry hücreler. GL: epitel hücreleri = SUM159-mCherry hücreler. AC, GI: fibroblast = kontrolü RMF-GFP hücreler. DF: fibroblast = RMF-GFP Tiam1 susturulması ile. JL: fibroblast = RMF-GFP Tiam1 fazla ifade ile. Oklar matris içine işgalci epitel projeksiyonları göstermektedir.
Şekil 2. Matrigel kültürden izolasyonu sonra ışık ve floresan mikroskobu altında kültürlerin Seri görüntüleme. Gün 0 hemen sonra izole görüntüleme temsil eder; günde 1, 2 ve5 izolasyon gün sonra göstermektedir. Zamanla sfero artar bırakarak hücrelerin korona. Sonunda çok az sayıda hücre ile bir "hayalet" sfero (ok) kalır. Çok az sferoidler hayalet kaldırılması ve ilk geçişini sonra kalır.
Matrigel co-kültürden sonra izole hücrelerin Şekil 3. Akış sitometrisi analizi. Co-kültürler steoid olgunlaşmış sonra, hücreler pipetleme ile eş-kültürü 3D ve pasajlanmasını seri izole edilir. Örnek alikotları akım sitometri ile analiz edilir (tanımlamak için yeşil floresan ve kırmızı floresan kullanarak bu örnekte GFP-ifade sırasıyla fibroblast ve mCherry-salgılayan epitel hücreleri) epitel ve fibroblast hücrelerin göreceli nüfusu belirlemek için.
Şekil 4. HMECs arasında Transwell göç isolati sonra devamMatrigel ko-kültür itibaren. Saf popülasyonlarının kültür veya floresans hücre ayırma ile elde edilmiş bir kez istenildiği gibi, hücreler analiz edilebilir. İşte HMECs ya kontrol (C) veya delikli transwells arasında Tiam1 eksikliği (SHT) fibroblastlar ile ortak kültür göçü ko-kültür izolasyonu sonrası 2, 4 ve 8. haftalarda değerlendirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada anlatılan yöntem tümör hücreleri dahil olmak üzere, epitel hücreler, üzerine stromal fibroblastlann etkileri analiz için basit bir yaklaşım temsil eder. Daha fazla analiz için matristen hücrelerin kolaylıkla ekstraksiyon sağlarken Bu, hücre dışı bazal membran matris tarafından desteklenen bir üç-boyutlu bağlamında doğrudan hücre-hücre etkileşim için olanak sağlar. Bu fibroblast hatları tercih ve epiteliyal hatları Şekil 1 'de gösterildiği gibi, invaziv potansiyeli değişebilir ve sinyal yollarının etkilemek için manipüle edilebilir olarak, tümör-stroma ilişkili çalışma için uygulanabilir. 3D co-kültürü modeli hücre invaziv değişikliklere neden olduğu edilmiş olduğu görsel doğrulanması için olanak sağlar. Izolasyon protokolü işleme minimum 3D kültürlerden hücre çıkarılması için izin verir ve hücre özelliklerini etkileyebilecek tripsin veya matris-eritme maddeleri kullanımını önler. Ko-kültür 3D fibroblast maruz kalmanın etkileri arka epitel hücreleri içinde persistansonraki analiz (Şekil 4) kolaylaştırarak 3D ortak kültürden er izolasyon,. Burada gösterilen örnekte hücre göçü üzerine etkilerini tasvir ederken, 2D büyüyen hücreler için geçerli bir metot izole hücreler üzerinde kullanılabilir. Biz ilişkili meme epitel hücrelerinin davranışları üzerinde fibroblast Tiam1 ifade değişen etkilerini analiz etmek için bu yöntemi kullandık. Fibroblastlarda Tiam1 eksikliği 3D kültür ve hayvan tümör modellerinde 23 meme tümör hücre invazyonu ve metastaz teşvik etmektedir. Bu yöntem bize, moleküler, biyokimyasal ve fonksiyonel testler (Liu ve Buchsbaum, baskıda) ile potansiyel alan yollar analiz etmesini sağladı.
Mükemmel Sağlık sadece hücre hatları kullanmak ve işlem sırasında kültürleri kirlenmesini önlemek amacıyla titiz steril tekniğe bağlı kalınması önemlidir. En iyi sonuçlar erken hücreleri yerine geç pasajlar kullanılarak elde edilmiştir (hassas bir kanal adedi Belir bağlı olarak değişecektiric hücre hattı) ve hücrelerin% 50-80 arasında izdiham yoğunlukları hasat. Protokolüne göre Matrigel hassas işleme co-kültürler oluşturulması öncesinde her iki tam sıvılaşma kolaylaştırmak ve hücrelerin eklenmesinden önce matrisin ayrıntılı katılaşma sağlamak için bir anahtardır. Matris yetersiz miktarda veya daha çok katılaşma kültürlerinde sferoidler göre bir tek tabakalı şekilde büyüyen hücreler ile sonuçlanacaktır. İlk co-kültürler steoid oluşturulurken, hem de bir ilk 50 ul tıkacın yerleştirilmesi eşit olarak dağıtılmış steoid oluşumu için anahtar bir nihai matris, bir demirleme katı ve daha muntazam katılaşması için olanak sağlar. Otomatik hücre ayırma karışık popülasyonları ayırmak için kullanılacak olursa post-izolasyonu pasaj adımları tüm ghost sferoidler çıkarılması kritik önem taşır. Burada gösterilen örnek yaklaşık 10 mg / ml 'lik protein bileşimi ile fenol kırmızısı serbest Matrigel kullanabilir. Fenol-kırmızı ücretsiz hazırlık assa renk algılama sağlargibi floresan gibi ys.
Bu tekniğe bağlı epitel hücre tümörleri veya tersine ilişkili fibroblastlan üzerinde tümör hücreleri üzerindeki etkileri stromal fibroblastlann etkilerini çalışmak için hücre tipleri aralığında uygulanabilir. Bu teknik birden koşullar altında in vitro hücre modellerinde hızlı değerlendirme için izin verir, ve karşılık gelen sonuçları daha sonra in vivo hayvan doku modelleri yanı sıra, insan doku örneklerine göre olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 356237 | Phenol-red free |
| Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | |
| Hyclone Bovine Calf Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3007303 | |
| Insulin | EMD Millipore | 407709 | Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin. Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).
- Li, H., Fan, X., Houghton, J. Tumor microenvironment: the role of the tumor stroma in cancer. J. Cell Biochem. 101, 805-815 (2007).
- Tse, J. C., Kalluri, R. Mechanisms of metastasis: epithelial-to-mesenchymal transition and contribution of tumor microenvironment. J. Cell Biochem. 101, 816-829 (2007).
- Bhowmick, N. A. TGF-beta signaling in fibroblasts modulates the oncogenic potential of adjacent epithelia. Science. 303, 848-851 (2004).
- Bhowmick, N. A., Moses, H. L.
- Havlickova, B., Biro, T., Mescalchin, A., Arenberger, P., Paus, R. Towards optimization of an organotypic assay system that imitates human hair follicle-like epithelial-mesenchymal interactions. Br. J. Dermatol. 151, 753-765 (2004).
- Kilani, R. T. Selective cytotoxicity of gemcitabine in bladder cancer cell lines. Anticancer Drugs. 13, 557-566 (2002).
- Seidl, P., Huettinger, R., Knuechel, R., Kunz-Schughart, L. A. Three-dimensional fibroblast-tumor cell interaction causes downregulation of RACK1 mRNA expression in breast cancer cells in vitro. Int. J. Cancer. 102, 129-136 (2002).
- Silzle, T. Tumor-associated fibroblasts recruit blood monocytes into tumor tissue. Eur. J. Immunol. 33, 1311-1320 (2003).
- Bartling, B., Demling, N., Silber, R. E., Simm, A. Proliferative stimulus of lung fibroblasts on lung cancer cells is impaired by the receptor for advanced glycation end-products. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 34, 83-91 (2006).
- Kunz-Schughart, L. A. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290, C1385-C1398 (2006).
- Liu, T., Lin, B., Qin, J. Carcinoma-associated fibroblasts promoted tumor spheroid invasion on a microfluidic 3D co-culture device. Lab Chip. 10, 1671-1677 (2010).
- Zengel, P. Multimodal therapy for synergic inhibition of tumour cell invasion and tumour-induced angiogenesis. BMC Cancer. 10, 92-92 (2010).
- Kunz-Schughart, L. A., Heyder, P., Schroeder, J., Knuechel, R. A heterologous 3-D coculture model of breast tumor cells and fibroblasts to study tumor-associated fibroblast differentiation. Exp. Cell Res. 266, 74-86 (2001).
- Djordjevic, B., Lange, C. S. Cell-cell interactions in spheroids maintained in suspension. Acta Oncol. 45, 412-420 (2006).
- Hirschhaeuser, F. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
- Hoevel, T., Macek, R., Swisshelm, K., Kubbies, M. Reexpression of the TJ protein CLDN1 induces apoptosis in breast tumor spheroids. Int. J. Cancer. 108, 374-383 (2004).
- Paduch, R., Kandefer-Szerszen, M. Vitamin D, tamoxifen and beta-estradiol modulate breast cancer cell growth and interleukin-6 and metalloproteinase-2 production in three-dimensional co-cultures of tumor cell spheroids with endothelium. Cell. Biol. Toxicol. 21, 247-256 (2005).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol. Med. 140, 141-151 (2007).
- Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720-e2720 (2011).
- Xu, K. The role of fibroblast Tiam1 in tumor cell invasion and metastasis. Oncogene. 29, 6533-6542 (2010).
