Fabricação e Aplicação de Rosa Bengala-quitosana Films em Reparo de Tecidos Laser

Summary

Suturas são normalmente necessários para reparar o tecido durante procedimentos cirúrgicos. No entanto, a sua aplicação pode ser problemática uma vez que são invasivos e pode danificar o tecido. Os métodos de fabricação e aplicação de um adesivo de tecido romance são aqui relatados. Esta película adesiva é activada por laser e não requer o uso de suturas.

Abstract

Colagem de tecidos fotoquímica (PTB) é uma técnica de sutura para a reparação de tecidos, o que é conseguido através da aplicação de uma solução de rose bengal (RB) entre duas extremidades de tecido ^1,2. Estes são depois irradiadas por um laser que é selectivamente absorvido pelo RB. As reações fotoquímicas resultantes supostamente crosslink as fibras de colágeno no tecido com ³ mínima produção de calor. Neste relatório, RB, foi incorporada em filmes finos de quitosano para o fabrico de um adesivo de tecido novo que é activado por laser. Películas adesivas, com base em quitosano e contendo ~ 0,1% em peso de LD, são fabricados e ligados ao intestino de vitelo e os nervos tibiais de ratos por um laser de estado sólido (λ = 532 nm, de fluência ~ 110 J / cm ^2, tamanho do ponto ~ 0,5 cm) . Um tensiómetro de coluna única, em interface com um computador pessoal, é utilizado para testar a resistência de ligação. Os RB-quitosano ligações adesivas com firmeza para o intestino com uma força de 15 ± 6 kPa, (n = 30). A força de adesão diminui para 2 ± 2 kPa (n = 30) em que o laser não é aplicada ao adesivo. A anastomose de nervos tibial pode ser igualmente concluída sem a utilização de suturas. A novel quitosana adesivo ter sido fabricado que os títulos fotoquimicamente ao tecido e não requer sutura.

Protocol

1. Quitosana Preparação adesiva

1. O pó de quitosano é solúvel em solução de ácido acético, para a preparação de uma solução mãe de ácido acético (2% v / v), adicionar 10 ml de ácido acético glacial e 490 ml de água desionizada (DI-H ₂ O).
2. Para a preparação de uma solução stock de Rose Bengal (RB) (0,01% w / v) em ácido acético, pesar 5 mg de RB em um frasco envolto com folha de alumínio para evitar a fotodegradação. Adicionar 0,5 ml de O ₂ DI-H para dissolver o pó em seguida, adicionar 49,5 ml da solução de ácido acético stock (descrito na secção 1.1).
3. Para a preparação da solução de quitosano (1,7% w / v), pesar 0,85 g de quitosano em pó (MW médio, o grau de 85% de acetilação) e adicionar 50 ml de solução de ácido acético a RB. O controlo foi preparado por dissolução da quitosana em solução de ácido acético sem RB.
4. Adicionar um agitador magnético à mistura de quitosano e agitou-se à temperatura ambiente. Para assegurar a dissolução completa dos componentes, agitar a quitosanaem ácido acético + RB durante duas semanas e o quitosano em ácido acético, durante 5 dias (de controlo). Quando o quitosano é dissolvido, o pH da solução aumenta de 2,6 a ~ ~ 3.9. Note-se que RB é pouco solúvel em pH ácido e que exige um aumento do pH da solução, e um tempo prolongado de agitação para dissolver.
5. Centrifugar as soluções a 3270 xg, durante 1 hora e recolher o sobrenadante, utilizando, por exemplo, uma seringa estéril ml 10. Certifique-se de não perturbar a impureza da pelota. Durante esta etapa, a solução é feita a partir de impurezas macroscópicas e matéria insolúvel.
6. Injectar a (centrifugada) solução de quitosano sobre uma laje perpex plana usando uma seringa estéril. A espessura do filme seco depende da relação entre a quantidade de solução dispensada e a área da superfície sobre a qual a solução é espalhada. Assegure-se que a solução esteja livre de bolhas de ar e uniformemente distribuído sobre a laje. Para se obter filmes finos, com ~ 13 um de espessura, injectar ~ 1 ml de solução acima de 12 cm ² de superfícieárea (~ dimensões 3x4 centímetros, Figura 1A).
7. Cobrir a placa de perspex com uma tela, feita de folha de alumínio, por exemplo, para evitar a foto-branqueamento da solução. Garantir que a ventilação de ar suficiente é garantida para secar a solução sob a tela.
8. Deixar a solução a secar à temperatura ambiente (25 ° C) e pressão (1 atm) até que o filme resultante é insolúvel em água e não incham macroscopicamente. Isto é tipicamente alcançado em 2 semanas.
9. Retire cuidadosamente os filmes usando uma espátula fina e plana: esses filmes podem ser facilmente arrancado a laje Perspex sem danificá-los.
10. Medir a espessura das películas utilizando um micrómetro.
11. Corte o adesivo em tiras retangulares com uma tesoura afiada limpa e coloque-os entre lâminas de vidro estéreis para preservar sua forma plana. Enrole as lâminas em folha de alumínio para a luz de blindagem e armazená-los à temperatura ambiente. Rotular os adesivos com ou sem RB como "subiu adesivo" ou "quitosana ADHESive ", respectivamente.
12. A rosa películas adesivas podem ser esterilizados utilizando etanol (90%) ou com radiação gama (0,1 kGy / h durante 24 horas) ^4,5.

2. Atenuação Optical Adhesive

1. Fixar o adesivo rosa dentro de um cadinho de quartzo.
2. Gravar o seu espectro atenuada na gama de 400-800 nm utilizando um espectrofotómetro de duplo feixe ^4.
3. Assumindo que a validade da lei de Beer, calcular o comprimento de atenuação do adesivo como se segue: I = I ₀ e ^Ax-onde ₀ é a intensidade do feixe incidente, 1 / A atenuação é o comprimento, e x é a espessura da película.
4. Repita os passos 2,1-2,3 para o adesivo de quitosano para servir como um controlo.

3 aplicação in vitro:. Colagem de Tecidos Laser em Intestino

1. Intestino de bezerro colheita imediatamente após a eutanásia dos animais e armazenar a -80 ° C.
2. Antes de usar, degelo e hidratar a tissue por imersão em O ₂ DI-H durante 10 min.
3. Bissectar o tecido em secções (2 x 1 cm) usando uma lâmina 10 sob um microscópio de operação (x10). Manter a umidade seções usando DI-H ₂ O.
4. Traga os tocos incisão juntos (ponta a ponta). Limpe o excesso de água da superfície usando pontas de algodão.
5. Coloque uma tira adesiva de rosa (10 x 6 mm) através da incisão na camada serosa com microfórceps garantindo contacto total com o intestino (Figura 2).
6. A aderência do tecido do adesivo rosa é activado por um diodo laser bombeado de estado sólido, o qual é acoplado a uma fibra óptica multimodo (diâmetro do núcleo de 200 um) ^4.
7. Definir o nível de potência do laser de 180 mW e irradiar o adesivo para ~ min 6 com um tamanho de mancha de feixe de cerca de 5 mm, utilizando-se os parâmetros listados na Tabela 1. Ponto irradiam-o adesivo assegurando que cada local é irradiada para ~ 5 segundos antes de mover o feixe para o local adjacente. Tseu procedimento garante que o feixe laser varre a área de superfície total dos vários tempos adesivas.
8. Para avaliar a resistência de ligação do tecido, uma amostra de apertar a um tensiómetro de coluna única calibrado (Instron, MA, EUA), utilizando apertos mecânicos. Mover as pegas a 22 mm / min até que os dois cotos de tecidos separados ^4.
9. Coloque um adesivo rosa sobre o tecido, tal como descrito no passo 3.5. Não irradiar a amostra e medir a resistência de ligação do tecido, tal como descrito no passo 3.8. Este exemplo serve como um controlo.

4 Na Aplicação Vivo:. Anastomose do nervo tibial

1. Ratos Wistar com sedar o isoflurano / S mistura ₂ (4% durante a indução, 2% depois) ^5. Injectar subcutaneamente Buprenex (0,03 mg / kg) para fornecer intra-operatória actividade analgésica e possível aliviar a dor ou desconforto.
2. O seguinte procedimento cirúrgico deve ser realizado sob um microscópio de operação (x10). Faça uma pele oblíquaincisão de cerca de 3 cm de comprimento, na parte dorso-lateral da coxa direita e expor o nervo tibial com uma abordagem músculo-divisão através dos músculos glúteos ^2.
3. Parcialmente dissecar e aparar a adventícia do nervo tibial usando retas micro-tesoura e absorver o excesso de água com uma gaze estéril ou pontas de algodão.
4. Cortar o nervo tibial com micro-tesoura.
5. Posicionar uma tira estéril quitosana (dimensões 5 x 4 mm) abaixo do nervo tibial utilizando micro-fórceps.
6. Aproximar os cotos end-to-end com micro-pinças sobre a fita adesiva rosa.
7. A tira completamente adere ao nervo formando um colar, o que pode auxiliar na rotação do nervo durante a irradiação com laser da tira.
8. Activar a rosa adesivo com o laser, tal como descrito nas etapas 3.6) e 3.7).
9. Apare o adesivo redundante subiu de o colar do nervo operado.
10. Feche os músculos e pele, com cinco suturas 3-0 ^5. Procedimentos padrão de recuperação pós-operatória deve ser seguido, incluindo inspeção diária para deiscência ou formação de pus e administração de analgésicos, se necessário.

5. Resultados representativos

As películas que se obtêm são brilhantes de cor rosa, fina e tem uma superfície lisa (figura 1). Eles também são flexíveis e podem ser enroladas em tubos de pequeno diâmetro, sem lágrimas causam ou qualquer outro dano aparente (Figura 1B). O adesivo rosa tem dois picos de absorção a 530 e 562 nm, o laser verde é assim fortemente absorvida pelo adesivo e o comprimento de atenuação correspondente a 532 nm é de ~ 12 ^ m (Figura 3). Em contraste, a quitosana sem películas fracamente RB atenua a laser (1 / A ~ 162 mm), provavelmente devido à dispersão. Depreende-se que a trama espectros sem agregação significativa de RB ocorre nos filmes.

A rosa ligações adesivas firmementepara o intestino, após irradiação do laser (Figura 2) a realização de uma carga máxima típica de falha de 0,9 ± 0,4 N (n = 30). A força de adesão foi estimada como sendo a carga máxima dividida pela área da superfície de colagem, isto é, de 15 ± 6 kPa (n = 30). O adesivo não irradiado rosa ligado significativamente menor para o tecido (2 ± 2 kPa, n = 30, teste t não emparelhado p <10 ^6). A anastomose in-vivo do nervo tibial foi atingido com sucesso após a aplicação e colagem do adesivo rosa em conjunto com o laser verde. Uma semana após a cirurgia, o nervo foi operado em continuidade e a força de reparação foi de 17 ± 9 kPa (n = 10).

Figura 1. A) A solução de quitosano-RB é fundido em uma superfície plana Perspex espessura (laje laje ~ 5 mm). Papel gráfico é colocado por baixo da laje para facilitar o passo de dry-cast. O f insolúvel em águailm é obtido de duas semanas depois de fundição. B) O adesivo rosa é flexível e pode ser enrolado num cilindro pequeno.

Figura 2. O adesivo está ligado a rosa de intestino de bezerro após irradiação do laser. Irradiação uniforme é aplicada sobre o tecido durante adesivo RB-ligação; manchas entretanto seleccionados são mostrados nesta figura para ilustrar o efeito de foto-branqueamento do laser sobre o adesivo.

Figura 3. O espectro de absorção (em unidades arbitrárias) do adesivo rosa mostra dois picos a 530 e 562 nm. O laser verde (λ = 532 nm) é, assim, fortemente absorvida pelo adesivo durante a exposição à radiação laser. O adesivo de quitosano sem RB absorve mal o feixe de laser.

	n	2)	Potência (W)	Tempo (s)	Fluência (J / cm 2)	I (W / cm 2)	Max Load / Área (kPa)
Adesivo + Laser	30	60 ± 10	0,18 ± 0,03	365 ± 5	~ 110	~ 0,9	15 ± 1
Adesivo	30	60 ± 10	NA	NA	NA	NA	2 ± 2

Tabela 1. Legend. n, número da amostra; Área, área de superfície do adesivo rosa (média ± erro máximo); Power, potência do laser (média ± erro máximo); Tempo, tempo de irradiação (média ± erro máximo); Fluence, fluência laser média, eu, TIR estimadaadiance; máx / Area, carga máxima de ruptura do tecido reparado dividida pela área da superfície do adesivo, (média ± EP).

Discussion

A rosa fabricação adesivo é baseado num processo de seca-molde simples, embora a dissolução do RB em pH ácido requer agitação prolongada de solução de quitosano. É importante deixar a solução secar-se até se tornar uma película insolúvel em água. Isto acontece quando o teor em água de peso é de ~ 10%, em que o filme seco ^6. Filmes insolúveis são geralmente obtidas duas semanas após a seca-casting em condições padrão de temperatura e pressão (~ 25 ° C e ~ 1 atm). O mecanismo de ligação do tecido não é claro, no entanto, embora tenha sido observado que se difunde a partir do RB adesivo para o tecido adjacente, permitindo que o laser de foto-activar eficientemente na interface tecido. Pode ser especulado que a capacidade de produção de RB oxigénio singuleto, sob irradiação de luz, podem desempenhar um papel na ligação cruzada do colagénio e tecido de quitosano através dos seus grupos amino ^7,8. Um estudo recente sobre o adesivo rosa mostraram também que a temperatura máxima atingida durante o tissue-adesivo de ligação foi de ~ 32 ° C, suportando a hipótese de um processo fotoquímico ^4. Outras técnicas de sutura para o reparo de tecidos são atualmente investigados por vários grupos de pesquisa. Soldadura a laser dos tecidos (LTW), por exemplo, tem sido aplicado com sucesso em cirurgia oftálmica por Pini et al ^9. Em geral, porém, LTW pode causar danos térmicos colaterais como a temperatura do tecido podem atingir 65-75 ° C durante a irradiação com laser. Colas de cianoacrilato são também aplicados clinicamente para fechar feridas da pele, em vez de suturas, no entanto eles não são geralmente utilizados para o reparo de órgãos internos, devido à sua toxicidade ^10. Embora o adesivo rose (~ KPa 15) tem uma força de ligação superior de colas de fibrina (kPa ~ 8), ^{11 de} colas de cianoacrilato fornecer ainda mais forte aderência (~ 150 kPa) ^12. A espessura do adesivo rosa exige especial atenção durante a fabricação: um adesivo espesso (≥ 20 mm) seria, por exemplo, impedir que o laseratinja a interface de tecido e enfraqueceria a força de ligação, devido à absorção excessiva do laser por de rosa de bengala. Um adesivo fina (<10 mm), por outro lado, iria aumentar a irradiância e da fluência na interface adesivo-tecido. No entanto, deve ser tomado cuidado para reduzir a espessura da película, a fim de evitar o aquecimento excessivo do tecido durante a irradiação com laser. O adesivo rosa induz nenhum efeito citotóxico significativo sobre fibroblastos humanos ⁴ e tem, assim, um uso promissor na reparação de tecidos moles no interior do corpo, tais como intestino e nervos periféricos. Este adesivo pode também ter aplicações em engenharia de tecidos: Pode ser integrado, por exemplo, de uma ligadura com matrizes extracelulares para reparar o tecido e melhorar a cicatrização de feridas, sem o auxílio de sutura ^13. Note-se que não têm observado quaisquer efeitos adversos significativos, incluindo a inflamação localizada, a ser associados a este procedimento.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rose Bengal	Sigma-Aldrich	632-69-9
Chitosan (medium MW)	Sigma-Aldrich	10318AJ
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	08050051	2% v/v in DI water
Magnetic stirrer	Heidolph	MR Hei-Mix S
Centrifuge	Beckman Coulter Inc.	Allegra X-12R
Spectrophotometer	Varian Inc., Agilent	Cary 4000 UV-Visible
Laser	CNI Laser	MGL-532
Micrometer	Mitutoyo	Series 227
Surgical microscope	Carl Zeiss, Inc.	OPMI