Nanodisc脂質粒子にABCトランスポーターの再構成のためのステップ·バイ·ステップ方式

Summary

Nanodiscsはリン脂質二重層の小さなパッチに膜タンパク質を組み込んだ小さな円盤状の粒子である。我々は、ディスクへのMalFGK2ポーターのステップ·バイ·ステップの取り込みを示し視覚プロトコルを提供します。

Abstract

nanodiscは、円盤状の粒子（〜10月12日NM大）リン脂質二重層の小さなパッチにトラップ膜タンパク質ということです。 nanodiscは特にリガンド - 受容体相互作用の文脈では、膜タンパク質を研究するために特に魅力的な選択肢である。 Sligarらによって開拓方法はアポリポタンパク質A1由来組み換え高ヘリカル足場タンパク質の両親媒性の性質に基づいている。極地は、水性環境に直面し、一方足場タンパク質の疎水性面は、脂質二重層の脂肪アシル側鎖と相互作用する。粒子が小さく、均質かつ水溶性であるためnanodiscsにおける膜タンパク質の解析がリポソーム上の重要な利点を持っています。また、通常は水溶性タンパク質に予約生化学的および生物物理学的手法を適用し、膜のいずれかの側からすることができます。この視覚的なプロトコルでは、我々はよく特性のステップ·バイ·ステップの再構成を提示terized細菌のABCトランスポーター、男性MalFGK ₂複合体。ディスクの形成は、洗剤の進歩的な除去の際に行われている疎水性相互作用に依存して自己組織化プロセスである。私たちは本質的な手順を説明し、私たちは集合体と大きい多分散リポソーム状粒子の形成を制限するために、正しいタンパク質対脂質比を選択することの重要性を強調。単純な品質は、そのようなディスクが正しく再構成されていることを確認し、ゲル濾過クロマトグラフィー、天然ゲル電気泳動および動的光散乱分光法として制御します。

Protocol

全体の再構築プロセス

再構成プロセスは、洗剤で可溶化したリン脂質の存在下で精製MalFGK ₂複合体と膜骨格タンパク質（MSP）を混合することによって開始されます。ステップは、Bio-ビーズまたはアンバーライト（ 図1）と呼ばれるポリスチレン系吸着材による洗剤の遅い除去のあとに続いています。自動組立工程が原因疎水性リン脂質、MalFGK ₂錯体とMSP両親媒性タンパク質の表面との間の非極性相互作用の可能性が高くなります。最終製品はMalFGK ₂錯体を包み込むMSPの2分子からなる円盤状の粒子である。粒子は、超遠心分離および分析用サイズ排除クロマトグラフィーにより付加物および凝集体から分離される。粒子はネイティブゲル電気泳動および動的光散乱分光法によって特徴付けられる。

膜足場タンパク質、MSPのタイトル "> 1。準備

1. hisタグMSPは、（バージョンMSP1D1 ^1） 大腸菌におけるプラスミドpMSP1D1から生産され大腸菌 BL21（DE3）OD ₆₀₀に誘起〜0.5mMのイソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシドを37℃で3時間℃で0.5
2. 細胞は4℃で10分間5000×gで℃で遠心分離により回収し、100μMフェニルメタンスルホニルフッ化物を含むTSG10バッファーに再懸濁する。
3. セルが8000 psiでフレンチプレス（3×）で溶解させ、不溶物を4℃で10分間5000 xgで遠心分離により除去されるMSPを含む可溶性画分を45分間125000×gで超遠心分離によって分離されています。
4. MSPは、ニッケルキレートクロマトグラフィーTSG10バッファに〜1.5ミリリットルNiセファロースHPを用いて精製する。汚染物質を、50mMイミダゾールを含むTSG10バッファーで洗い流される。 MSPは600 mMを含むTSG10緩衝液で溶出されイミダゾール。精製したタンパク質はTSG10バッファに透析し、10月15日〜mg / mlのタンパク質濃度で-70℃に保存されています。

2。 MalFGK ₂複合体の調製

1. MalFGK ₂複合体は、MalKのC末端にHisタグ、 大腸菌におけるプラスミドpBAD22-FGKから発現される大腸菌 BL21（DE3）およびOD ₆₀₀に誘起〜37℃で3時間で0.2％のL-アラビノース℃で0.5
2. ステップ1.3のように、細胞溶解及び遠心分離後、膜ペレットを5 mg / mlの最終濃度でTSG20バッファーに再懸濁する。材料は、穏やかに振盪しながら4℃で3時間1％w / vのn-ドデシル-β-マルトピラノシド（DDM）℃で可溶化する。
3. 不溶性物質は、ステップ1.3および可溶化を含む上清のように超遠心分離により除去される MalFGK ₂複合体を回収し、精製工程1.4のように、しかし、透析せずにされています。
4. Furtherの浄化をSuperdex 200 HR 10 / 0.5ml /分の流速で300カラムでTSGDバッファーでゲルろ過クロマトグラフィーによって達成される。

3。リン脂質の調製

1. E.クロロホルムに溶解させた大腸菌総脂質抽出物は、スクリューキャップマイクロチューブは1,000 nmolのアリコートに分けられます。溶媒を窒素気流下で蒸発させ、真空デシケーター中でさらに一晩乾燥させる。
2. 脂質膜は、5 nMの最終濃度でTSバッファに溶解し、激しくボルテックスや超音波処理する。溶解した脂質が原因で水性TSバッファにおける彼らの一般的な不溶性に若干不透明に見えるでしょうが、彼らは、懸濁液のままにしてください。 DDMは、溶液が透明になる時0.5％（〜10mm）の最終濃度に添加される。
3. 脂質混合物を約5秒間5回超音波処理し、水浴及びパルスに配置されます。脂質混合物を1おしっこの最大4℃で保存されているK。

4。バイオビーズの調製

1. 約10〜15ミリリットル（乾燥体積）バイオビーズを50mlチューブに入れています。
2. ビーズを順次100％メタノール、95％エタノール、ミリQ H ₂ O、および最終的にTSバッファ（二回）50mlで洗浄されています。
3. 洗浄したビーズは、4℃で保存するC〜10ミリリットルTSバッファインチ

5。 Nanodisc再構成

1. MSPは〜7 mg / mlの（〜0.3 mM）の最終濃度でTSGD緩衝液中で希釈されています。
2. MSP：TSGDバッファ内1:3:60または1:3:400の脂質比精製MalFGK ₂複合体の約2 nmolのはタンパク質で混合される。最終濃度は6μmMalFGK _2、18μMのMSPおよび360μMの脂質（1:3:60）または2.4 mMの脂質（1:3:400）です。最終容量は300μlです。最終DDMの濃度は0.08％（〜1.6 mm）です。グリセロールの最終濃度は脂質の量に依存する追加されましたが、周りに5から10パーセントV / Vのまま 〜バイオビーズ懸濁液50μlをチューブに添加し、混合物を4℃で揺動テーブルの上に一晩インキュベートする。
3. ビーズは、重力により沈降し、溶液を、できるだけ多くのバイオビーズを避けるために、狭い先端から分注される。
4. 沈殿大は20分間100,000×gで超遠心分離により除去される。ディスクはTSG10バッファ内のステップ2.4​​のようにゲルろ過クロマトグラフィーにより精製される。ディスクを含む画分をプールし、アリコート製剤の安定性をテストするために、同じゲル濾過カラムに再注入する必要があります。
5. 精製されたディスクは、長時間にわたって-70℃で保存することができます。氷の上で解凍後、ディスクは潜在的な沈殿物を除去するために、ステップ5.5のように、超遠心分離を行うべきである。アリコートは有意な凝集や沈殿が解凍時に発生しなかったことを確認するためにゲルろ過クロマトグラフィーで分析する必要がありますプロセス。

6。ネイティブゲル電気泳動

1. nanodiscsの1μM（〜0.2㎎/ ml）を再構成する（ 図3A）の品質を評価するためのネイティブPAGE ^6,7（トリス-HCl pH 8.8、4-12％）によって分析される。
2. ₂複雑なMalFGKに男性の結合（1μM）はnanodiscsで再構成はまた、未変性PAGE（ 図3A）により評価される。
3. 泳動後、ゲルを10分間クマシーブルーで染色されており、約1時間脱色した。

7。動的光散乱（DLS）

1. Nanodiscsを​​Superdex 200 HR 10 / 0.1ml /分の流速で300カラムを用いてTSG10バッファ内のステップ2.4​​のように、ゲルろ過クロマトグラフィーにより精製される。 nanodiscsを​​含む画分をプールし、アミコン遠心フィルターで〜10 mg / mlに集中している。
2. サンプルは使用DLSによって分析前（0.22μmフィルター）2回濾過さ1μlの内部体積石英キュベットでDynaPro nanostar楽器（ワイアットテクノロジー）。データは直径、粒子の分子量を推定するためにDynamicsソフトウェア（ワイアット·テクノロジー）を使用して装着されている。

8。 ATPase活性測定

1. MalFGK ₂ -再構成nanodiscsのATPase活性は比色分析^8を用い^て決定される。
2. 精製されたディスクと1mMのATP1μMのは20分間、男性と37℃での増加量と一緒に混合されています。無機リン酸塩の放出は660 nmで測定する。
3. 解放リン酸の量は、リン標準溶液を用いて作成した標準曲線と比較されます。

9。代表的な結果

nanodiscsは、ゲルろ過クロマトグラフィー（ 図2A、左 ）によって精製される。クロマトグラムを示し、その再構成されたdの過半数ISCS（黒のトレース）の単一ピークとして溶出し、一方、過剰な脂質（赤いトレース）ボイドボリュームに溶出して、広範な一連のピークとして作らディスク。 nanodiscsの質はさらに、ネイティブゲル電気泳動および動的光散乱法（DLS）によって分析されます。脂質の過剰の存在下で再構成されたものはスミア（ 図2A、右 ）のように移行するのに対し、適切に再構成されたディスクには、ゲル上の鋭いバンドとして移行されます。 DLSによる分析は、ディスクの人口は11.4 nmの（ 図2B）の平均粒径が均一であることを示しています。再構成されたディスクはDLS近似に基づいた215 kDaの見かけの分子量を有する。過剰な脂質の存在下で再構成したサンプルは、非均質な試料のために典型的である100nmであり、周囲に広く分布している半径を表示します。

MalFGK ₂複合体の質がATPアーゼによるネイティブ·ゲル電気泳動し、その活性によって評価される測定結果（ 図3）。マルトース結合タンパク質の男性はMalFGK ₂輸送^9,10への高親和性で結合する。非変性ゲル電気泳動を使用して、それは男性とMalFGK _2（ 図3A）との複合体を検出することが可能である。男性がMalK ₂ ATPase活性の刺激は、 図3Bに示されている。

図1。再構成プロトコルのための典型的なフローチャート。

図2。 nanodisc準備。Aの品質管理または高脂質比（1/3/400、赤いトレース）; nanodiscsのゲル濾過分析（スーパーデックス200 HR 10/300カラム）は、低脂質比（黒トレース1/3/60）で再構成した。同じディスクの準備のネイティブゲル電気泳動。モルkDaでecular量マーカーが表示されている。同じディスクの準備B.動的光散乱分析。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図3。 MalFGK ₂ nanodisc粒子の分析。A. MalFGK ₂ nanodisc粒子の量が増加するとともにインキュベート男性のゲルシフト解析。男性の濃度の関数としてMalFGK ₂ nanodisc粒子BのATPase活性。

Discussion

我々はnanodiscsにマルトーストランスポーターの再構成のための簡単​​な手順を説明します。トランスポーターは、ATPアーゼ活性であり、水溶性の結合パートナーの男性との相互作用が（ 図3）再現することができます。 nanodiscsにトランスポーターの成功した再構成には、追加の生物物理学的および生化学的解析のための道を開く。特に興味深いのは、体系的な分析洗剤、リポソームとnanodiscsでMalK ATPaseおよびマルトース輸送活性になります。 ABCトランスポーターは、トランスポート·サイクル中のコンフォメーションを変更しますが、これらのコンフォメーション変化に脂質の寄与が模索されていない。

nanodiscの製作は比較的簡単ですが、まだ最適な条件からのわずかなずれは、不可逆的なタンパク質凝集につながることができます。脂質の過剰量はproductioにつながるので、脂質比：本稿では、正しいタンパク質を選択することの重要性を強調nanodiscの生物物理学的な資格に応答しない大多分散リポソーム状粒子のn。マルトーストランスポーター（1/120我々の分析では1月20日と比較して）の再構成のための脂質の比率が、形成された粒子は、さらに^11を特徴付けていなかった：以前の分析は非常に高いMSPを採用。いずれにせよ、それは慎重に、そのような光散乱分光、分析超遠心またはもっと単純に、ネイティブゲル電気泳動、ゲル濾過以外の技法を用いて再構成された材料の品質を分析することが重要です。この品質管理の重要性は、バクテリオロドプシンおよびP-糖タンパク質¹²の再構成時に強調された。他の2つのパラメータが大幅に再構成の成功に影響を与える可能性があります：1）標的膜タンパク質の純度および凝集体と膜タンパク質と足場タンパク質間の2）正しい比率の不在。また、リン脂質の種類は、iを組み入れNTOディスクだけでなく、膜骨格タンパク質の長さは、再構成の効率化に貢献することができます。再構成プロトコルを最適化する際にそのような洗剤液、緩衝系における膜タンパク質の溶解性や安定性などの他のパラメータは、再構成の温度と時間の長さも調整する必要があります。例えば、長さの異なる膜足場タンパク質が大きく膜タンパク質複合体や膜タンパク質のオリゴマーの再構成を助けることができる異なったサイズ¹のnanodiscsを生成します。

nanodiscが正常に定量的方法論に苦しんでいる膜の研究を支援する生物物理学的手法など、SPR、ITCは、蛍光分光法^12から16に結合しています。最近、nanodiscはより優れた範囲と精度で膜タンパク質interactomesを識別するための定量的質量分析と組み合わされている17。製薬業界は、それが最も頻繁に処方薬ターゲット膜タンパク質（受容体、チャネル、トランスポータ、センサー）という事実であるが、膜タンパク質の研究に産学官を悩ませている同じ難しさによって制限されています。それはnanodiscが膜に埋め込まタンパク質と連携薬剤スクリーニング戦略の開発に役立つことを予測することができる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter	Millipore	UFC805008	Follow manufacturer's protocol for proper use
Bio-Beads SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920
E. coli total lipids	Avanti Polar Lipids	100500C	Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent
Ni sepharose HP resin	GE Healthcare	17-5268-01
Phosphorous standard solution	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
Table I. Specific reagents.
Name Composition Comments DDM stock 10% w/v DDM Resuspend in milliQ water and store at -20 °C MalFGK2 stock 1-2 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at -70 °C after purification MSP stock 10-15 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at -70 °C after purification in <1 ml aliquots and avoid excessive freeze/thaw cycles Phospholipid stock 5 nM E. coli total lipids 0.5% w/v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C for 1 week TS buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at 4 °C TSG20 buffer 50 mM Tris-HCl, pH8 100 mM NaCl 20% v/v glycerol Store at 4 °C TSGD buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at 4 °C and add DDM just before use Table II. Solution recipes.