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Bioengineering

のためのシンプルなマイクロ流体デバイス Published: September 30, 2012 doi: 10.3791/3780
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Neurobiology, NCBS-TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR

Summary

シンプルなマイクロ流体デバイスは、麻酔薬を無料で行うために開発されました

Abstract

マイクロ流体デバイスを作製は、小さな生物に関するin vivo研究のためのアクセス可能な微小環境を提供します。シンプルな製造プロセスは1-3ソフトリソグラフィ技術を用いて、マイクロ流体デバイスのために用意されています。マイクロ流体デバイスは、 生体内レーザー顕微2,6と細胞イメージング4,7 のサブ細胞イメージング4,5、のために使用されている。in vivoイメージング生物の固定化を必要とします。これは、吸引5,8を使用して達成されている、先細チャネル6,7,9、変形可能な膜2-4,10、追加の冷却5、麻酔ガス11、温度感受性ゲル12、シアノアクリレート接着剤13や14のような麻酔レバミゾールと吸引、15。一般的に使用される麻酔薬は、シナプス伝達16,17に影響を与え、細胞内神経輸送4に有害な影響を有することが知られている。本STにおけるudy我々はそのような線虫Caenorhabditis elegans（線虫C. elegans）、ショウジョウバエの幼虫とゼブラフィッシュの幼虫のようにそのまま遺伝的モデル生物の麻酔フリー固定化を可能にするポリジメチルシロキサン（PDMS）装置による膜を実証している。これらのモデル生物は、それらの小さい直径および光学的に透明または半透明の体のマイクロ流体デバイスを用いたin vivo研究では適しています。本体の直径はCの初期の幼虫のために約10μmから約800μmの範囲虫やゼブラフィッシュ幼生と高解像度タイムラプスイメージングのための完全な固定化を達成するために、異なるサイズのマイクロ流体デバイスを必要とします。これらの生物は、液体カラムを通して圧縮窒素ガスによる圧力を用いて固定し、倒立顕微鏡を用いて結像​​される。トラップから解放動物が10分以内に通常の歩行に戻ります。

我々は、Cのタイムラプスイメージングの4つのアプリケーションを実証エレガンスすなわち、神経細胞におけるイメージングミトコンドリア輸送、輸送欠損変異株、グルタミン酸受容体輸送とQ神経芽細胞の細胞分裂における前シナプス小胞輸送。映画などから得られたデータは、マイクロ流体固定化は麻酔動物（ 図1Jと3C-F 4）と比較した場合、携帯電話とサブ細胞事象のin vivoデータ取得の有用かつ正確な手段であることを示している。

デバイスの寸法は Cの様々な段階のタイムラプスイメージングを可能にするように変更されました線虫 、 ショウジョウバエの初齢幼虫とゼブラフィッシュの幼虫。感覚神経細胞にGFP（syt.eGFP）でタグシナプトタグミンでマーク小胞の輸送はそのまま初齢ショウジョウバエの幼虫のコリン作動性感覚神経細胞で発現シナプス小胞マーカーの指示の動きを示しています。似たようなデバイスが〜30時間後に受精（HPF）でハートビートのタイムラプスイメージングを行うために使用されています幼虫をゼブラフィッシュ。これらのデータは、我々が開発したシンプルなデバイスが生体内でいくつかの細胞生物学的および発達現象を研究するためのモデルシステムの様々に応用できることを示す。

Protocol

1。 SU8マスター作製

  1. Clewinソフトウェアを使用して、マイクロ流体構造を設計し、回路基板フィルム上に8μmの最小特徴サイズで65024 dpiのレーザープロッターを使用してそれを印刷してください。
  2. 1分間、20％KOH中で自然酸化で2センチ×2cmのシリコンウエハをきれいにし、脱イオン水ですすぎ、流れの層とそれに対応する制御層用ウェーハ各1。
  3. 窒素ガスでピースを乾燥させ、4時間120℃のホットプレート上で脱水吹く。作品は次のステップに進む前に室温まで冷却することができます。
  4. 場所シリコン片スピナーチャック上を1つずつ真空の電源をオンにします。 〜20μlのヘキサメチルジシラザン（HMDS）とコート入れ、5 500rpmでSPIN150スピンナーを用い有するシリコン表面を覆う秒30秒間3000rpmで続く。
  5. SU8-2025（の〜1.5mlで完全にシリコンウエハをカバーします。http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm）と5秒間500rpmでSPIN150スピンナーを用いて塗布ウェーハは30秒間2,000 rpmで続く。この紡績プロトコルは、Cの初期の幼生期の制御とフロー層に適しています〜40μmのレジスト膜厚を生成エレガンス 。
  6. スピン5〜500rpmでSPIN150スピンナーを用いて1.5ミリリットルSU8-2050秒での後期幼虫用の流層の製造に適しています〜80μmのレジスト膜厚を得るために30秒間2,000 rpmで続く虫 、 ショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生およびそれらに対応する制御層のための基底流量層。
  7. 上にSU8被覆層とのホットプレート上でシリコン片を置きます。ソフトベーク65で被覆されたシリコン片℃で10分間、95℃、続いて1分間。作品は次のステップに進む前に室温まで冷却することができます。
  8. SU8-2025コーティングされたシュールで露光ステージ上のソフトで焼いたシリコン片を置きUVランプが直面している一番上の顔。 Cの初期の幼虫のためにそれぞれフロー層と制御層パターンの設計I（L1、 図1B）とデザインⅡ（L2は、 図1B）と、フォトマスクを使用エレガンス 。 SU8層の上にフォトマスクを置き、マスクが被覆層に対して平らであることを確認します。 UVランプのシャッターを開けて、15秒間、フォトマスクを介して200ワットのUVランプにソフト焼きSU8ウェハを公開します。
  9. Cの後期幼生期のための流層と制御層を作製する（ステップ1.6で調製した）SU8-2050コーティングされた部分で設計I（L1、 図1B）とデザインⅡ（L2は、 図1B）と、フォトマスクを使用エレガンス 。 SU8-2050（準備された私でコーティングされたウェーハ上ショウジョウバエ /ゼブラフィッシュの幼虫のためにそれぞれ基底流層と制御層の設計I（L1、 図1C）とデザインⅡ（L2は、 図1C）でフォトマスクを使用して、nステップ1.6）。 15秒200ワットのUVランプにフォトマスクを介してSU8表面を露出。
  10. 上に被覆層を備えたホットプレート上に露出したシリコン片を置きます。 10分間95℃に続いて1分間、65℃でウェハを焼く投稿してください。作品は次のステップに進む前に冷却することができます。
  11. 20分間SU8現像液を使用した作品を開発しています。 iso-プロピルアルコール（IPA）のピースを洗浄し、乾燥した使用して窒素ガスを吹き付ける。
  12. 上にSU8パターンでデシケーター中でシリコン片を置きます。 tricholoro50μlの（1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル）シラン2時間デシケーター中で蒸気でコート部分を。

注意事項：KOH処理、レジスト塗布現像中に化学処理のための安全対策を講じて下さい。シラン蒸気コーティングは、換気の良い場所にデシケーター内で行われるべきである。 SU8は、光への暴露の上からレジストを保護します。紫外線LIGと保護メガネを使用して、htのソース。

2。 PDMSモールドの作製

  1. プラスチックカップの硬化剤5gでシルガード184ベースの50グラムを組み合わせることにより、10時01 PDMSを準備します。 〜3分間手動でコンテンツを混ぜる。ドガ、混合中に形成された全ての気泡を除去するためにデシケーター内部の混合物。
  2. 気泡の形成を回避するために優しく、制御層のために、設計IIのSU8パターンをシリコンウェハ上に厚さ5mmのPDMS混合物を注ぐ。場合には気泡がすべての気泡を除去するために、低真空でSU8パターン上に、ドガPDMSを注ぐ中に形成される。
  3. 私はスピナーチャック上に、フロー層のために、デザインのSU8-2025パターンでシリコンウェーハを置き、それらを保持するために真空をオンにします。 〜1 PDMSミックスのmlおよびコート5 500rpmでSPIN150スピンナーを用いてウエハをウエハをカバー秒30秒を1,500 rpmに続く。
  4. コート〜の設計I（L1、 図1B）の80μmのSU8-2050パターン付きシリコンウエハ上の1ミリリットルのPDMSミックスCの後期幼生期のためのフロー層5秒間500rpmでSPIN150スピンナーを用いelegansは 30秒間1,000 rpmで続く。コート35秒500rpmでSPIN150スピンナーを用いてショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生に対するフロー層設計I（L1、 図1C）のSU8-2050パターン付きシリコン片、上のPDMSミックスの厚い層。
  5. デザインのオーブンで焼くPDMSコーティングされたシリコン片IおよびCに対してPDMSを含む制御層に対応する設計IIとウェハ50℃の熱風対流式オーブンでエレガンス 、そして/またはショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生℃で6時間インキュベートする。
  6. CのSU8パターンIIを含むシリコン基板からのPDMS部分をカット鋭い刃を使用して線虫および/ ​​またはショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生。ハリスのパンチャーを使ってPDMSモールドのメイントラップを接続する貯水池の上に約1mm径の小さな穴を開ける。
  7. パンチPDMSブロックを（制御用厚さ40μmの金型を含む置き上向きに制御層の成形面をプラスチックトレイの上に層L2）。 PDMSの塗布面を上向きにして、同じトレイに厚さ40μmSU8デザイン私を含むPDMSコーティングされたシリコンウエハを配置します。プラズマクリーナーのチャンバ内のトレイを挿入し、2分間、真空をオンにします。その後、プラズマ電源をオンにし、チャンバの色は薄いピンクを回すまでチャンバ圧力を下げる。 2分間の低真空下で18ワット空気プラズマに両面を公開します。
  8. Cの後期幼生期のために厚さ80μmSU8マスター含むパターンIIから削除パンチPDMSブロックを配置上向きに制御層の成形面をプラスチックトレイに虫やショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生。後でCの厚さ80μmデザインIを含有するシリコンウェーハ上に塗布し、対応焼きPDMS層のスピンを置く虫のステージやフラットPDMSコーティングされたのと同じトレイに同時にショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生urfaceは上向き。空気プラズマにさらさ上記の同じプロトコルを使用します。
  9. Cの2つのプラズマ処理された表面を置き虫および/ ​​またはショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生一緒に穏やかな圧力で、50℃の熱風対流式オーブンで焼く℃で2時間インキュベートする。
  10. CのSU8設計Iとシリコン基板から保税デバイスを切り取る虫および/ ​​またはショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生。パンチアクセス流路の入口と出口貯水池の穴。
  11. C用のプラスチックトレイに結合PDMSモールドを配置上向きに流動層設計の成形側とエレガンス 。きれいなガラスカバースリップ（22×22ミリメートル、厚さ1号）と同じプラスチック製のトレイの上に置きます。 PDMSモールドとプラズマチャンバー内のガラスカバースリップを含むトレイを挿入します。底装置のPDMS表面と2分間、低圧で18ワットの空気プラズマにガラスカバースリップを公開します。 Genでは2プラズマ処理された表面を置きTLE圧力、2時間50℃でそれらの熱風対流式オーブンで焼く。
  12. 将来の使用のためのクリーンな環境に保管してください。

3。 ショウジョウバエ /ゼブラデバイスの追加手順

  1. サイズの清浄なガラス表面X 2センチメートルtricholoroの50μl（1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル）シラン2時間デシケーター中で蒸気と2cmを公開します。
  2. スピン〜35秒500rpmでSPIN150スピンナーを用いてシラン化ガラス表面にステップ2.1で調製した10時01分のPDMSミックスの1ミリリットル。上向きにコーティングされた表面と6時間50℃の熱風オーブンでPDMSコーティングされたガラス基板を焼く。 PDMS層は、次の手順に進む前に室温まで冷却することができます。
  3. パンチのPDMSスペーサ層を形成するために、PDMSの中央にカスタム構築された鋭利な金属のパンチャーを使って被覆層。金属のパンチャーの形状は、 ショウジョウバエ /ゼブラフィッシュのためのフロー設計（L1、 図1Cと同様に設計されている
  4. PDMSのスペーサ層と低真空でプラズマクリーナーを使用して単一の結合ブロック（ ショウジョウバエ /ゼブラフィッシュの幼虫のためのステップ2.9で行われたフロー層と制御層）、18ワット空気プラズマにさらす。一緒に2つのプラズマ処理された表面に置き、50℃の熱風オーブンで焼く℃で2時間インキュベートする。
  5. ガラス、入口と出口の貯水池にパンチアクセスホールとステップ2.11で述べたように、プラズマクリーナーを使用してガラスカバースリップ（22×22ミリメートル、厚さ1号）に結合してから結合されたデバイスをカット。これは、〜500μmの流路高さと初齢ショウジョウバエの幼虫のための固定化装置を生産するでしょう。ゼブラフィッシュ幼生については、追加のボンディング工程とPDMSのスペーサ層製造プロセスを複製します。 PDMS-Sのデュアル層は30 HFPゼブラフィッシュの幼虫は900μmの流路高さを生成します。

注意事項：デバイス製造時にほこりを避けてください。 2つのプラズマ洗浄された表面sは完全に適切なボンディングのための無料の塵にする必要があります。特別なクリーンルームは、デバイス中のほこりの蓄積を最小限にするために利用できない状況で、デシケーター中でデバイスに保管してください。

4。 PDMS膜を用いた

  1. 18ゲージ針（外径〜1.25ミリメートル）を介して加圧された窒素ガス供給レギュレータとメイントラップ溜め、もう一方の端にマイクロフレックスチューブ（内径〜1.6ミリメートル、外径〜4.8ミリメートル）の一方の端を接続しますテレビ画面に釘付けになっている。チューブ接続の中間で使用3方活栓は、メンブレン上のアプリケーションまたは圧力の放出を可能にする。
  2. Cの主なトラップのリザーバーに接続する前に、蒸留水の10cmカラムとPDMS装置に接続されたチューブを埋める虫および/ ​​またはショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生デバイス。
  3. 14 psiを読んで、目に向かって偏向メイントラップの膜を監視するために窒素供給のバルブを回し倒立顕微鏡の低倍率で電子流路。マイクロフレックスチューブ内水柱の長さは3方活栓がオープンされている圧縮されています。偏向膜のエッジは透過光（ 図1Iと1J）に表示されます。膜のたわみは、PDMS膜下ダスト粒子/気泡の変位を引き起こし、チャネルの境界にプッシュします。
  4. 液体前面が閉じ込められた空気なしで完全にマイクロチャネルをいっぱいまで待ちます。
  5. その静止位置に膜を緩和する3方活栓を用いて圧力を解放します。

5。 Cを挿入線虫 、 ショウジョウバエ 、ゼブラフィッシュデバイスに幼虫と柔軟性PDMS膜の下でそれらを固定化

  1. 1 LにH 2 O M9バッファ[3グラムのKH 2 PO 4、6グラムのNa 2 HPO 4、5gのNaCl、1ミリリットルの1M MgSO 4で流路を埋める、AUTで滅菌oclaving] Cに対してエレガンス 18または1×PBS前10分間ショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生19日に[8 NaCl、0.2gのKCl、1.44gのNa 2 HPO 4、0.24gのKH 2 PO 4、H 2 O 1Lには、オートクレーブで滅菌する]を実験。
  2. シングルCを見つけ低倍率の実体顕微鏡を用いてのNGMプレート18（または寒天エッグプレートまたは液体培地で20手動dechorionated 30 HPFゼブラフィッシュの幼虫から初齢、ショウジョウバエの幼虫）で必要なステージの虫 。マイクロチップ内に緩衝液の少量を使用して、単一の動物を選んでください。バッファ内のより大きいショウジョウバエやゼブラフィッシュの幼虫を収容するために、その端部をカットしたマイクロチップを使用しています。
  3. 流路入口から単一の生物を押してください。メイントラップの下に個々の動物を位置決めするためのピペッティング圧力を調整します。
  4. ゆっくりちゃんに対して動物を配置するためのPDMS膜の圧力を増加させるNEL境界および Cの14 psiの圧力でそれを固定する線虫 、 ショウジョウバエ 、ゼブラフィッシュの幼虫の3 PSIの7 PSI。
  5. ビューの顕微鏡視野の中心に固定化された動物を置きます。高分解能明視野、蛍光イメージングのための希望の設定に倒立顕微鏡を使用しています。事前定義されたフレームレートで単一またはタイムラプス蛍光画像を取得する。
  6. トラップ圧力を解放し、低倍率で5〜10分間のために動物の運動を監視します。
  7. 動物をフラッシュして、上記の手順を繰り返して、新鮮な動物を挿入します。
  8. シリンジを使用して適用された蒸留水を用いた廃棄物のリザーバーからすべての動物を洗う。将来の再利用のための注射器を使用して空気を押してチャンネルを乾かします。

注意事項：メインチャネル内の流れに高いピペッティング圧力を必要とする動物は、トラップからのリリース後に貧しい運動/健康を示す傾向にあるとIMAは避けるべきである変更する。結晶することで、チャネルの詰まりを防止するためのバッファの任意のトレースの流路を清掃してください。油は高分解能イメージングのために使用されている場合は、その後の実験のために対雑音比の良い信号を維持できるようにするにはガラスカバースリップを清掃してください。

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Representative Results

図1に示すように、フロー層（レイヤ1）と制御層（レイヤ2）：固定装置は、接着層2で作製した二層のPDMSブロックです。主なトラップは、レギュレータと液柱（ 図1A）を介して膜上必要（3-14 psi）の圧力を適用するための3ウェイストップコックを介して窒素ガスボンベに接続されています。偏向膜は C を固定する異なる次元（ 図1Bおよび1C）を使用して設計、流路内に虫 、 ショウジョウバエやゼブラフィッシュ幼生。フォトマスクは、Cの異なる形状と固定化されたデバイス層を設計するのに使用されエレガンス （ 図1D）、 ショウジョウバエの幼虫（ 図1F）とゼブラフィッシュの幼虫（ 図1G）。流動層（ 図1Eのh1、1K）のチャネルの高さは、またはに対応するために、異なるスピン塗布速度を使用して変化させた流路内の異なる直径のganisms。流動層の高さを40μm、80μmであり、500μm以下と Cは900μmで作製した虫幼虫、成虫でそれぞれ線虫 、 ショウジョウバエの初齢幼虫とゼブラフィッシュの幼虫（ 表1）。 40μmの流路高さを持つデバイスがL1からL4の早いCに適切である虫の幼虫。 80μmの流路高さを持つデバイスが遅くL4幼虫と成虫C ​​で使用されている外陰部が突出し始めエレガンス 。大きいゼブラデバイスも古いショウジョウバエの幼虫に使用することができます。 PDMS膜の厚さ（m）は、Cの40μmおよび300μmで作製したそれぞれ虫やショウジョウバエ /ゼブラデバイス。レイヤ2の微小流体チャネルの高さは、Cの初期の幼虫は40μmで作製したエレガンスと Cの後期幼生期には80μmの虫やショウジョウバエ/ゼブラフィッシュの幼虫。流路は、膜及び制御チャネルの高さは、複数の独立したバッチで作製されたデバイスで測定され、お互いの±5μm以内の一貫であることがわかった。デバイスは、流路内に微生物を固定化するために、膜偏向技術（ 図1H-J）を使用しています。

生物 流路（PDMS-1） 流路のための条件をスピン スペーサーPDMS（PDMS-S） スペーサーPDMSのスピン状態 固定化圧力（psi）
線虫C. elegans（L1〜L4、早期に） 40μm以下（SU8-2025） 500回転（5秒）、2,000 rpmで（30秒） NA NA 14
線虫C. elegans（後期L4と大人） 80＆ムー;メートル（SU8-2050） 500回転（5秒）、2,000 rpmで（30秒） NA NA 14
ショウジョウバエ （初齢） 80μmの（SU8-2050） 500回転（5秒）、2,000 rpmで（30秒） 400μmのシロキサン（PDMS） 500回転（35秒） 7
ゼブラフィッシュ（30 HPF） 80μmの（SU8-2050） 500回転（5秒）、2,000 rpmで（30秒） 400μmのシロキサン（PDMS）を2倍 500回転（35秒） 3

C言語で使用される流路（PDMS-1）の表1。デバイスの寸法とスペーサーPDMS層（PDMS-S） 虫やショウジョウバエ /ゼブラデバイス。

C. elegansの L4幼虫は14 psiの窒素ガスを用いて80μmの流路高PDMSマイクロ流体デバイス（ 図2A）に固定化した。タイムラプス蛍光画像ワットミトコンドリアのイメージング輸送用60X対物レンズ（開口数1.4、油浸対物）を使用して、毎秒2フレーム（fps）の速度で取得EREはタッチ受容ニューロン21のミトコンドリアマトリックス対象とGFPを用いて可視化した。全400フレームImageJの（使用kymographsに変換されていましたwww.rsbweb.nih.gov / IJ ）とミトコンドリアは順行性に、（離れて細胞体から）監督逆行監督（細胞体に向かって）または静止（ 図2E）として分類された。我々は、固定化の圧力21 psiにミトコンドリア輸送を観察したが、磁束は最小固定圧力でやや大きかった。ミトコンドリアの順行性および逆行性フラックスは、14 psiの固定圧力で1.1±0.23 1.6±0.8に対し、7 psiで0.22±0.25、1.2±0.34であることが測定された。値は1.1から統計的に差はなかった±0.33と1.3＆Plusmn; 0.42動物から得られた3mmのレバミゾール（p値> 0.45、n = 30の動物）を使用して固定化した。

500μmの高さを持つ大型のデバイスは初齢ショウジョウバエの幼虫（ 図2B）および28から30 HPFゼブラフィッシュの幼虫（ 図2D）を固定するために使用することができます。第一齢ショウジョウバエの幼虫の郭清は挑戦することができます。これとは対照的に、マイクロ流体デバイスは、高分解能明視野および/または無傷の生物を用いた蛍光イメージングを実行するためのメソッドを提供します。個々のショウジョウバエの幼虫は感覚神経においてsynaptotagmin.eGFP輸送の7圧縮窒素ガスのPSI（ 図2B、表1）と蛍光画像を用いて固定した（ 図2C）を取得した。タイムラプスムービーは感覚ニューロン（ 図2F）の移動と固定シナプトタグミンマークされた貨物を示した。平均順行と逆行速度はキムから測定したographsは0.92±0.04μM/ sおよび1.00±0.05μm/ sの（ただし、n = 6匹は、n> 40セグメント）になる。これらは、順行性に（0.84±0.05μM/ s）と逆行（0.76±0.03μm/ sの）22の両方を移動解剖ショウジョウバエ運動ニューロンで測定シナプトタグミン運ぶ輸送小胞の速度に匹敵する。

900μmの高さを持つ類似のデバイスは、ゼブラフィッシュ幼生（ 図2D、表1）の様々なステージを固定するために使用された。その初期の発達段階におけるゼブラフィッシュ幼生はその尾を反転させ、10〜15秒と通常イメージング23溶液中または高解像度用の取り付け、メディア上tricaine（MS-222）0.02％を使用して固定化されている。私たちのPDMS装置は、高速固定化するための代替手段を提供し、高解像度イメージング24時の光路中に信頼性の低い封入の必要性を排除します。我々は、手動で28-3をdechorionated0 HPF幼虫と幼虫のハートビートのタイムラプスムービーを取得する3 psiの窒素ガスを用いたPDMS装置で個別にそれらを固定した。ハートビート率は136.8±分当たり1.6（N = 8の映画）であることが測定され、他の公開されたレポート25と同様であった。

私たちの単純なマイクロ流体デバイスは、すでに野生型Cのサブ携帯と携帯のさまざまなイベントを測定するための実証されていたエレガンス 4。私たちのマイクロ流体デバイス、野生型Cのエレガンスは、そのような麻酔薬を使用して固定化されている動物と比較して神経細胞に移動シナプス小胞などの貨物の大きい数を示しています。しかし、我々は、これらの知見は当てはまるかどうかを確認するために変異動物のために我々のデバイスをテストしていませんでした。これをテストするために、我々はプレシナプス小胞26を輸送kinesin3 / UNC-104分子モーター、UNC-104（e1265）の強いhypomorphic変異体を使用していました。我々はGFPのフラックスを比較::シナプス前vesiマークされ、RAB-3前方横機械刺激固定化麻酔薬のニューロンおよびデバイス内のクレスは変異aniamls（ 図3A）を固定化した。 1mMのレバミゾールで麻酔UNC-104動物（ 図3B、3C）27から取得したデータと比較して、プレシナプス小胞の束は、デバイス内の大きい束が動物を固定化した。これは、マイクロ流体デバイスのイメージング強い輸送欠損変異株がデータを収集してより効率的な手段である可能性が高いことを示しています。我々はまた、ユリィニューロンにおけるグルタミン酸受容体の他の貨物輸送は、 例えば、樹状（図3D、3E）デバイス固定化した動物で撮像することができることを示す。デバイスはまた、早期での間に画像の細胞プロセスに使用することができますそのようなL1の動物のQ神経芽細胞分裂などエレガンス開発 。 QRセルは2つの娘細胞QR.aとQR.pを形成するために分割して画像化した〜と孵化後3時間（ 図3F）は、一貫性のある初期の観察28。

C言語で使用される流路（PDMS-1）の表1。デバイスの寸法とスペーサーPDMS層（PDMS-S） 虫やショウジョウバエ /ゼブラデバイス。

図1
図1遺伝的モデル生物のPDMSマイクロ流体デバイスの概略図。 （A）は、生物が流路にマイクロチップを使用してロードされ、レギュレータとバルブを使用して制御し、圧縮された窒素ガスを用いて固定されています。デバイスは、倒立顕微鏡で明視野/蛍光イメージングに適しています。デザインは、Cに対してそれぞれ長さ10 mmの流路（デザインI、L1）と制御チャネル（設計Ⅱ、L2）で構成されていますエレガンス （B）とショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生（C）である。寸法は設計（BとC）に表示されています。 variouのの（D、F、G）の回路図PDMS（PDMS-1、A-2、PDMS、PDMS膜は、PDMS-Sとガラス）Cで現在のS層線虫 、 ショウジョウバエ 、ゼブラフィッシュ固定化装置。追加するには、可撓性膜とスペーサーPDMS層（PDMS-S）を形成するために、バルクPDMS層（PDMS-2）は、スピンコートPDMS層（PDMS-1）を示す装置の断面の（E）の概略図流路の高さ（ ショウジョウバエ /ゼブラデバイスの場合）。全体の構造は、生物（茶色の丸）を収容するために光学グレードガラスカバースリップに不可逆的に結合している。回路図は、制御チャネル 'h2'と、流路 'H1'、パンチスペーサ層の 's'と膜厚は 'm'の高さを示している。 （H）制御チャネルにおける圧力下の液柱の存在下で流路に向かって膜のたわみを示します。明視野画像はゼロの下で自由に（I）と偏向膜（j）の示すように、14 psiは、それぞれ、液柱を加圧されています。矢印と矢印の頭はバブルuを示すそれぞれ流路内膜のNDERとアウト。 Cの（K）の断面画像elegansのデバイスが固定化領域の場所で撮影された。スケールバーは50μm（K）と200μmの（I、J）である。 （D、F、G）の回路図の縮尺は異なります。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図2
図2：イメージング遺伝モデル生物は、マイクロ流体デバイスに固定することができる。固定化されたCの明視野像エレガンス （）、初齢ショウジョウバエの幼虫（B）とPDMSマイクロ流体デバイス内の30 HPFゼブラフィッシュの幼虫（D）。 jsIs609のタイムラプスイメージング、Cのキモグラフ分析デバイスimmobilの前方側面機械刺激受容ニューロン（ALM）におけるミトコンドリアマトリックス対象とGFPを発現する線虫系統、化された動物（E）。ミトコンドリアはキモグラフで順行性（ "ダウン"矢頭）、逆行（ 'アップ'矢頭）と固定（ 'スター'マーク）として分類されています。無傷の初齢ショウジョウバエ幼虫の（C）の蛍光画像。ボックスはsyt.eGFP輸送の高解像度タイムラプスイメージングがコリン作動性ニューロンで行われている場所を示しています。フレーム番号と5Hzで取得5フレームのモンタージュモンタージュ（F）における、順行逆行と固定として示されている各画像およびGFP著しい貨物に示されている。 （D）のボックスには、ゼブラフィッシュ幼生の鼓動の速度を計算するために監視された領域を示しています。スケールバーは5μm（F）は、10μmの（E）は、100μm以下（A、B）および200μm（D）です。

図3
図3：Cの携帯とサブ細胞イメージングPDMSマイクロ流体デバイスを用いたエレガンス 。蟻の（a）は概略順行と逆行方向と横方向のerior機械刺激（ALM）のニューロンは、マークされた。点線のボックスは軸索輸送のために結像される領域を示している。 350フレームは左に右にと神経リング（NR）に細胞体（CB）で5 fpsで回転するディスク共焦点顕微鏡を用いて取得されています。データはデバイスに固定化された動物のためkymographsを使用するか、1 mMのレバミゾール（C）を用いて分析される。順行と逆行方向に移動する貨物は、それぞれ 'ダウン'と 'アップ'を指す矢印を使用して表示されます。 350時間経過フレーム上のALMニューロン20μmの領域でUNC-104（e1265）動物で観察された粒子（B）の順行性および逆行性フラックス。 （D）は画像GFPに使用ユリィニューロンの回路図は、グルタミン酸受容体の輸送をマーク。 350時間経過フレームはPDMS装置に固定化された動物では順行と逆行方向に移動したり、1mMのレバミゾール（E）を使用して貨物を表示kymographsに変換されます。 Q神経芽ディ中に取得したタイムラプス画像Cの初期の幼虫期におけるビジョンと移行エレガンス 。その娘細胞QR.aとQR.p.を形成するためのQR受ける部門を示す（F）の三タイムラプスフレームスケールバーは5μm（C、EおよびF）である。 （B）で表されたデータは平均で±SEM（N> 4）。比較は麻酔薬で得られた値を基準に作られ、*が付されている（p <0.05）と**（P <0.005）。

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Discussion

PDMSマイクロ流体デバイスは、したがって、任意の透明/半透明モデル生物のin vivoイメージング高分解能のために使用することができる光学的に透明である。当社のデザインはそのまま生きた動物における細胞およびサブ細胞事象の高倍率時空イメージングに適しています。ソフトリソグラフィ技術を用いて微細加工は、モデル生物の様々なサイズのためのデバイスの寸法を簡単に操作できます。様々なサイズのデバイスはCの様々な段階のために製造されています虫 、 ショウジョウバエの幼虫とゼブラフィッシュの幼虫。その流れの層チャネルに40μmと80μmの高さの異なるデバイスには、Cの両方の初期（L1）と後（L4後期）の段階の改善固定化し、より良いイメージング後の健康状態を示すそれぞれエレガンス 。我々は、Cのデバイス製造の100％の成功率を達成瑕疵のあるデバイスなしで虫やショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ。デバイスはまで複数回使用することができます制御チャネルは、ダスト粒子や細菌の増殖に汚染されている。 Cを固定化されたデバイスelegansは麻酔動物と比較して、野生型と変異型の動物の両方に大きな貨物フラックスを示す。デバイスの固定化は、特にショウジョウバエの幼虫29の初期の発達段階のために技術的に困難な解剖プロトコルの必要性を排除します。

PDMSマイクロ流体デバイスにおける瞬時固定化プロトコルは、外部から印加された麻酔薬に必要な一般的に長い露光時間に比べて、実験時間を短縮することの固有の利点を持っています。すべての固定化された生物は、変形可能なPDMS膜上の圧力のリリース後5〜10分以内に正常歩行に戻ります。C.エレガンスは、流路との距離固定化膜の中央部からの境界に固定化される。流路の途中に固定化された動物は、貧しい人々の健康ポストimmobilizaを表示ると一日か二日以内に死亡する。当社のマイクロ流体デバイスは、L4ステージCを維持するために使用されていますエレガンスは、その健康やその後の発展に影響を与えることなく、膜の下に時間用に固定化した。短い時間（最大10分）のために固定化された動物は、イメージングのために複数回捕捉することができます。初期の発達段階、Cのエレガンスは、長期的に、タイムラプス実験のためわずかに低い圧力（7 PSI）（〜3時間）で固定した。膜リリース後の下に固定化された動物は、介在する時間内に同じデバイスに残された。これらの動物は彼らの開発と一般的な健康状態の両方において野生型に匹敵する。アダルトC.低い圧力（7 PSI）を固定化した虫は、高解像度タイムラプス実験中低速ドリフトを見せ、輸送解析のための複雑な解析ツールが必要になります。しかし低い圧力は、約3時間または半定量mitoch以上のQ神経芽細胞の細胞分裂/マイグレーションなどの長期的な研究を行うために使用されたondria移動特性、完全な固定を必要としないプロセス。したがって、固定の低い圧力は、収集する必要のあるデータ·セットに応じて使用することができます。

L4はCのタイムラプスイメージングelegansは他のモデル系30から32のニューロンについて報告されているように、GFPの跳躍運動ニューロンは、ALM（株jsIs609）にミトコンドリアにマークが表示されます。それらの大半は映画の持続時間の上に静止している間、これらのニューロンの一部のミトコンドリアは、双方向の輸送を示しています。フラックスのわずかな違いにもかかわらず、我々 は 、Cの場合には14 psiの固定化の圧力を継続して使用elegansの完全固定化を取得し、軸索輸送の高解像度タイムラプスイメージング中にドリフトを避けるために。我々は、一般的なプロトコルで14 psiを使用していて、これが増加または減少させることができる実験的なニーズに応じてお勧めします。動物は正常locomotioに戻りほぼ同じ時間がかかりましたnの下位および上位固定圧力および固定化動物の両方から固定化せずに成長したものとまったく同じように開発し​​ました。

スペーサー層を持つ大きな寸法を使用して作製されたデバイスは、 ショウジョウバエ 、ゼブラフィッシュの幼虫などの大きいモデル生物に使用することができます。無傷の初齢ショウジョウバエ感覚ニューロンにおけるsynaptotagmin.eGFP輸送のイメージングは順行と逆行の両方向で能動輸送を示しています。デバイス固定化幼虫で測定された平均速度は解剖運動ニューロン22の測定値に比べて高くなっています。この違いは、より速く、我々の実験でのデータの取得（5 HzのV / S 1.1から1.4 Hz）を、オルガネラ輸送（感覚V / S運動ニューロン）および/または解離による影響で、ニューロン特異的な違いから生じうる。

当社の事前の実験は、このように我々のか否かを判断する、野生型動物4にもっぱら行ったマイクロ流体デバイスにおける撮像変異も有利であった。 Cのタイムラプスイメージングエレガンス L4動物は、GFPのフラックス:: RAB-3著しいプレシナプス小胞を1.0mMレバミゾールで固定化kinesin3/unc-104変異体における当社のPDMS装置（ 図3B）を使用して固定化した動物で得られたフラックスの測定値と比較して減少を示しています。私たちはしばしば観察され、動物が野生型動物を不動化麻酔薬濃度を用いて、固定化されている場合、変異体では非常に少ない輸送が観察された例（ 図3C）を示しています。我々はマイクロ流体デバイスを使用する場合、UNC-104動物で移動する小胞の数が大幅に高くなっています。 PDMS膜（ 図3B）に適用14psi圧力下に置かれたときに麻酔した動物は、同様の輸送特性を示す。同様の観察はまた、野生型動物4で行われた。これらのデータは、増加した磁束は、IMから発生する可能性がないことを示唆している窒素下で動員が、細胞内輸送にはあまり損傷されたプロトコルに起因する。

原理的には、このようなカルシウム動態と細胞分裂などの他のイベントは、すべて同様に無傷ショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生に結像させることができる。動物を固定化されたデバイスのイメージング後の回復が少なく、生物の生存率は4〜有害なため、そのようなデバイスはまた、長い時間スケールを上に発生したイベントのための遺伝的モデル遺伝的生物の長期の撮影を行うために使用することができますされています。

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Disclosures

特別な利害関係は宣言されません。

Acknowledgments

我々は、CのnuIs25とCGCのためのピーター十王、 ショウジョウバエケージを維持するために、ショウジョウバエの株式、Tarjani Agarwalさんのために博士Krishanuレイに感謝エレガンス株。 SPKはマイケルノネの研究室でjsIs609を作った。我々は、マイクロ流体デバイスにおけるjsIs609動物のミトコンドリア輸送のタイムラプスイメージングで彼の助けArpan Agnihotri（BITSピラニ）に感謝。我々は、ゼブラフィッシュ胚を提供してくれるための博士VatsalaティルマとスーリヤPrakashさんに感謝しています。我々は、ナノテクノロジー（第SR/55/NM-36-2005）のための科学と技術 - センターの部門によってサポートされ回転するディスク共焦点顕微鏡の使用のNCBで博士クリシュナとCIFFに感謝します。我々はまた、議論のためKaustubh Rauさん、V. VenkatramanとChetana Sachidanandに感謝します。この作品は、DBTポスドクフェローシップ（SM）は、DSTのファスト·トラック制度（SM）とによる助成（SPK）によって賄われていた。 SAはSPKにDSTとCSIR補助金によって支えられている。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafers University wafer 150 mm (100) Mech Grade SSP Si
Clewin Software WieWeb software Version 2.90
Laser plotter Fine Line Imaging 65,024 DPI
HMDS Sigma-Aldrich 440191-100ML
SU8 Microchem SU8-2025, SU8-2050
Developer Microchem SU8 Developer
Silane Sigma-Aldrich 448931-10G
PDMS Dow corning Sylgard 184
UV lamp Oriel 66943 200W Hg Oriel Light
Hot air oven Ultra Instruments Custom made Set at 50 °C
Hot plate IKA Laboratory Equipment 3810000 http://www.ika.com
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Spinner Semiconductor Production Systems SPIN150-NPP www.SPS-Europe.com
Glass cover slip Gold Seal 22 X 22 mm, No. 1 thickness
C. elegans Caenorhabditis Genetics Center (CGC) e1265, ayIs4
Drosophila Bloomington P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP
Zebrafish Indian wild type Wild type
Tygon tube Sigma Z279803
Micro needle Sigma Z118044 Cut into 1 cm pieces
3-way stopcock Sigma S7521
Harris puncher Sigma Z708631
Compressed nitrogen gas Local Gas supplier Use a regulator to control the pressure
Stereo microscope Nikon SMZ645
Confocal microscope Andor Olympus Yokogawa spinning disc confocal microscope
ImageJ National Institutes of Health www.rsbweb.nih.gov/ij Java based image processing program

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References

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生体工学、67号、分子生物学、神経科学、マイクロフルイディクス、
のためのシンプルなマイクロ流体デバイス<em生体内で&gt;</emの&gt;イメージング<em&gt; Cエレガンス</em&gt;<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;とゼブラフィッシュ
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Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish. J. Vis. Exp. (67), e3780, doi:10.3791/3780 (2012).

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