Nanotopology van Celadhesie op variabele-Angle Total Internal Reflection fluorescentie microscopie (VA-TIRFM)

Summary

Topologie van celhechting op een substraat wordt gemeten met nanometer precisie door variabele hoek totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (VA-TIRFM).

Abstract

Oppervlakte topologie, bijv. cellen die groeien op een substraat, wordt bepaald met nanometer precisie door Variable Angle-Total Internal Reflection fluorescentiemicroscopie (VA-TIRFM). Cellen worden gekweekt op objectglaasjes transparante en geïncubeerd met een fluorescente merker homogeen verdeeld in de plasmamembraan. Verlichting vindt plaats door een parallelle laserbundel onder variabele hoek van totale interne reflectie (TIR) ​​met verschillende penetratiediepten van het evanescente elektromagnetische veld. Opnemen van fluorescentiebeelden bij bestraling ongeveer 10 verschillende hoeken toestaat cel-substraat afstanden te berekenen met een nauwkeurigheid van enkele nanometers. Verschillen van hechting tussen verschillende cellijnen, bijv. kankercellen en minder kwaadaardige cellen zijn dus bepaald. Bovendien kunnen mogelijke veranderingen van celadhesie op chemische of fotodynamische behandeling onderzocht. In vergelijking met andere methoden van super-resolutie microscopie belichting wordt gehoudenzeer klein, en geen beschadiging van levende cellen wordt verwacht.

Introduction

Wanneer een lichtbundel voortplant door een medium _{brekingsindex} n1 een interface aan een tweede medium _{brekingsindex} n2 <n _1, totale interne reflectie optreedt bij alle invalshoeken Θ, die groter zijn dan de kritische hoek Θ _c = arcsin (n ₂ / n _1). Ondanks dat volledig gereflecteerd de invallende lichtbundel roept een verdwijnende elektromagnetisch veld dat in het tweede medium en vervalt exponentieel met loodrechte afstand z van het grensvlak dringt volgens I (z) = I _{0 ^{ez / d (Θ).}} I (z) overeenkomt met de intensiteit van het elektromagnetische veld en d (Θ) de penetratiediepte bij golflengte λ, zoals gegeven door

d (Θ) = (λ/4π) ₍₁ ² n sin ² Θ - _{² 2} n) ^{-1 / 2}

Zoals gemeld in de literatuur ^1,2, I ₀ e vermenigvuldigd met de transmissiefactor T (Θ) en de verhouding n ₂ / n _1. Indien het elektrisch veld vector van deze lichtbundel gepolariseerd loodrecht op het vlak van inval (de vlak opgespannen door de invallende en de gereflecteerde bundel) bevindt het transmissiecoëfficiënt van de

T (Θ) = 4 cos ² Θ / [1 - (n ₂ / nL ₁₎ ^2]

Voor de gedetecteerde fluorescentie-intensiteit in TIRFM metingen lichtabsorptie te worden geïntegreerd over alle lagen van het monster en vermenigvuldigd met de fluorescentie quantum opbrengst η van de desbetreffende kleurstof als de ruimtehoek van detectie Ω. Zoals eerder ^3, kan deze intensiteit worden beschreven

Ik _F (Θ) = AT (Θ) OC (z) ^{e-z / d (Θ)} dz

als alle factoren die onafhankelijk zijn f rom de invalshoek Θ en z de coördinaat vallen binnen de experimentele constant A. Vergelijking 3 kan analytisch opgelost als de concentratie c (z) van fluoroforen wordt beschouwd als bijna constant

- Op alle coördinaten z ≥ Δ, bijvoorbeeld in het cytoplasma van cellen met een afstand Δ van de interface. In dit geval integraal moet worden berekend z = Δ z = ∞ tot gevolg

Ik _F = A c T (Θ) d (Θ) ^{e-Δ / d (Θ)}

- Tussen z = Δ - t / 2 en z = Δ + T / 2, dat wil zeggen in een dunne laag van dikte t, bijvoorbeeld een celmembraan op een afstand Δ van de interface. In dit geval kan de fluorescentie intensiteit berekend als

Ik _F = A c T (Θ) ^{te-Δ / d (Θ),}

Als t klein in vergelijking met Δ.

ent "> Uit de vergelijkingen (4) en (5) cel-substraat afstanden Δ kan worden berekend als de beelden van fluorescentie intensiteit I _F opgenomen voor variabele hoeken Θ en als ln (I _F / T d) (Vgl. 4) of ln (I _F / T) (Vgl. 5) wordt bepaald als functie van 1 / d voor deze hoeken. Voor de membraan marker laurdan die in dit document (s. hieronder) evaluatie werd uitgevoerd volgens Vgl. 5.

Zoals eerder gerapporteerd ^3, beeldacquisitie en evaluatie vereist
- Een homogene verdeling van excitatie licht op het monster,
- Geldigheid van een 2-laags model (de brekingsindices n ₁ en n ₂ voor het substraat en het cytoplasma, respectievelijk). Dit geldt als de plasmamembraan is zeer dun, en indien de laag van het extracellulaire medium (tussen de cel en het substraat) klein is vergeleken met de golflengte van invallend licht.

Bovendien een matige numerieke apertuur(Meestal A ≤ 0,90) van de microscoop objectieflens voordeel zijn wanneer afwijkingen van helderheid door anisotropie van straling in het nabije veld van de diëlektrische interface.

Protocol

1. Zaaien en incubatie van cellen

1. Seed individuele cellen, bijvoorbeeld U373-MG of U-251 MG-glioblastoma cellen bij een typische dichtheid van 100 cellen / mm ² op een glasplaatje en ze 4872 uur in kweekmedium groeien (bijv. RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal kalfsserum en antibiotica) met een incubator bij 37 ° C en _5% CO2.
2. Incuberen met een membraan marker, bijv. 6-dodecanoyl-2-dimethylamino naftaleen (laurdan) toegepast gedurende 60 min in een concentratie van 8 urn (in kweekmedium) ^4, of cytoplasma marker, bijvoorbeeld calceïne acetomethlyester aangevraagde 40 min bij een concentratie van 5 uM ³ of een membraan geassocieerde fotosensibilisator, bijv. protoporfyrine IX geïnduceerd na 4 uur incubatie met de precursor 5-aminolevulinezuur (5-ALA, 1 mM) ^4,5.
3. Spoel de cellen met kweekmedium of fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor fluorescentiemicroscopie. </ Li>

2. VA-TIRFM

1. Gebruik rechtop microscoop, bijvoorbeeld Zeiss Axioplan en vervang de koeler via een belichtingsinrichting, zoals beschreven in Ref. 3 met een hemi-sferisch of hemi-cilindrische glazen prisma optisch gekoppeld met het objectglaasje (zie figuur 1).
2. Een parallelle gecollimeerde laserbundel die na beeldvorming door het prisma en verdere optische componenten (bijv. concave spiegel) weer resulteert in een evenwijdige bundel op het oppervlak van het monster (telecentrisch pupil ray). Zorg ervoor dat het elektrisch veld vector is gepolariseerd loodrecht op het invalsvlak.
3. Gebruik een verstelbare spiegel zich in de condensor die wordt afgebeeld in het monstervlak en verlicht het monster onder een variabele hoek van inval (object ray). De verstelbare spiegel kan worden aangedreven door een stappenmotor, waarbij elke positie overeenkomt met een welbepaalde invalshoek, zoals bepaald door metingen goniometrische ³
4. Kalibreer de hoekstand van de verstelbare spiegel met de kritische hoek Θ _c = 61.3 ° voor een glas water overgang als een vaste waarde. Θ _c kunnen worden gevisualiseerd bij variatie van Θ wanneer een fluorescerende kleurstof (bijv. 1 mM flavine mononucleotide, FMN) wordt opgelost in water. De positie van de spiegel met Θ = Θ _c opgeslagen in de spiegel positionering programma.
5. Stel de parameters van de camera (belichting via de achterzijde Andor Ixon EMCCD, DV887DC, ANDOR Technology, Belfast, Verenigd Koninkrijk ^6), met inbegrip van temperatuur, te verwerven, opnametijd en shift snelheid.
6. Gebruik een objectieflens van geschikte vergroting en bij voorkeur matige numerieke lensopening (bijvoorbeeld 40 × / 0,75 of 63 × / 0,90 onderdompeling in water) en lokaliseren van het object dia in de microscoop. Gebruik immersie olie optisch contact van het monster te verzekeren met de glazen prisma. Noteer fluorescentiebeelden identieke monsters bij variatie van debelichtingshoek (Θ ≥ Θ _c met Θ _c overeenkomt met 64,5 ° voor een cel-glas interface). Een hoekbereik van 66 ° -74 ° met stappen van 0,5 ° of 1 ° wordt aanbevolen. Gebruik een geschikte lange pass of band pass filter voor fluorescentie detectie.

3. Data-analyse

1. Leest de afbeeldingen (bijvoorbeeld in ASCII-formaat) onder verschillende hoeken Θ, en de camera-instellingen (voor achtergrond discriminatie), de excitatiegolflengte en de brekingsindices voor glas (n ₁ = 1,52) en cellen _(n2 = 1,37) in het evaluatieprogramma (LabView, NANOCELL). Voor elke set parameters de indringdiepte d (Θ) en de transmissiefactor T (Θ) worden automatisch berekend.
2. Selecteer afbeeldingen gebruikt voor de evaluatie van cel-substraat afstanden Δ volgens vergelijking 5 (membraan merker) of vergelijking 4 (cytoplasma marker), afzonderlijke beelden met inhomogeneverlichting (onthullend e, g. strepen) worden uitgesloten.
3. Bereken beelden van cel-substraat topologie en kies een passende kleurcode voor weergave. Tijdens de beoordeling profielen van individuele pixels kan worden weergegeven zoals in figuur 2. Deze profielen kunnen gebruikt worden als indicator voor de kwaliteit van de fit.
4. Sla de evaluatie protocol.

4. Representatieve resultaten

Representatieve experimenten worden uitgevoerd met genetisch gemanipuleerde U251-MG glioblastoma cellen werd geleverd door prof. dr. Jan Mollenhauer, Vakgroep Moleculaire Oncologie, Universiteit van Zuid-Denemarken, Odense. In twee subklonen van deze U251 cellen de tumor suppressor genen TP53 of PTEN worden tot overexpressie gebracht met een Tet-On induceerbaar expressiesysteem, zodanig dat deze cellen een verminderde tumorgeniciteit vertonen en worden beschouwd als minder kwaadaardig. Zeer kwaadaardige U251-MG cellen zonder suppressor gen als controles en U251-MG wild-type cellen dienen voor een verdere vergelijking. Een laser diode uitzenden van een quasi continue reeks van pulsen picoseconde (LDH400 met chauffeur PDL 800-B, Picoquant, Berlijn, Duitsland; golflengte: 391 nm; pulsenergie: 12 pJ; herhalingsfrequentie: 40 MHz) wordt gebruikt als een excitatiebron.

In figuur 3 TIRFM beelden van U251-MG glioblastoma cellen met een geactiveerde TP53 tumor suppressor gen en geïncubeerd met laurdan (8 uM, 60 min) worden weergegeven voor invalshoeken van 66,0 °, 69,0 ° en 73,0 ° overeenkomt met penetratiediepten van de evanescent elektromagnetisch veld van ongeveer 140 nm, 75 nm en 60 nm respectievelijk. Met afnemende indringdiepte fluorescentie verminderd is (zie schalen) en afkomstig van meer oppervlakkige gebieden van de cellen (bijvoorbeeld focale contacten op hun randen). Cel-substraat afstanden (gevisualiseerd in figuur 3d door een kleurcode, variërend 0 tot 600 nm) sterk variëren over de cellen tussen de oply een paar nanometer (wit-geel) en 250 tot 300 nm (donker rood), dat wil zeggen focale contacten en grotere cel-substraat afstanden zijn in de directe omgeving. Hetzelfde geldt voor U251-MG glioblastoma cellen met een geactiveerde suppressor gen PTEN (figuur 4d), ​​terwijl cel-substraat afstanden tamelijk constant voor U251-MG en controle wild-type cellen met typische waarden van 80-100 nm (geel; figuur 4b ) en 150-200 nm (oranje-rood, figuur 4a).

Figuur 1. Verlichtingsinrichting voor VA-TIRFM in een rechtopstaande microscoop. Een verstelbare spiegel aangedreven door een stappenmotor maakt een hoekresolutie ± 0,25 °.

Figuur 2. Evaluatie profiel voor een pixel (schematisch). Als ln [I _F / T (Θ)] is uitgezet als functie van 1 / d (Θ), de helling is de cel-substraat afstand Δ. Deze helling wordt gewoonlijk bepaald met een precisie van ± 10%. Een waarde - als gevolg van inhomogene verlichting - is gemarkeerd en uitgesloten van de evaluatie.

Figuur 3 TIRFM beelden van U251-MG glioblastomacellen met geactiveerde TP53 suppressor gen na incubatie met laurdan (8 uM, 60 min). Opgenomen op verschillende lichtinvals (ac); cel-substraat afstanden in het gebied van 0-600 nm weergegeven door een kleurcode (d); excitatiegolflengte: 391 nm, detectie: ≥ 420 nm; beeldformaat:. 210 micrometer × 210 micrometer Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 4 Cell-substraat afstanden U251-MG glioblatoma cellen in het bereik van 0-600 nm aangegeven door een kleurcode,. (A) wild type (b) controles, (c) cellen met geactiveerde suppressor gen TP53, (d) cellen met geactiveerde suppressor gen PTEN; excitatiegolflengte: 391 nm, detectie: ≥ 420 nm; beeldformaat:. 210 micrometer × 210 micrometer Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Discussion

Een methode wordt beschreven voor het meten van cel-substraat afstanden nanometer precisie. Op dit moment, de wijze van super-resolutie microscopie, bijvoorbeeld op basis van gestructureerde verlichting ⁷ of op single molecule detectie ^{8 tot 10} en stimulated emission depletion (STED) microscopie ¹¹ zijn van groot belang. Geen van deze technieken maakt echter een axiale resolutie van minder dan 50 nm. Bovendien vrij hoge bestraling van 50100 W / cm ² nodig voor enkel molecuul methoden en meer dan 3.000 W / cm ² voor STED microscopie. Dit overschrijdt zonnestraling (ongeveer 100 mW / cm ²⁾ door verschillende ordes van grootte, zodat een snelle schade aan levende cellen kan optreden. In VA-TIRFM experimenten kunnen echter bestralingssterkte worden beperkt tot minder dan 20 mW / cm ^2, waardoor belichtingstijden van enkele minuten of zelfs uren zonder schade aan levende cellen ^12, zodat langdurige experimenten met muldere risico's lijken goed mogelijk. Belangrijkste voorwaarden voor elk experiment zijn goed hoekig kalibratie en homogene verlichting van schone object dia's.

VA-TIRFM kunnen worden toegepast op veel onderwerpen over technische of biologische oppervlakken, bijv. metingen van celhechting aan een transparant substraat. Celgroei, migratie of celdood (bv. apoptose) kan derhalve worden nader bestudeerd. Onlangs werd de rol van intracellulair cholesterol op celhechting onderzocht ^4. In het bijzonder bleek dat het aantal cel-substraatcontacten verminderd was bij uitputting van cholesterol met 3050%, wat uiteindelijk leidt tot onthechting van een groter aantal cellen van hun substraat. Celhechting werd onderzocht bij toepassing van fotosensibilisatoren gebruikt in fotodynamische therapie (PDT) van kanker en andere ziekten ^13. Het bleek dat bij bestraling met niet-fototoxisch lichtdoses cel-substraat afstandeniets verlaagd (mogelijk vanwege een zwelling van de cel), terwijl focale adhesies werden gehandhaafd ^4,5. Daarom metastasevorming door PDT was onwaarschijnlijk. Present experimenten tonen verschillen van cel adhesie tussen tumor (glioblastoma) en minder kwaadaardige cellen. Alleen toekomstige experimenten zal blijken of deze verschillende gedrag kan worden gebruikt voor diagnostische, farmacologische of therapeutische toepassingen.

Benadrukt moet worden dat de metingen van cel-substraat contacten dateren uit het begin van TIRF microscopie ^14. Hoekresolutie echter nodig nogal complex materiaal ¹⁵ tot nu toe en alleen de ontwikkeling van een compact verlichtingsinrichting voor variabele hoek TIRFM ³ toegestaan ​​routinemetingen van cel-substraat topologie. Naast deze prisma-type TIRFM, werd geïntroduceerd door miniaturisatie doel-type TIRFM ^16,17, waar een spot (of ring) dichtbij de rand vande opening vlak van de microscoop objectief wordt verlicht, zodat het licht kan op het monster onder een hoek Θ ≥ Θ _C. Daarom worden hoge diafragma objectieven waardoor een hoekbereik van ongeveer 66-75 ° nodig. Afstemmen van de hoek Θ vereist echter een bepaalde verschuiving van de laser focus binnen een afstand van minder dan 100 um, die moeilijk te voeren ook in een gecommercialiseerd TIRFM microscoop. Verdere nadelen van hoge diafragma (en een sterke vergroting) objectieven zijn nabije veld anisotropie en eerder beperkt object velden. Derhalve in vergelijking met objectieve-type TIRFM experimentele opstellingen zoals beschreven in dit manuscript de voorkeur voor het meten van cel-substraat topologie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Laminar flow	Holten Safe	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin	BIOCHROM		Cultivation medium
Glass object slides	Marienfeld	Pure white glass	Special cleaning procedure used
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan)	Molecular Probes		Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol)
Microscope	Carl Zeiss	Axioplan 1
Laser diode	PicoQuant	LDH 400 with driver PDL 800-B	Wavelength: 391 nm
Single mode fiber system	Point Source	kineFlex	Used with collimating optics
EMCCD camera	Andor	DV887DC	Back illuminated camera