Multimodal Imaging van Stem Cell implantatie in het centrale zenuwstelsel van Muizen

Summary

Dit artikel beschrijft een optimale volgorde van de gebeurtenissen voor de multimodale beeldvorming van cellulaire grafts in knaagdier hersenen met behulp van: (i) in vivo bioluminescentie en magnetische resonantie beeldvorming, en (ii) post mortem histologische analyse. De combinatie van deze beeldvorming op een enkel dier laat cellulaire graft evaluatie met een hoge resolutie en gevoeligheid en specificiteit.

Abstract

In de afgelopen tien jaar heeft stamceltransplantatie kreeg steeds meer interesse als primaire of secundaire therapeutische modaliteit voor een verscheidenheid van ziekten, zowel in de preklinische en klinische studies. Echter, tot op heden de resultaten met betrekking tot functioneel resultaat en / of weefsel regeneratie volgende stamceltransplantatie zijn zeer divers. Over het algemeen wordt een klinisch voordeel waargenomen, zonder diepgaande kennis van het onderliggende mechanisme (s) ^1. Daarom hebben meerdere inspanningen geleid tot de ontwikkeling van verschillende moleculaire beeldvormende technieken om stamcellen enten met het uiteindelijke doel om nauwkeurig te evalueren overleven, het lot en de fysiologie van geënte stamcellen en / of hun micro-omgeving te bewaken. Veranderingen waargenomen in een of meer parameters bepaald door moleculaire beeldvorming kan worden gerelateerd aan de waargenomen klinisch effect. In deze context, onze studies richten zich op het gecombineerd gebruik van bioluminescentie (BLI), magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en histologische analysis om stamcel transplantatie te beoordelen.

BLI wordt vaak gebruikt om niet-invasief te voeren cel volgen en te controleren overleving van de cel in de tijd na de transplantatie ^2-7, op basis van een biochemische reactie waarbij cellen die de Luciferase-reporter-gen in staat zijn om licht volgende interactie uit te stoten met zijn substraat (bijv. D- luciferine) ^{8, 9.} MRI anderzijds een niet-invasieve techniek die klinisch toepassing ¹⁰ en kan worden gebruikt om nauwkeurig cellulaire grafts lokaliseren met zeer hoge resolutie ^11-15 hoewel de gevoeligheid sterk afhankelijk van het contrast gegenereerd na labeling cel met een MRI contrastmiddel . Tot slot, post-mortem histologische analyse is de methode bij uitstek om onderzoeksresultaten verkregen met niet-invasieve technieken met de hoogste resolutie en gevoeligheid te valideren. Bovendien eindpunt histologische analyse laat ons toe om uit te voeren gedetailleerde fenotypische analyse van geënte cellen en / of het omliggende weefsel, based op het gebruik van fluorescerende reporter eiwitten en / of direct cel labeling met specifieke antilichamen.

Samenvattend kunnen we hier visueel tonen de complementariteit van BLI, MRI en histologie aan verschillende stamcel-en / of milieu-gerelateerde kenmerken na stamcel transplantatie in het CZS van muizen te ontrafelen. Als voorbeeld beenmerg-afgeleide stromacellen, genetisch gemanipuleerd om de versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) en vuurvlieg luciferase (fluctuaties), en voorzien van blauw fluorescerende microscopisch kleine ijzeroxide deeltjes (MPIOs) drukken, worden geënt in de CNS van immuun-competente muizen en het resultaat zal worden gecontroleerd door BLI, MRI en histologie (figuur 1).

Protocol

1. Celpreparaat

1. Experimenten dient te worden gestart met behulp van ex vivo gekweekte stamcellen populaties genetisch gemanipuleerd om de Luciferase en eGFP reporter eiwitten uit te drukken. Hier gebruikt Luciferase / EGFP-expressie muizen beenmerg-afgeleide stromacellen (BMSC-Luc/eGFP) zoals eerder beschreven door Bergwerf et al.. ^{2, 5.}
2. Twee dagen voor cel etikettering plaat BMSC-Luc/eGFP cellen een dichtheid van 8 x 10 ⁵ cellen per T75 fles cultuur in 15 ml compleet medium expansie (CEM) aangevuld met 1 ug / ml Puromycine.
3. Laat cellen gedurende 48 uur toenemen bij 37 ° C en _5% CO2.
4. Voeg 5 x 10 ⁶ Glacial Blue microscopisch kleine deeltjes ijzeroxide (GB MPIO) per ml cultuur medium om de groeiende cel cultuur (totaal: 75 x 10 ⁶ deeltjes per 15 ml kweekmedium in een T75 cultuur kolf).
5. Incubeer gedurende 16 uur om de deeltjes opname via endocytose toe te staan.
6. Was de weg resterende deeltjesen laat cellen groeien gedurende 24 uur aan cel confluentie en homogene verdeling van het GB MPIO verkrijgen.
7. Visueel valideren deeltjes opname met fluorescentiemicroscopie door het tellen van de verhouding van EGFP + en GB MPIO + cellen de totale hoeveelheid van EGFP + cellen.
8. Wash GB MPIO-gelabelde BMSC-Luc/eGFP cellen twee keer met 10 ml PBS en oogst cellen na trypsine-EDTA-behandeling (5 ml per T75 cultuur kolf gedurende 5 minuten).
9. Was geoogste cellen en hersuspenderen van eindconcentratie van 133 x 10 ⁶ cellen / ml in PBS.
10. Houd cellen op ijs tot transplantatie.

2. Cel implantatie in het CZS van Muizen

1. Verdoof muizen door een intraperitoneale injectie van een ketamine (80 mg / kg) + xylazine (16 mg / kg) mengsel.
2. Wacht 5 minuten zodat muizen in slaap te vallen.
3. Scheer met de muis hoofd toe te staan ​​voor steriele manipulaties.
4. Plaats de muis in een stereotactische frame.
5. Ontsmetten van dehuid en nat de ogen van de muizen om uitdroging te voorkomen.
6. Maak een middellijn hoofdhuid incisie aan de schedel bloot te leggen, en boor een gat in de schedel met een tandartsboor braam op de aangegeven coördinaten: 2 mm achter en 2 mm lateraal van bregma.
7. Vortex de celsuspensie kort en zuig de celsuspensie in de spuit.
8. Plaats de naald op een diepte van 2,5 mm onder de dura en laat de druk equilibratie gedurende 1 minuut.
9. Injecteer 3 pi celsuspensie (4 x 10 ⁵ cellen) op een diepte van 2 mm onder de duur en met een snelheid van 0,70 pl / min met een automatische micro-injectie pomp.
10. Wacht nog 5 minuten om terugstromen van de geïnjecteerde celsuspensie voorkomen.
11. Langzaam trekken de naald en desinfecteren van de huid grenzen van voor het hechten van de huid.
12. Subcutaan injecteren 300 pi 0,9% NaCl-oplossing om uitdroging te voorkomen, en plaats de muis onder een warmtelamp om te herstellen van anesthesie. Dien post-operatieve analgeticum in overeenstemming met de institutionele normen.

3. In vivo Bioluminescentie

1. Verdoven de muizen door een mengsel van 3% isofluraan en zuurstof.
2. Plaats de muizen in de Photon imager en vermindering van anesthesie-niveau tot 1,5% isofluraan en zuurstof.
3. Injecteer 150 mg D-luciferine per kg lichaamsgewicht intraveneus.
4. Ontvangen van het beeld gedurende 5 minuten met behulp van de Photo Vision software.
5. Voer beeldverwerking met behulp van de M3vision software. Kwantificeer het waargenomen signaal met behulp van een vaste regio's van belang.

4. In vivo magnetische resonantie beeldvorming

1. Verdoven de muizen met 3% isofluraan in een mengsel van O _2: N ₂ O (3:7).
2. Plaats de muizen in de restrainer een horizontale 9.4 Tesla MR, de vermindering anesthesie niveau 1% isofluraan in een mengsel van O _2: N ₂ O (3:7).
3. Maak de ogen van de muizen om uitdroging te voorkomenTIE, bevestig een rectale sonde om de lichaamstemperatuur te controleren en de ademhaling te controleren door het plaatsen van een sensor onder de muis buik.
4. Houd ademhaling bij 110 ± 10 ademhalingen per minuut en houdt de lichaamstemperatuur constant binnen een nauwe bandbreedte van 37 ± 0,5 ° C.
5. Plaats het oppervlak RF spoel op de muis kop en de positie van de muis in het midden van de magneet.
6. Schaf een set van 10 coronale T2-gewogen spin-echo (SE) beelden op specifieke anatomische informatie en T2 *-gewogen gradient echo (GE) beelden te verkrijgen om stamcelmigratie studeren met een in-plane resolutie van 70 micrometer ^2. Stel sequentie parameters als volgt: repetitietijd (TR): 500 ms, echo tijd (TE): 8 ms (GE sequentie) en repetitietijd (TR): 4200 ms, echo tijd (TE): 12,16 ms (SE volgorde); gezichtsveld (FOV): 18x18 mm ^2, matrix: 256x256, 1 mm slice dikte en 1 mm slice scheiding (Paravision 5.1 software).
7. Voer gegevensverwerkingmet Amira 4.0 software.

5. Post Mortem Histologie

1. Verdoof de muizen heel diep door inademing van een isofluorane (4%), zuurstof (0,5 L / min) en stikstof (1 L / min) mengsel gedurende 2 minuten. Offer de muizen door cervicale dislocatie.
2. Verwijder muizenhersenen van de schedel en fixeren het hersenweefsel in 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 2 uur.
3. Dehydrateer het hersenweefsel door het plaatsen van de hersenen vervolgens in verschillende gradiënten van sucrose: 2 uur in 5% sucrose in PBS, 2 uur bij 10% sucrose in PBS, 's nachts in 20% sucrose in PBS.
4. Bevries hersenweefsel met vloeistof stikstof en opslaan het weefsel bij -80 ° C tot snijden.
5. Sectie het hersenweefsel bij 10 micrometer dikke panelen met behulp van een cryostaat.
6. Scherm onbesmet vriescoupes voor blauwe fluorescentie van de GB MPIO deeltjes en groene fluorescentie van de eGFP uiten cellen met behulp van een fluorescentie microscoop.
7. Scherm ongekleurd vriescoupes voorgroen / rode achtergrond fluorescentie van ontstekingscellen.
8. Voer verder immunohistochemische en immunofluorescentie kleuringen aan endogene celpopulaties (bijv. microglia, astrocyten, T-cellen, ...) de interactie met cellulaire grafts te identificeren.

6. Representatieve resultaten

Wij hier visueel voorgesteld een optimale volgorde van de gebeurtenissen voor een succesvolle multimodale beeldvorming van Luciferase / eGFP-expressie (stam) cel populaties in het CZS van muizen. Eerst de beschreven GB MPIO kenmerken procedure resulteert in zeer efficiënte labeling van BMSC-Luc/eGFP cellen, die gemakkelijk kan worden bevestigd met fluorescentiemicroscopie (Figuur 2A). Vervolgens bij het ​​enten van GB MPIO BMSC-Luc/eGFP gekenmerkt het CZS van muizen kunnen overleven van de cellen graft worden gecontroleerd door in vivo BLI gebaseerd op luciferase-activiteit (Figuur 2B). Daarnaast kan de exacte ligging van getransplanteerde cellen worden gecontroleerd door in vivo (Figuur 2C). Tot slot, histologische analyse maakt het mogelijk de validering van de resultaten van BLI en MRI. Stabiele overleving werd bevestigd door een stabiele eGFP uitdrukking in de tijd (Figuur 2D). Voor deze, colokalisatie van EGFP-expressie cellen met blauwe fluorescerende MPIO staat voor de exacte bepaling van de lokalisatie en de overleving van de getransplanteerde cellen. Bovendien is deze twee fluorescerende kenmerken van de stamcellen vermindert de kans op vals-positieve resultaten gebaseerd op fluorescentie achtergrond die door inflammatoire cellen ⁵ nemen.

Figuur 1. Overzicht van de behandeling volgorde

1. Cell etikettering: BMSC-Luc/eGFP zijn voorzien van 5 x 10 ⁶ GB MPIO deeltjes per ml kweekmedium. Na 16 uur incubatie en een volgende rusttijd van 24 uur werden cellen geoogst voorintracerebrale implantatie.
2. Cell implantatie: GB MPIO gelabeld BMSC-Luc/eGFP zijn geënt in de hersenen van muizen op de volgende coördinaten: bregma -2 mm, 2 mm rechts van de middellijn en 2 mm onder dura.
3. In vivo BLI: Na intraveneuze toediening van 150 mg D-luciferin/kg lichaamsgewicht, werd het gegenereerde licht verworven gedurende 5 minuten met behulp van de Photon Imager.
4. In vivo MRI: Een set van 10 coronale T2-gewogen spin-echo (SE) beelden en T2 *-gewogen gradient echo (GE) beelden met een in-plane resolutie van 70 micrometer ² werden verworven. Sequence parameters waren als volgt: repetitietijd (TR): 500 ms, echo tijd (TE): 8 ms (GE sequentie) en repetitietijd (TR): 4200 ms, echo tijd (TE): 12,16 ms (SE volgorde); gezichtsveld (FOV): 18x18 mm ^2, matrix: 256x256, 1 mm slice dikte en 1 mm slice scheiding.
5. Post-mortem histologie: 10 pm dik cryosection werden gescreend op eGFP uiten en blauw fluorescent gelabelde BMSC uzingen een fluorescentie microscoop.

Figuur 2. Multimodale beeldvorming van stamcel transplantatie

1. Directe immunofluorescentie microscopie van Glacial blauw (GB) MPIO gelabeld BMSC-Luc/eGFP.
2. In vivo BLI van muizen geïnjecteerd met 4x10 ⁵ GB MPIO BMSC-Luc/eGFP cellen gelabeld in week 1 en week 2 na de implantatie. Statistische analyse van de gevonden BLI signalen in week 1 en week 2 na de implantatie. Gegevens zijn uitgedrukt als gemiddelde aantal fotonen per seconde per steradiaal per vierkante centimeter (ph / s / sr / cm ²⁾ van 5 minuten tijd + / - standaardafwijking berekend op een vaste gebied van belang in muizen met een duidelijk BLI signaal op de injectieplaats.
3. Coronale tweedimensionale MRI van GB MPIO gelabeld BMSC-Luc/eGFP (linker paneel: (i) T2-gewogen spin-echo-beeld en (ii) T2 *-gewogen gradiënt echo beeld) en niet-gemerkte BMSC-Luc / eGFP (rechterkant van het scherm: (iii) T2-gewogen spin-echo-beeld en (vi) T2 *-gewogen gradiënt echo beeld) transplantaten in de hersenen van muizen.
4. Histologische analyse van de GB MPIO BMSC-Luc/eGFP implantaten label in week 2 na de implantatie. (I) Directe immunofluorescentie-analyse voor het lokaliseren van eGFP-expressie en GB MPIO gelabeld BMSC-Luc/eGFP enten. (Ii) hoge vergroting detail van (i). (Iii) Immunofluorescente kleuring voor GFAP antigeen, met vermelding van de ontwikkeling van astrocytaire littekenweefsel in de omgeving van GB MPIO gelabeld BMSC-Luc/eGFP. (Vi) Immunofluorescente kleuring voor Iba-1 antigeen, met vermelding van de invasie en de omgeving van GB MPIO gelabeld BMSC-Luc/eGFP door microglia.

Discussion

In dit rapport beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor de combinatie van drie elkaar aanvullende beeldvormende technieken (BLI, MRI en histologie) voor gedetailleerde karakterisering van cellulaire implantaten in het CZS van immuun-competente muizen. Een combinatie van reportergen etikettering van de cellen, op basis van genetische modificatie met de reporter genen Firefly luciferase en eGFP, en een direct cel etikettering met GB MPIO, leidt tot een nauwkeurige beoordeling van de stamcellen grafts in vivo.

Voor deeltjes kenmerken van BMSC wordt de GB MPIO deeltjesgrootte (1.63μm) in combinatie met de anionogene oppervlakteactieve (carboxyl vervangende) voorgesteld endocytotische opname van deze deeltjes vergemakkelijken niet fagocyten ^16-18. Er moet echter worden vermeld dat de incubatietijd van hoge labelingsefficiëntie te verkrijgen is celtype afhankelijk. Bijvoorbeeld fagocyten (zoals macrofagen en dendritische cellen) kunnen deze deeltjes internaliseren sneller (incubatietijd van 0,5 - 1 uur) vergeleken met niet-phaghocytic celtypen (zoals BMSC of neurale stamcellen), die een incubatietijd van minimaal 16 uur voor een efficiënte labeling nodig. Dit moet rekening worden gehouden tijdens het uitvoeren van cel etikettering experimenten en de efficiëntie van de etikettering moeten altijd vooraf worden bepaald met behulp van fluorescentie microscopie en / of flowcytometrische analyse. Als de etikettering van celpopulaties met GB MPIOs heeft geen invloed op levensvatbaarheid van de cellen, celproliferatie of cel fenotype ^5, de combinatie van ijzeroxide en het fluorofoor in deze deeltjes creëert dan ook een ideale gelegenheid om ze te visualiseren zowel door middel van MRI en optische beeldvorming. Bovendien, door het hoge ijzergehalte en grote deeltjes, kunnen MPIO deeltjes worden gebruikt cel ^12,19,20 en afzonderlijke deeltjes beeldvorming ²¹ van MRI. Dit is zeer interessant als het gaat om celmigratie te studeren als enkele cellen kunnen worden waargenomen. Echter, de hoge ijzergehalte van de gebruikte GB MPIOdeeltjes heeft ook bepaalde nadelen als doel de exacte grootte van het transplantaat site door MRI af te bakenen. De zeer hoge ijzergehalte van MPIOs zorgt niet alleen voor magnetische inhomogeniteiten op het implantaat, maar ook in de omgeving van de cellulaire implantaat, wat resulteert in een overschatting van het implantaat volume en een minder nauwkeurige discriminatie tussen de geïmplanteerde cellen en het omringende weefsel. Bijgevolg type deeltje, nodig voor cel labeling, afhankelijk van de onderzoeksopzet. Als doel voor stamcelmigratie een zeer hoge gevoeligheid en dus hoge ijzerhoudende MPIOs nodig bepalen. Anderzijds kan als doel voor de nauwkeurige plaatsbepaling van stamcellen grafts kleiner SPIOs met een lager ijzergehalte een beter alternatief ^22. Bovendien ijzerdeeltjes genereren negatieve contrast introduceren van een ander probleem met betrekking tot de discriminatie tussen de geïmplanteerde cellen en bloeden na cel enten. Daarom is veel onderzoek gaatop naar het gebruik van positieve contrastmiddelen voor cel-etikettering. Naast het deeltje type, de soort die wordt gebruikt voor het verkrijgen MRI hangt ook van het doel van het onderzoek. Bij MRI wordt gebruikt om het implantaat bakenen nauwkeurige informatie over de positie van het implantaat en het implantaat volume, T2 sequentie te verkrijgen (spin-echo) gunstig omdat het anatomische informatie met grote nauwkeurigheid. Aan de andere kant T2 * sequentie (gradiënt echo) een ren mogelijke migratie van getransplanteerde cellen bestuderen deze sequentie rekening houdt met alle inhomogenities van het magneetveld waardoor een hogere gevoeligheid voor verbindingen invloed van het magnetische veld. Deze volgorde is absoluut noodzakelijk wat betreft de detectie van een kleine hoeveelheid cellen die kunnen uit gemigreerd van de geïmplanteerde gebied. Met behulp van deze reeks konden we concluderen dat BMSC-Luc/eGFP cellen niet migreren na striatale implantatie in het CZS van muizen.

TerwijlMRI levert gegevens met betrekking tot cel implantaat lokalisatie, extra BLI analyse levert gegevens met betrekking tot cel implantaat overleven ^2,4,11. Aangezien de enzymatische reactie tussen het luciferase-enzym en het substraat luciferine heeft de aanwezigheid van ATP O ₂ is een betrouwbare techniek celoverleving bestuderen. Necrotische cellen niet uit het luciferase-enzym en geen _O2 en ATP aanwezig. Bovendien kunnen alleen cellen die de luciferase-enzym kunnen de reactie te katalyseren, waardoor de produktie van licht, die lijkt op de hoge gevoeligheid van de techniek. BLI kan op kwantitatieve wijze door het aantal geproduceerde licht is evenredig met de hoeveelheid luciferaseactiviteit-expresserende cellen. Echter belangrijke overwegingen moet worden gehouden tijdens het uitvoeren BLI kwantitatief verschillende factoren dan cel hoeveelheden kunnen de expressie van luciferase of de hoeveelheid gedetecteerd licht beïnvloeden. Bijvoorbeeld anesthesieen niveau invloed het luciferase-enzym en / of de luciferine beschikbaarheid ²³ verschillende factoren en verbindingen kan het substraat beschikbaarheid en / of opname ^24-26 of promoter ^27-30 beïnvloeden, resulterend in verschillen in signaaluitgang. Bovendien dient het gebruik van BLI beperkt is tot kleine dieren de techniek wordt beperkt tot lage penetratie van licht. Dus als gericht op kwantitatieve BLI te volgen overleving van de cel na de transplantatie, alle parameters mogelijk van invloed zijn signaal variaties uit te voeren moet worden gehouden als standaard mogelijk te maken. Bijvoorbeeld, implantatie diepte van cellulaire enten, anesthesie-niveau en toedieningsweg / bedrag van de ondergrond wordt toegediend vóór de BLI overname, een goede scheren van de huid van het dier, enz.

Rekening houdend met de hierboven beschreven voor-en nadelen van moleculaire beeldvorming, de behaalde resultaten altijd moeten worden gevalideerd door histologische analyse. Hierbij varioons cellulaire fenotypes en cellulaire interacties tussen verschillende soorten cellen kunnen worden gevisualiseerd met de hoogste gevoeligheid post mortem. Hoewel deze techniek is de validatie gereedschap van de aanwezigheid van achtergrond fluorescentie die door inflammatoire cellen omringende en / of invasie de graftlocatie moet worden beschouwd, aangezien dit zou kunnen leiden tot vals-positieve resultaten. Het gebruik van een dubbele labeling met een fluorescerende reportergen, zoals EGFP, en een fluorescerende, zoals GB MPIO, verkleint de kans misidentificatie (bijvoorbeeld getransplanteerde cellen te tonen beide specifieke fluorescences zonder weergegeven achtergrond fluorescentie in irrelevant licht kanalen).

Samenvattend, terwijl BLI een unieke techniek celoverleving in tijd in een kwantitatieve wijze met zeer hoge gevoeligheid maar lage resolutie bewaken MRI de techniek keuze de lage resolutie verkregen met BLI overwinnen. Combinatie van deze in vivo technischevragen maakt voldoende informatie over overleving en localisatie van getransplanteerde cellen in vivo in niet-invasieve wijze. Ten slotte kunnen cellulaire graft interacties met het omliggende weefsel en / of endogene inflammatoire cellen gemakkelijk post mortem worden gecontroleerd met behulp van histologie. Hoewel, op het moment, de laatste moet nog worden gedaan door histologische analyse, zal de belangrijkste uitdagingen voor de toekomst zijn om verbetering van bestaande in vivo moleculaire beeldvorming, zodat real-time beoordeling van de parameters met dezelfde resolutie en gevoeligheid als verkregen met behulp van histologische analyse.