Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Simple mikrofluidenheder for Published: September 30, 2012 doi: 10.3791/3780
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Neurobiology, NCBS-TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR

Summary

En simpel mikrofluid enhed er udviklet til at udføre bedøvelse free

Abstract

Micro fabrikerede strømningstekniske giver et tilgængeligt mikro-miljø for in vivo undersøgelser af små organismer. Simple fremstillingsprocesser er tilgængelige for mikrofluide enheder ved hjælp af bløde litografiteknikker 1-3. Mikrofluide anordninger er blevet anvendt til subcellulære billeddannelse 4,5, in vivo laser mikrokirurgi 2,6 og cellulær billeddannelse 4,7. In vivo-billeddannelse kræver immobilisering af organismer. Dette er opnået ved hjælp af sugning 5,8, tilspidsede kanaler 6,7,9, deformerbare membraner 2-4,10, suge med yderligere afkøling 5, bedøvende gas 11, temperaturfølsomme geler 12, cyanoacrylat lim 13 og anæstetika, såsom levamisol 14 , 15. Almindeligt anvendte anæstetika indflydelse synaptisk transmission 16,17 og er kendt for at have skadelige virkninger for sub-cellulær neuronal transport 4. I denne study vi påvise en membran baseret poly-dimethyl-siloxan (PDMS) enhed, der tillader anæstetisk fri immobilisering af intakte genetiske modelorganismer såsom Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila-larver og zebrafisk larver. Disse modelorganismer er egnet til in vivo-undersøgelser i mikrofluidenheder på grund af deres små diametre og optisk transparente eller translucente organer. Organ diametre i området fra ~ 10 um til ~ 800 um for tidlige larvestadier af C. elegans og zebrafisk larver og kræver mikrofluidenheder af forskellig størrelse for at opnå fuldstændig immobilisering for høj opløsning time-lapse billeddannelse. Disse organismer er immobiliseret ved hjælp af tryk fra komprimeret nitrogengas gennem en væskesøjle og afbildet under anvendelse af et omvendt mikroskop. Dyr frigives fra fælden vende tilbage til normal locomotion indenfor 10 min.

Vi viser fire ansøgninger om time-lapse imaging i C. elegansnemlig imaging mitokondriel transport i neuroner, præ-synaptisk vesikel transport i en transport-defekt mutant, glutamat receptor transport og Q neuroblast celledeling. Data opnået fra sådanne film viser, at mikrofluid immobilisering er et nyttigt og præcise middel til at opnå in vivo data af cellulære og subcellulære begivenheder sammenlignet med bedøvede dyr (fig. 1J og 3C-F 4).

Enhedens dimensioner blev ændret for at give tid-lapse imaging af forskellige stadier af C. elegans, første stadium Drosophila larver og zebrafisk larver. Transport af vesikler markeret med synaptotagmin mærket med GFP (syt.eGFP) i sensoriske neuroner viser rettet bevægelse af synaptiske vesikel markører udtrykt i cholinerge sensoriske neuroner i intakt 1:a stadie Drosophila larver. En lignende indretning er blevet anvendt til at udføre time-lapse billeddannelse af hjerteslag i ~ 30 timer efter befrugtning (HPF)zebrafisk larver. Disse data viser, at de simple indretninger vi har udviklet, kan anvendes til en række forskellige modelsystemer til at studere adskillige cellebiologiske og udviklingsmæssige fænomener in vivo.

Protocol

1. SU8 Master Fabrication

  1. Designe de mikrofluide strukturer ved hjælp Clewin software og udskrive det ved hjælp af 65.024 DPI laser kortplotter med minimal træk størrelse på 8 um på printkortet film.
  2. Ren 2 cm x 2 cm silicium wafers med nativt oxid i 20% KOH i 1 min og skylles i demineraliseret vand, en wafer hver for strømmen lag og dets tilsvarende kontrollag.
  3. Føntørre stykkerne med nitrogengas og dehydrere på en varm plade ved 120 ° C i 4 timer. Lad brikkerne til at køle ned til stuetemperatur før man går videre til næste trin.
  4. Placer silicium stykker én ad gangen på spinner borepatron og tænd for vakuum. Dække silicium overflader med ~ 20 ul hexamethyl-disilazan (HMDS) og belægge dem med et SPIN150 spinner ved 500 rpm i 5 sekunder efterfulgt af 3.000 rpm i 30 sek.
  5. Cover siliciumskiver helt med ~ 1,5 ml SU8-2025 ( http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) og overtrække wafers hjælp SPIN150 spinner ved 500 rpm i 5 sekunder efterfulgt af 2.000 rpm i 30 sek. Denne spinning protokol frembringer en fotoresist tykkelse på ~ 40 um, der er egnet til bekæmpelse og flow lag for tidlige larvestadier af C. elegans.
  6. Spin ~ 1,5 ml SU8-2050 ved hjælp SPIN150 spinner ved 500 rpm i 5 sekunder efterfulgt af 2.000 rpm i 30 sekunder til opnåelse af en fotoresist tykkelse på ~ 80 um, der er egnet til flow layer fremstilling af sene larvestadier af C. elegans, basal flow lag for Drosophila / zebrafisk larver og deres tilsvarende kontrolinstanser.
  7. Placere silicium stykker på varmeplade med SU8 overtrukne lag på toppen. Soft bake de overtrukne silicium stykker på 65 ° C i 1 minut efterfulgt af 95 ° C i 10 minutter. Lad brikkerne til at køle ned til stuetemperatur før man går videre til næste trin.
  8. Placér soft-bagte silicium stykker på eksponeringen scenen med SU8-2025 coated surflade på oversiden vender mod UV-lampen. Brug tilgængeligt maske med motiv I (L1, figur 1 B) og design II (L2, figur 1 B) for flow lag og kontrollag mønster henholdsvis tidlige larvestadier af C. elegans. Placer tilgængeligt masken oven på det SU8 lag og sikre masken ligger fladt mod det coatede lag. Åbne lukkeren af ​​UV-lampen og blotlægge blødt bagt SU8 wafere til 200 Watt UV-lampe gennem billede maske for 15 sek.
  9. Brug tilgængeligt maske med motiv I (L1, figur 1 B) og design II (L2, figur 1 B) på SU8-2050 overtrukne stykker (fremstillet i trin 1.6) at fremstille flow lag og kontrollag for sene larvestadier af C. elegans. Brug tilgængeligt masken med konstruktionen I (L1, figur 1C) og design II (L2, figur 1C) til det basale flow lag og kontrollag henholdsvis Drosophila / zebrafisk larver på wafere belagt med SU8-2050 (fremstillet in trin 1,6). Udsætte SU8 overflader gennem billede maske til 200 Watt UV-lampe i 15 sekunder.
  10. Placere de eksponerede silicium stykker på en varm plade med den coatede lag på toppen. Sende bage waferne ved 65 ° C i 1 minut efterfulgt af 95 ° C i 10 min. Lad brikkerne til at køle ned, før du går videre til næste trin.
  11. Udvikle stykkerne ved hjælp af SU8 fremkalderopløsning i 20 min. Skyl stykkerne i iso-propylalkohol (IPA) og blæse tør bruge nitrogen gas.
  12. Placer silicium stykker i en ekssikkator med SU8 mønster på toppen. Belægge stykkerne med 50 ul tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl) silan damp i en ekssikkator i 2 timer.

Forholdsregler: Tag sikkerhedsforanstaltninger for håndtering af kemikalier under KOH behandling, fotoresistbelægning og udvikling. Silan damp belægning skal udføres inde i en ekssikkator i et ventileret område. Beskyt SU8 modstå fra over udsættelse for lys. Brug beskyttelsesbriller med en UV Light source.

2. PDMS Mold Fabrication

  1. Forbered 10:01 PDMS ved at kombinere 50 g Sylgard 184 base med 5 g hærder i et plastbæger. Bland indholdet manuelt for ~ 3 min. Afgasses blandingen i en ekssikkator for at fjerne alle luftbobler dannet under blandingen.
  2. Hæld en 5 mm tyk PDMS blandingen over de silicium wafers med SU8 mønster af design II, til kontrol lag, forsigtigt for at undgå dannelse af luftbobler. I tilfælde bobler dannes under udhældning, afgasse PDMS på SU8 mønster i lavt vakuum for at fjerne alle boblerne.
  3. Placer siliciumskiver med SU8-2025 mønster af design jeg, for strømmen lag, på spinner chuck og tænd for vakuum til at holde dem. Dække wafers med ~ 1 ml PDMS blandes og coate vafler hjælp SPIN150 spinner ved 500 rpm i 5 sekunder efterfulgt af 1.500 rpm i 30 sek.
  4. Coat ~ 1 ml PDMS mix på siliciumskiver til 80 um SU8-2050 mønster af design I (L1, figur 1 B), forflow lag for sene larvestadier af C. elegans ved brug af SPIN150 spinner ved 500 rpm i 5 sekunder efterfulgt af 1.000 rpm i 30 sek. Coat et tykt lag PDMS mix på silicium stykker med SU8-2050 mønster af flow layer design I (L1, figur 1C) for Drosophila / zebrafisk larver under anvendelse SPIN150 spinner ved 500 rpm i 35 sek.
  5. Bake PDMS-overtrukne silicium stykker af design I og vafler med tilsvarende design II for kontrol lag indeholdende PDMS for C. elegans og / eller Drosophila / zebrafisk larver i en konvektionsovn med varm luft ved 50 ° C i 6 timer.
  6. Skåret ud af PDMS stykke fra siliciumsubstratet indeholdende SU8 mønster II for C. elegans og / eller Drosophila / zebrafisk larver med en skarp kniv. Udstanse et lille hul på ~ 1 mm oven på reservoiret forbinder den primære fælde i PDMS formen under anvendelse af en Harris puncher.
  7. Anbring det udstansede PDMS blok (indeholdende 40 um tyk form til styringlag L2) på en plastbakke, med den støbte side af kontrollag opad. Placer PDMS belagt silicium wafer, som indeholder de 40 um tyk SU8 design I på samme bakke, med PDMS coatede overflade opad. Sæt skuffen inde i kammeret af plasma renere og tænd for vakuum i 2 min. Efterfølgende tænde for plasma magt og sænke trykket i kammeret, indtil kammeret bliver lys rosa farve. Udsætte begge overflader til 18 Watt luftplasma under lavt vakuum i 2 min.
  8. Placer udstansede PDMS blokken fjernet fra de 80 um tyk SU8 master indeholder mønster II for sene larvestadier af C. elegans eller Drosophila / zebrafisk larver på en plastbakke, med den støbte side af kontrol lag opad. Placer den tilsvarende bagt PDMS lag spin-coated på silicium wafer indeholdende 80 um tyk design I til senere C. elegans etaper eller Drosophila / zebrafisk larver samtidigt på den samme bakke med den flade PDMS belagt surface opad. Bruge den samme protokol nævnt ovenfor for at udsætte dem for luft plasma.
  9. Placere de to plasma behandlede overflader for C. elegans og / eller Drosophila / zebrafisk larver sammen med let tryk og bag dem i konvektionsovn med varm luft ved 50 ° C i 2 timer.
  10. Klip de bundne enheder fra siliciumsubstratet med SU8 design I for C. elegans og / eller Drosophila / zebrafisk larver. Punch adgang huller på indløbet og udløbet reservoirer af strømningskanalen.
  11. Placer bundne PDMS mug på en plastbakke for C. elegans, med den støbte side af flow lags design opad. Clean dækglas (22 X 22 mm, nr. 1 tykkelse) og læg den på samme plastbakke. Sæt skuffen indeholder PDMS mug og dækglas inde i plasmakammeret. Udsætte nederste PDMS overflade af indretningen og dækglas til 18 Watt luftplasma ved lavt tryk i 2 min. Placer de to plasma behandlede overflader med genTLE tryk og bag dem i konvektionsovn med varm luft ved 50 ° C i 2 timer.
  12. Opbevar enheden i et rent miljø for fremtidig brug.

3. Yderligere trin for Drosophila / zebrafisk Device

  1. Blotlægge rent glasoverflade størrelse 2 cm x 2 cm med 50 pi tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl) silan damp i en ekssikkator i 2 timer.
  2. Spin ~ 1 ml 10:01 PDMS blanding fremstillet i trin 2.1 på det silaniserede glasoverfladen ved hjælp SPIN150 spinner ved 500 rpm i 35 sek. Bag PDMS-overtrukne glassubstrater i en varmluftovn ved 50 ° C i 6 timer med den coatede side opad. Lad PDMS lag for at køle ned til stuetemperatur før man går videre til næste trin.
  3. Punch det coatede lag ved anvendelse af en specialbygget skarpe metal Hullemaskine ved midten af ​​PDMS, til dannelse af PDMS afstandslaget. Formen af metallet Hullemaskine er udformet svarende til flow design for Drosophila / zebrafisk (L1, figur 1C
  4. Udsætte PDMS afstandslaget og det enkeltstrengede bundne blok (flow lag og kontrollag, fremstillet i trin 2.9 for Drosophila / zebrafisk larver) til 18 Watt luftplasma anvendelse af plasma renere ved lavt vakuum. Placere de to plasma behandlede overflader sammen og bage dem i en varmluftovn ved 50 ° C i 2 timer.
  5. Skær bundne enhed fra glasset, Punch adgang huller på indløbet og udløbet reservoirer og obligationer det til en dækglas (22 X 22 mm, nr. 1 tykkelse) med en plasma renere som nævnt i trin 2,11. Dette ville frembringe en immobilisering indretning til første stadium Drosophila-larver med en kanal højde på ~ 500 um. For zebrafisk larver, dublere PDMS spacer lag produktionsprocessen med en ekstra binding skridt. Den dobbelte lag af PDMS-S producerer en kanal højde på 900 um for 30 HFP zebrafisk larver.

Forholdsregler: Undgå støvpartikler under enhed fabrikation. To plasma renset overflades er nødt til at være helt fri for støv for korrekt binding. Opbevar enheder i en ekssikkator i situationer, hvor et særligt rene rum er ikke tilgængelig for at minimere ophobning af støvpartikler i enheder.

4. Brug af PDMS Membrane

  1. Den ene ende af en mikro-fleksibel slange (indre diameter ~ 1,6 mm, ydre diameter ~ 4,8 mm) til en tryksat nitrogen gasforsyning regulator og den anden ende til den vigtigste trap reservoir gennem en 18 gauge nål (ydre diameter ~ 1,25 mm) limet til røret. En 3-vejs stophane anvendes i midten af ​​røret forbindelsen tillader anvendelse eller frigivelse af tryk på membranen.
  2. Fyld røret forbundet til PDMS-enhed med en 10 cm søjle af destilleret vand før tilslutning til reservoiret af den primære fælde af en C. elegans og / eller Drosophila / zebrafisk larver enhed.
  3. Dreje ventilen for tilførsel af kvælstof for at læse 14 psi og overvåge membranen af ​​den primære fælde afbøjning i retning the strømningskanal ved lav forstørrelse af et omvendt mikroskop. Længden af ​​vandsøjlen i mikro-fleksibel slange komprimeres, når 3-vejs stophanen er åben. Kanterne på den afbøjede membran er synlige i gennemfaldende lys (figur 1I og 1J). Membrane afbøjning forårsager forskydning af støvpartikler / bobler under PDMS membran og presser dem til kanalens grænser.
  4. Vent til den flydende fronten fylder mikrokanalen helt uden nogen indespærret luft.
  5. Frigør tryk ved anvendelse af 3-vejs stophane til at slappe af membranen til sin hvileposition.

5. Indsættelse C. elegans, Drosophila og zebrafisk Larver ind i apparatet og immobilisere dem under den fleksible PDMS Membrane

  1. Fyld strømningskanalen med M9-puffer [3 g KH 2 PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCI, 1 ml 1 M MgSO4, H2O til 1 L, steriliseres ved autoclaving] for C. elegans 18 eller 1X PBS [8 g NaCl, 0,2 g KCI, 1,44 g Na 2 HPO 4, 0,24 g KH 2 PO 4, H2O til 1 L og steriliseres i autoklave] for Drosophila / zebrafisk larver 19 for 10 min før en eksperiment.
  2. Find en enkelt C. elegans af krævede trin på en NGM plade 18 (eller første stadium Drosophila larver fra agar æg tallerken eller manuelt dechorionated 30 HPF zebrafisk larver i flydende medium 20) ved hjælp af en lav forstørrelse stereo mikroskop. Pick et enkelt dyr ved hjælp af et lille volumen af ​​pufferopløsning i en mikro spids. Brug en mikro spids med sin ende skåret til at rumme større Drosophila eller zebrafisk larver i buffer.
  3. Skub enkelt organisme gennem strømningskanalen indløb. Juster pipettering tryk for at placere det enkelte dyr under den primære fælde.
  4. Forøge trykket af PDMS membranen langsomt at placere dyret mod channel grænse og immobilisere det med 14 psi tryk i C. elegans, 7 psi til Drosophila og 3 psi i zebrafisk larver.
  5. Placere immobiliserede dyr ved midten af ​​den mikroskopiske synsfelt. Brug en omvendt mikroskop ved ønskede indstillinger for høj opløsning lyse felt eller fluorescensimagografi. Anskaf enkelt-eller time-lapse fluorescensbilleder på foruddefinerede frame rate.
  6. Slip fælden tryk og overvåge bevægelse af dyret i 5-10 minutter ved lav forstørrelse.
  7. Skyl dyret og indsætte en ny dyr at gentage ovenstående trin.
  8. Vask alle dyrene fra spildreservoiret brug af destilleret vand påføres med en sprøjte. Tør kanalen ved at skubbe luft ved anvendelse af en sprøjte for senere genanvendelse.

Forholdsregler: Dyr, der kræver højere pipettering tryk at flyde inde i hovedkanalen tendens til at vise dårlig bevægelse / sundhed efter frigivelse fra fælden og bør undgås for imaging. Rengør strømningskanalen for ethvert spor af puffer for at forhindre tilstopning af kanalen af ​​krystaller. Hvis der anvendes olie til høj opløsning billeddannelse, rengøre dækglas for at kunne opretholde en god signal til støj-forholdet for efterfølgende forsøg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immobiliseringen indretning er et dobbeltlag PDMS block fremstilles ved binding to lag: a flow layer (Layer 1) og et kontrol-lag (lag 2) som vist i figur 1.. Den vigtigste fælde er forbundet til en nitrogengas cylinderen gennem en regulator og en 3-vejs stophane til at anvende nødvendigt (3-14 psi) på membranen gennem en væskesøjle (figur 1A). Den afbøjede membran immobiliserer C. elegans, Drosophila og zebrafisk larver i strømningskanalen udformet med forskellige dimensioner (figur 1B og 1C). Foto masker anvendes til at designe immobilisering enhed lag med forskellige geometrier til C. elegans (figur 1D), Drosophila-larver (figur 1F) og zebrafisk larver (figur 1G). Kanalhøjden af strømmen lag (h1 i fig 1E, 1K) blev varieret under anvendelse af forskellige spincoating hastigheder til at rumme ellerganismer med forskellige diametre inden i strømningskanalen. Flow lag højder blev fremstillet på 40 um, 80 um, 500 um og 900 um til C. elegans larvestadier, voksen C. elegans, første stadium Drosophila larver og zebrafisk larver (Tabel 1). Enheden med en strømningskanal højde på 40 um er passende fra L1 til begyndelsen L4 C. elegans larver. En enhed med en 80 um strømningskanal højde bruges til sent L4 larver og voksne C. elegans, når vulva begynder at rage. De større zebrafisk indretninger kan også anvendes til ældre Drosophila-larver. PDMS membrantykkelse (m) blev fremstillet ved 40 um og 300 um til C. elegans og Drosophila / zebrafisk-enheder hhv. Højden af mikrofluid kanal i lag 2 blev fremstillet ved 40 um for tidlige larvestadier af C. elegans og 80 um for sene larvestadier af C. elegans og Drosophila/ Zebrafisk larver. Højden af ​​strømningskanalen, membran og styrekanal blev målt i indretninger fremstillet i flere uafhængige partier og viste sig at være konsistent inden for ± 5 um af hinanden. Anordningen anvender en membran deformation teknik (fig. 1 H-J) for at immobilisere organismerne i strømningskanalen.

Organismer Strømningskanalen (PDMS-1) Spin betingelserne for strømningskanalen Spacer PDMS (PDMS-S) Spin betingelser for spacer PDMS Immobilisering tryk (psi)
C. elegans (L1 til begyndelsen L4) 40 um (SU8-2025) 500 rpm (5 sek), 2000 rpm (30 sek) NA NA 14
C. elegans (sene L4 og voksne) 80 &mu, m (SU8-2050) 500 rpm (5 sek), 2000 rpm (30 sek) NA NA 14
Drosophila (første stadium) 80 um (SU8-2050) 500 rpm (5 sek), 2000 rpm (30 sek) 400 um (PDMS) 500 rpm (35 sek) 7
Zebrafisk (30 HPF) 80 um (SU8-2050) 500 rpm (5 sek), 2000 rpm (30 sek) 2X 400 um (PDMS) 500 rpm (35 sek) 3

Tabel 1. Device dimensioner af strømningskanalen (PDMS-1) og spacer PDMS lag (PDMS-S), der anvendes i C. elegans og Drosophila / zebrafisk-enheder.

C. elegans L4 larver blev immobiliseret i 80 um kanalhøjde PDMS mikrofluid enhed under anvendelse af 14 psi nitrogengas (figur 2A). Time-lapse fluorescens billeder were erhvervede ved en hastighed på 2 billeder i sekundet (fps) ved hjælp af en 60X målsætning (numerisk åbning 1,4, olie objektiv) til billeddannelse transport af mitokondrier visualiseret ved hjælp af en mitochondrial matrix målrettet GFP i touch receptor neuroner 21. Alle 400 rammer blev omdannet til kymographs hjælp ImageJ ( www.rsbweb.nih.gov / ij ) og mitokondrier blev klassificeret som anterogradely rettet (væk fra cellelegemet), retrogradt rettet (mod cellelegeme) eller stationær (figur 2E). Vi observerede mitochondrial transport op til 21 psi immobilisering tryk, men fluxen er noget større ved den laveste immobilisering tryk. Den anterograd og retrograd strømning af mitokondrier blev målt til at være 1,1 ± 0,23 og 1,6 ± 0,22 efter 7 psi, mens 0,8 ± 0,25 og 1,2 ± 0,34 ved 14 psi immobilisering tryk. Værdierne var ikke statistisk forskellig fra 1,1 ± 0,33 og 1,3 & plusmn; 0,42 fra dyr immobiliseret under anvendelse af 3 mM levamisol (p-værdier> 0,45, n = 30 dyr).

De større enheder med 500 um højde kan anvendes til at immobilisere 1. Stadium Drosophila-larver (figur 2B) og 28-30 HPF zebrafisk larver (figur 2D). Dissektion af første instars Drosophila larver kan være udfordrende. Derimod mikrofluidenheder tilvejebringe en fremgangsmåde til at udføre høj opløsning lyse felt og / eller fluorescensimagografi ved anvendelse af intakte organismer. Individuel Drosophila larver blev immobiliseret ved hjælp 7 psi komprimeret nitrogengas (figur 2B, tabel 1) og fluorescens-billeder af synaptotagmin.eGFP transport i sensoriske neuroner blev opnået (figur 2C). Time-lapse film viste bevægende og stationære synaptotagmin markant last i sensoriske neuroner (figur 2F). Gennemsnitlige anterograd og retrograd hastighed blev målt fra Kymographs at være 0,92 ± 0,04 um / s og 1,00 ± 0,05 um / s, (n = 6 dyr, n> 40 segmenter). Disse er sammenlignelige med hastigheder på synaptotagmin transporterer transport vesikler målt i dissekerede Drosophila motorneuroner flytter såvel anterogradely (0,84 ± 0,05 pm / s) og retrograd måde (0,76 ± 0,03 pM / s) 22.

Lignende apparater med 900 um højden blev anvendt til at immobilisere forskellige stadier af zebrafisk larver (figur 2D, tabel 1). Zebrafisk larver i den tidlige udviklingsstadier flips halen hvert 10 til 15 sek og er som regel immobiliseres ved hjælp af 0,02% tricaine (MS-222) i opløsning eller på montage medier for høj opløsning billeddannelse 23. Vores PDMS-enhed tilvejebringer en alternativ måde til hurtig immobilisering og fjerner behovet for en upålidelig monteringsmedium i den optiske vej ved høj opløsning billeddannelse 24. Vi manuelt dechorionated 28-30 HPF larver og immobiliseret dem enkeltvis i en PDMS enhed ved hjælp af 3 psi nitrogen gas til at erhverve time-lapse film af larvernes hjerteslag. Hastigheden af hjerteslag blev målt til at være 136,8 ± 1,6 pr min (n = 8 film) og var ligner andre offentliggjorte rapporter 25.

Vores enkle mikrofluid enhed allerede er bevist til at måle en række sub-cellulære og cellulære begivenheder i vild type C. elegans 4. I vores mikrofluid enhed, vildtype C. elegans viser et større antal af last, såsom synaptiske vesikler, der bevæger sig i neuroner sammenlignet med dyr, som er immobiliseret ved hjælp af anæstetika. Men vi havde ikke testet vores enheder for mutant dyr at se, om disse resultater holder stik. For at teste dette brugte vi en stærk hypomorphic mutant i kinesin3 / UNC-104 molekylær motor, unc-104 (e1265), der transporterer præsynaptiske vesikler 26. Vi sammenlignede strømmen af ​​GFP :: RAB-3 markant præ-synaptisk vesirerne i de forreste laterale mechanosensory neuroner i bedøvelsesmiddel immobiliserede og enheds immobiliseret mutant aniamls (figur 3A). Flux af præ-synaptiske vesikler var større flux i enheden immobiliserede dyr sammenlignet med data indhentet fra unc-104 dyrene bedøvet i 1 mM levamisol (Figur 3B, 3C) 27. Dette viser, at billeddannelse stærke transport defekte mutanter i mikrofluidenheder vil sandsynligvis være et mere effektivt middel til at indsamle data. Vi viser også, at anden last fx dendritiske transport af glutamatreceptorer i Ury neuroner kan afbildes i enheden immobiliserede dyr (figur 3D, 3E). Anordningen kan også anvendes til afbildning af cellulære processer i begyndelsen C. elegans udvikling, såsom Q neuroblast division i L1 dyr. Den QR celle blev underkastet billeddannelse til at dele til dannelse af to datterceller QR.a og QR.p ~ 3 h efter udklækning (fig. 3F) i overensstemmelse medtidligere iagttagelser 28.

Tabel 1. Device dimensioner af strømningskanalen (PDMS-1) og spacer PDMS lag (PDMS-S), der anvendes i C. elegans og Drosophila / zebrafisk-enheder.

Figur 1
Fig. 1. Skematisk fremstilling af PDMS mikrofluidenheder for genetiske modelorganismer. (A) organisme er lagt ved anvendelse af en mikro-spids ind i strømningskanalen og immobiliseres ved hjælp af komprimeret nitrogen styret gas ved hjælp af en regulator og ventil. Enheden er velegnet til lyse felt / fluorescensimagografi i et omvendt mikroskop. Udformningen består af en 10 mm lang strømningskanal (motiv I, L1) og en styrekanal (motiv II, L2) til henholdsvis C. elegans (B) og Drosophila / zebrafisk larver (C). Dimensionerne er angivet på udformningen (B og C). (D, F, G) Skematisk af various lag af PDMS (PDMS-1, PDMS-2, PDMS membran, PDMS-S og glas) til stede i en C. elegans, Drosophila og zebrafisk immobilisering enhed. (E) Skematisk gengivelse af et tværsnit af indretningen viser hovedparten PDMS laget (PDMS-2), en spin-coated PDMS lag (PDMS-1) til dannelse af en fleksibel membran og en spacer PDMS lag (PDMS-S) for at tilføje højde til strømningskanalen (for Drosophila / zebrafisk-enhed). Hele konstruktionen er bundet irreversibelt til en optisk kvalitet dækglas at rumme organismen (cirkel i brunt). Den skematiske angiver højden af ​​styrekanalen 'h2', strømningskanalen 'h1 «, hullet spacer lag' s 'og membrantykkelse» m «. (H) Angiver membranen omledninger til strømningskanalen i nærvær af væskesøjle under tryk i styrekanalen. Lyse felt billeder er vist af en fri (I) og afbøjet membran (J) under nul og 14 psi tryk væskesøjle hhv. Pilen og pil hoved indikerer boble uNDER og ud af membranen i strømningskanalen hhv. (K) tværsnitsbillede image C. elegans anordning taget på stedet for immobiliseringen området. Scale bar er 50 um (K) og 200 um (I, J). (D, F, G) Skema er ikke til at skalere. Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2. Imaging genetiske modelorganismer immobiliseret i en mikrofluid anordning. Bright field billede af et immobiliseret C. elegans (A), en første stadium Drosophila-larver (B) og en 30 HPF zebrafisk larver (D) i en PDMS mikrofluid enhed. Kymograph analyse af time-lapse imaging af jsIs609, en C. elegans-stamme, der udtrykker et mitochondrial matrix målrettet GFP i en forreste lateral mechanosensory neuron (ALM) af en anordning IMMOBILliseret dyr (E). Mitokondrier er klassificeret som anterograd ('ned' pil hoved), retrograd ('up' pilen hoved) og stationære ('stjerne' mark) i kymograph. (C) Fluorescence billede af en intakt 1. Stadium Drosophila larver. Boksen angiver det sted, hvor høj opløsning time-lapse billeddannelse af syt.eGFP transport finder sted i en cholinerge neuron. Montage af fem frames erhvervet ved 5 Hz med rammenumre angivet på hvert billede og GFP markant last vist som anterograd, retrograd og stationært i montagen (F). Feltet i (D) angiver det område, der blev målt til beregning af hastigheden af ​​hjerteslag zebrafisk larver. Scale bar er 5 um (F), 10 pM (E), 100 uM (A, B) og 200 um (D).

Figur 3
Figur 3. Cellulær og sub-cellulære billeddannelse i C. elegans hjælp PDMS mikrofluidenheder. (A) Skematisk af en myreerior lateral mechanosensory (ALM) neuron med anterograd og retrograd retninger markeret. Den stiplede boks viser den region afbildes for axonal transport. 350 frames er erhvervet ved hjælp af en roterende skive konfokal mikroskop ved 5 fps med celle organ (CB) til højre og nerve ring (NR) til venstre. Data analyseres ved hjælp kymographs for dyr immobiliseret i en enhed eller anvendelse af 1 mM levamisol (C). Cargo bevæger sig i anterograd og retrograd retninger er vist ved hjælp af pile, der peger 'down' og 'up' hhv. (B) Anterograd og retrograd flux af partikler observeret i unc-104 (e1265) dyr i en 20 um region af ALM neuron over 350 time-lapse frames. (D) Skematisk af en URY neuron anvendes til at afbilde GFP mærket glutamatreceptorer transport. 350 time-lapse frames omdannes til kymographs der viser lasten bevæger sig i de anterograd og retrograd retninger hos dyr immobiliseret i PDMS enhed eller anvendelse af 1 mM levamisol (E). Time-lapse billeder erhvervet under Q neuroblast division og migration i de tidlige larvestadier af C. elegans. (F) Tre time-lapse frames, der viser QR gennemgår division til at danne sin datter celler QR.a og QR.p. Scale bar er 5 um (C, E og F). Data repræsenteret i (B) er gennemsnit ± SEM (n> 4). Der sammenlignes med hensyn til værdier opnået i anæstetiske og betegnet med * (p <0,05) og ** (p <0,005).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PDMS mikrofluidenheder er optisk transparent derfor kan anvendes til høj opløsning in vivo-afbildning af en transparent / translucent model organisme. Vores design er egnet til stor forstørrelse spatio-temporale billeddannelse af cellulære og subcellulære begivenheder i intakte levende dyr. Microfabrication med bløde litografiteknikker tillader nem manipulation af enhedens dimensioner for forskellige størrelser af modelorganismer. Indretninger af forskellige størrelser, fremstilles til forskellige C. elegans, Drosophila larver og zebrafisk larver. Enheder med forskellige højder på 40 um og 80 um i deres flow lag kanaler viser forbedret immobilisering og bedre post-imaging helbred både tidligt (L1) og senere (slutningen L4) stadier af C. elegans hhv. Vi opnår en 100% succesrate i enhed fabrikation for C. elegans og Drosophila / zebrafisk uden defekte indretninger. Indretninger kan anvendes flere gange, indtilstyrekanalen er forurenet med støvpartikler eller bakterievækst. Enhed immobiliseret C. elegans viser større last flux i både vildtype og mutante dyr sammenlignet med bedøvet dyr. Enhed immobilisering eliminerer behovet for teknisk udfordrende dissektion protokoller især for tidlige udviklingsstadier af Drosophila larvae 29.

Øjeblikkelige immobilisering protokoller i PDMS mikrofluidenheder har en iboende fordel, at eksperimentelle tid sammenlignet med de typisk længere eksponeringstider kræves til eksternt anvendte anæstetika. Alle immobiliserede organismer vende tilbage til normal bevægelse inden for 5-10 min efter frigivelsen af presset på den deformerbare PDMS membranen. C. elegans immobiliseres på grænsen af strømningskanalen og væk fra den centrale del af immobiliseringen membran. Dyr immobiliseret i midten af ​​strømningskanalen viser dårligt helbred post-immobilization og dø inden for en dag eller to. Vores mikrofluid enhed er blevet brugt til at holde L4 trin C. elegans immobiliseret i op til en time under membranen uden at påvirke deres helbred eller efterfølgende udvikling. Dyr immobiliseret i kortere tid (op til 10 min) kunne være fanget flere gange for billeddannelse. For tidlige udviklingsstadier, C. elegans blev immobiliseret med lidt lavere tryk (7 psi) for langsigtede time-lapse eksperimenter (~ 3 timer). Dyr immobiliseret under membranen efter udsætningen blev efterladt i den samme anordning i den mellemliggende tid. Disse dyr kan sammenlignes med vildtype i både udviklingen og generelle sundhedstilstand. Voksen C. elegans immobiliseret med lavere tryk (7 psi) viste langsom respons må i løbet høj opløsning time-lapse eksperimenter og kræver komplekse analyseværktøjer til transport analyse. Men lavere tryk blev anvendt til at udføre mere langsigtede undersøgelser såsom Q neuroblast celledeling / migration over ~ 3 timer eller semikvantitativ mitochondria transport karakterisering, processer, der ikke har brug for fuldstændig immobilisering. Således lavere tryk for immobilisering kan anvendes afhængigt af datasættet, der skal indsamles.

Time-lapse billeder af L4 C. elegans viser saltatory bevægelse af GFP mærket mitochondrier i ALM neuron (stamme jsIs609), som er blevet rapporteret for neuroner i andre modelsystemer 30-32. Nogle mitokondrier i disse neuroner viser tovejs transport, mens de fleste af dem er stationære gennem hele filmen. På trods af de små forskelle i flux vi fortsætte med at bruge 14 psi immobilisering tryk i tilfælde af C. elegans at opnå fuldstændig immobilisering og undgå enhver tendens i løbet af høj opløsning time-lapse imaging af axonal transport. Vi foreslår anvendelse af 14 psi i en generel protokol, og afhængigt af eksperimentelle behovene dette kan enten forøges eller formindskes. Dyr tog næsten samtidigt at vende tilbage til normal locomotion fra både lavere og højere immobilisering pres og immobiliserede dyr udviklede identisk med dem, der dyrkes uden immobilisering.

Enheden, når den fremstilles under anvendelse af større dimensioner med spacer-lag kan anvendes til større modelorganismer, såsom Drosophila og zebrafisk larver. Billeddannelse af synaptotagmin.eGFP transport i intakte 1. Stadiums Drosophila sensoriske neuroner viser aktiv transport i både anterograd og retrograd retninger. De gennemsnitlige hastigheder målt i enheden immobiliseret larver højere i forhold til de målte værdier i dissekerede motorneuroner 22. Denne forskel kan skyldes hurtigere erhvervelse af data i vores eksperimenter (5 Hz v / s 1,1-1,4 Hz), neuron-specifikke forskelle i organel transport (sensorisk v / s motoriske neuroner) og / eller virkninger som følge af dissektion.

Vores tidligere eksperimenter blev udført udelukkende i vildtypedyr 4, således vi stilling til, ombilleddannende mutanter i mikrofluidenheder var også fordelagtig. Time-lapse imaging af C. elegans L4 dyr viser reduceret flux af GFP :: RAB-3 mærkede præsynaptiske vesikler i kinesin3/unc-104 mutanter immobiliseret i 1,0 mM levamisol i forhold til flux målinger opnået i dyr er immobiliseret ved hjælp af vores PDMS-enhed (figur 3B). Vi har ofte observeret og viser et eksempel (figur 3C), som i mutanter meget ringe transport kan observeres, hvis dyrene er immobiliseret ved hjælp af anæstetiske koncentrationer, immobilisere vildtypedyr. Antallet af vesikler bevæger sig i UNC-104 dyr, er signifikant højere, når vi bruger mikrofluidenheder. Bedøvede dyr viser lignende transportegenskaber når det anbringes under 14psi tryk, PDMS membranen (figur 3B). Lignende bemærkninger er også blevet gjort i vildtypedyr 4. Disse data tyder på, at den øgede flux ikke risikerer at opstå fra immobilisering under nitrogen, men på grund af en protokol, der var mindre skadelige for intra-cellulære transport.

I princippet kan andre arrangementer såsom calcium dynamik og celledeling alle afbildes i intakte Drosophila / zebrafisk larver samt. Post-imaging genvinding af enheden immobiliserede dyr er mindre skadelige for organismen levedygtighed 4 og således sådanne indretninger kan også anvendes til at udføre langvarig billeddannelse af genetiske model genetiske organismer for hændelser, der sker over længere tidsintervaller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Krishanu Ray til Drosophila aktier, Tarjani Agarwal for at opretholde en Drosophila bur, Peter Juo for nuIs25 og CGC for C. elegans stammer. SPK lavet jsIs609 i Michael Nonet laboratorium. Vi takker Arpan Agnihotri (BITS Pilani) for hans hjælp i time-lapse imaging af mitokondrier transport af jsIs609 dyr i mikrofluidenheder. Vi er taknemmelige for Dr. Vatsala Thirumalai og Surya Prakash for at forsyne os med zebrafisk embryoner. Vi takker Dr. Krishna og CIFF på NCB'erne til brug af spinning disc konfokal mikroskop støttet af Ministeriet for Videnskab og Teknologi-Centre for nanoteknologi (nr. SR/55/NM-36-2005). Vi takker også Kaustubh Rau, V. Venkatraman og Chetana Sachidanand for drøftelserne. Dette arbejde blev finansieret af DBT postdoktoralt stipendium (SM), DST fast-track ordning (SM) og en DBT tilskud til (SPK). SA blev støttet af DST og CSIR tilskud til SPK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafers University wafer 150 mm (100) Mech Grade SSP Si
Clewin Software WieWeb software Version 2.90
Laser plotter Fine Line Imaging 65,024 DPI
HMDS Sigma-Aldrich 440191-100ML
SU8 Microchem SU8-2025, SU8-2050
Developer Microchem SU8 Developer
Silane Sigma-Aldrich 448931-10G
PDMS Dow corning Sylgard 184
UV lamp Oriel 66943 200W Hg Oriel Light
Hot air oven Ultra Instruments Custom made Set at 50 °C
Hot plate IKA Laboratory Equipment 3810000 http://www.ika.com
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Spinner Semiconductor Production Systems SPIN150-NPP www.SPS-Europe.com
Glass cover slip Gold Seal 22 X 22 mm, No. 1 thickness
C. elegans Caenorhabditis Genetics Center (CGC) e1265, ayIs4
Drosophila Bloomington P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP
Zebrafish Indian wild type Wild type
Tygon tube Sigma Z279803
Micro needle Sigma Z118044 Cut into 1 cm pieces
3-way stopcock Sigma S7521
Harris puncher Sigma Z708631
Compressed nitrogen gas Local Gas supplier Use a regulator to control the pressure
Stereo microscope Nikon SMZ645
Confocal microscope Andor Olympus Yokogawa spinning disc confocal microscope
ImageJ National Institutes of Health www.rsbweb.nih.gov/ij Java based image processing program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  2. Guo, S. X. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
  3. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5, 1888-1902 (2010).
  4. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
  5. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat. Methods. 5, 637-643 (2008).
  6. Allen, P. B. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. J. Neurosci. Methods. 173, 20-26 (2008).
  7. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
  8. Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F. Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13891-13895 (2007).
  9. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab Chip. 7, 1515-1523 (2007).
  10. Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation. Lab Chip. 8, 653-656 (2008).
  11. Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9, 151-157 (2009).
  12. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
  13. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  14. Snow, J. J. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat. Cell Biol. 6, 1109-1113 (2004).
  15. Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95, 905-928 (1980).
  16. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nat. Neurosci. 2, 791-797 (1999).
  17. Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila melanogaster larvae. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 140, 363-376 (2005).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  19. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
  20. Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 153, 91-98 (2011).
  21. Fatouros, C. Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Hum. Mol. Genet. , (2012).
  22. Barkus, R. V., Klyachko, O., Horiuchi, D., Dickson, B. J., Saxton, W. M. Identification of an axonal kinesin-3 motor for fast anterograde vesicle transport that facilitates retrograde transport of neuropeptides. Mol. Biol. Cell. 19, 274-283 (2008).
  23. Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Lab. Anim. (NY). 35, 41-47 (2006).
  24. Pardo-Martin, C. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).
  25. Stainier, D. Y., Lee, R. K., Fishman, M. C. Cardiovascular development in the zebrafish. I. Myocardial fate map and heart tube formation. Development. 119, 31-40 (1993).
  26. Hall, D. H., Hedgecock, E. M. Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans. Cell. 65, 837-847 (1991).
  27. Kumar, J. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6, e1001200 (2010).
  28. Ou, G., Vale, R. D. Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts. J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).
  29. Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
  30. Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth. J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).
  31. Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).
  32. Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).

Tags

Bioengineering Molecular Biology Neuroscience Microfluidics, zebrafisk larver anæstetiske præ-synaptiske vesikel transport dendritiske transport af glutamatreceptorer mitochondrial transport synaptotagmin transport hjerteslag
Simple mikrofluidenheder for<em&gt; In vivo</em&gt; Scanning af<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Og zebrafisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika,… More

Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish. J. Vis. Exp. (67), e3780, doi:10.3791/3780 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter