Summary
Vi presenterer en enkel protokoll å visualisere regioner av programmert celledød (PCD) i mus embryoer og differensierende embryonale stamceller (ES) cellekulturer ved hjelp av en svært løselig fargestoff kalt LysoTracker.
Abstract
Programmert celledød (PCD) oppstår hos voksne til å opprettholde normal vev homeostase og under embryologiske utvikling for å forme vev og organer 1,2,6,7. Under utviklingen kan giftige kjemikalier eller genetiske endringer føre til en økning i PCD eller endre PCD mønstre som resulterer i utviklingsavvik og fødselsskader 3-5. For å forstå etiologien av disse defektene kan utredningen av embryoene suppleres med in vitro analyser som bruker differensierende embryonale stamceller (ES) celler.
Apoptose er en godt studert form av PCD som involverer både indre og ytre signalering for å aktivere caspase enzymet kaskade. Karakteristiske celleforandringer inkluderer membran blebbing, kjernekraft krymper, og DNA-fragmentering. Andre former for PCD ikke involverer caspase aktivering og kan være slutten-resultat av langvarig autophagy. Uavhengig av PCD sti, døende celler må fjernes. Hos voksne, immunceller perfOrm denne funksjon, mens i embryoer, hvor immunsystemet ennå ikke har utviklet, oppstår fjerning ved en alternativ mekanisme. Denne mekanismen innebærer nabocellene (kalt "ikke-profesjonelle fagocytter") tar på en phagocytic rolle-de anerkjenner "spise meg" signal på overflaten av den døende celle og sluker det 8-10. Etter engulfment blir rusk brakt til lysosomer for degradering. Således uavhengig av PCD mekanisme, kan en økning i lysosomal aktiviteten bli korrelert med økt celledød.
Å studere PCD, en enkel analyse for å visualisere lysosomer i tykke vev og flerlags differensierende kulturer kan være nyttig. LysoTracker fargestoff er et svært løselig lite molekyl som er beholdt i sure subcellulære avdelinger som lysosomer 11-13. Fargestoffet er tatt opp ved diffusjon og gjennom sirkulasjonen. Siden penetrasjon er ikke en hindring, visualisering av PCD i tykke vev og multi-layer kulturer er mulig 12,13 14, begrenset til små prøver, histologiske seksjoner, og monolagskulturer fordi prosedyren krever inntasting / permeabilitet av en terminal transferase.
I motsetning til Aniline blått, som diffunderer og er oppløst av løsemidler, er LysoTracker Red DND-99 fixable, lyse og stabil. Farging kan visualiseres med standard fluorescerende eller konfokalmikroskopi i hel-mount eller seksjon med vandig eller løsemiddel-baserte montering media 12,13. Her beskriver vi protokoller som bruker denne fargen å se på PCD i normal og sonic hedgehog null mus embryoer. I tillegg viser vi analyse av PCD i differensiere ES cellekulturer og presentere en enkel kvantifisering metode. Oppsummert kan LysoTracker flekker være et flott supplement til andre metoder for å oppdage PCD.
Protocol
1. LysoTracker Farging av mus embryo
- Generere mus embryoer ved å plassere unge (5-6 uker gamle) kvinner i mannlige stud bur. Skjerm på følgende morgen for utseendet av en vaginal plugg indikerer at parring har oppstått. Hvis kvinnen er gravid, er middag på den dagen som heter 0.5 DPC (dager etter samleie). Prosedyren som presenteres her er ideelt for embryo 7-13 DPC.
- På den embryonale dag av interesse, avlive den kvinnelige henhold til godkjente protokoller og fjerne livmoren. Fjerne fostre fra decidua i en 10 cm petriskål med Hanks BSS (uten fenolrødt). Fjern de ekstra-embryonale membraner og ikke minst en skylling med Hanks BSS å fjerne overflødig vev og blod.
- Forbered LysoTracker Embryo Staining Solution (5 mM LysoTracker i Hanks BSS). En praktisk volum for 1-2 kull er 5 ml. Bland forsiktig til å utbetale fargestoffet jevnt.
- Legg embryo til LysoTracker Embryo Staining solution i en mikrosentrifuge røret eller flasken og inkuber ved 37 ° C i 45 min.
- Skyll svært forsiktig i Hanks BSS fire ganger, 5 min hver vask.
- Fikse i 4% Paraformaldehyde natten.
- Skyll en gang i Hanks BSS, 10 min, for å fjerne fix.
- Dehydrere gjennom en metanol serie (50%, 75%, 80%, 100%, 5 min hver trinn) for å eliminere bakgrunnsfarging. Dette er viktig for å oppnå god signal-til-støy under avbildning.
- På dette punktet kan du lagre embryo prøvene på ubestemt tid i metanol ved -20 ° C, beskyttet mot lys.
Merk: En vevsprøve kan tas på en hvilken som helst trinn for DNA genotyping, men det kan være mest hensiktsmessig å ta en prøve like før lagring slik at opp til dette trinnet alle prøvene kan være satsvis-behandlet. Samle en prøve av vev fra halen, lem, eller hodet fra hver embryo og sette alle i separate rør. Rehydrere vevsprøve og forberede genotyping.
2. LysoTracker Farging av Skille ES kulturer
- Forbered embryoid organer via hengende slipp-metoden 15 med en starttetthet 500 celler per 20 ul slipp.
- Etter 3 dager, overføre embryoid organer til suspensjon kultur på 10 cm uten tilhenger petriskåler (dvs. de som brukes for bakteriologisk arbeid). Kultur for 5 dager, endre media hver 2 dager.
- På dag 7, overføre embryoid organer til gelatinized 8-vel kammer slides (legg 0,1% Gelatin til kamrene, vent 5 min, fjerne og legge til media). Overfør 1-2 embryoid organer per kammer.
- Kultur for 10 dager, skiftende media annenhver dag. Vær nøye med å plassere pipetten på hjørnet av kammeret lysbildet slik som å ikke forurolige den embryoid kroppen fester seg til glasset. Også når legge friske medier også plassere pipetten på hjørnet av kammeret og frigjøre mediet langsomt.
- Etter 10 dager med kulture, til å indusere apoptose som positiv kontroll, behandle noen av brønnene med 0,1 mM og 1,0 mM H 2 O 2 (tilsett H 2 O 2 til frisk media, mix, deretter legge til cellene) i 60 min. Skyll to ganger med D-PBS og kultur over natten i regelmessige medier.
- Forsiktig aspirer eksisterende medier og legge LysoTracker cellefarging løsning (500 nM LysoTracker (endelig konsentrasjon) i media, 300 pl per kammer).
- Inkuber ved 37 ° C i 15 min.
- Skyll to ganger med D-PBS 2 ganger, 5 min hver.
- Fix i 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved RT.
- Skyll to ganger med D-PBS, 5 min.
3. Vise LysoTracker Stained Embryos eller ES kulturer
- Forbered celleprøver for mikroskopi ved å aspirere D-PBS, fjerne kammeret bort fra lysbildet, lufttørking i ca 5 min, og deretter legge en vandig montering medium (Vectashield med DAPI eller lignende). Plasser en folie barriere mens drying for å redusere bleking av fluoroforen. Montere embryo i en dyp-depresjon glassfat eller liten petriskål i Vectashield eller lignende.
- Visualiser med en dissekere eller sammensatte mikroskop utstyrt med en rhodamine eller Texas Red filter (LysoTracker RED DND-99, Excitation / Emisjon: 577/590 nm). Fargingen er typisk ganske lyse så lange eksponeringer er vanligvis ikke nødvendig.
4. Kvantifisering av resultatene med avbildningsteknikker
- Ta digitale bilder av dine prøver under samme eksponeringsforhold i manuell modus.
- Åpne bildene i Adobe Photoshop eller et lignende bildebehandlingsprogrammet. For å bestemme mengden av LysoTracker farging, velger du den røde kanalen og terskel bildet (konverterer bildet til svart-hvitt) slik at den røde flekker er nå representert av hvite piksler. Velg de hvite piksler og bruke histogrammet funksjonen for å få det totale antallet.
- Bruk den blå kanalen å telleantallet kjerner i feltet. Det kan være nyttig å holde en oversikt over tellingen ved kommenterer bildet.
- Registrere verdier, og deretter beregne gjennomsnittlig farging nivået per celle. Gjenta denne analysen med samme terskel innstilling for alle bildene du ønsker å prøve.
5. Representant Resultater
Det er et normalt mønster av PCD under embryonal utvikling som kan endres når en vekstfaktor genet, for eksempel Sonic pinnsvin (SHH), er fjernet 16,17. Siden LysoTracker er et lite molekyl fargestoff som er svært diffusjonsevne, kan hele embryoet bli visualisert å vurdere områder PCD selv dyp innenfor mesenchyme 12,13 Figur 1 viser LysoTracker farging mønster for normale og Shh -. / - Mutant mus embryoer på 10.5dpc. På dette stadiet, er PCD betydelig økt i Shh - / - mutant embryoer, spesielt i lem og somitt regions. Deler av embryoet kan avbildes i hel-festet ved høyere forstørrelse (1B) for å vurdere den generelle mønster. Dissekert deler kan også være seksjonert med en vibrerende mikrotomen (1C) eller en kryostaten (DF) for å avsløre PCD regioner i større detalj.
Tunel analyse gjøres best på tynne seksjoner der inntrengning av terminalen transferase er mindre problematisk. LysoTracker farging og en tunel Analysen kan gjøres på samme vev (figur 1D-G). Disse resultatene viser at selv om det ikke er en streng 01:01 korrelasjon mellom LysoTracker og Tunel flekker, de generelle delene av PCD overlapping betraktelig. På et høyere forstørrelse, er det mulig å se at puncta flekken positive med tunel analysen, men ikke med LysoTracker fargestoff, puncta som flekken bare med LysoTracker fargestoff, og puncta som har overlappende farging.
Når en EB er belagt på en gelatin-belagte overflaten, vil differensiere celler østovere utover. Etter 10 dager med kultur vil cellene har differensiert i en rekke celletyper, inkludert neuroner, muskelceller og cardiomyocytes. Kulturene vist i Figur 2 inneholder blandede populasjoner av disse celletyper, men en kunne tilpasse protokollen å studere PCD av en bestemt celle-type av interesse. For eksempel, kan den behandles med EB retinsyre å forbedre differensiering av nerveceller 19, og deretter LysoTracker analysen kan brukes til å vurdere neuronal celledød under forskjellige forhold. I normal kultur differensierte ES celler, er det noen celler som gjennomgår PCD og disse kan oppdages med LysoTracker og / eller tunel analyser (figur 2A). PCD kan induseres ved en rekke ulike cytotoksiske midler slik som hydrogenperoksyd (H 2 O 2) som induserer oksidativ skade og initierer apoptotisk pathway 20,21. En lav dose av H 2 O 2 øker bådeLysoTracker og tunel flekker sammenlignet med ingen behandling, mens en høy dose resulterer i celle krymping og utbredt LysoTracker og Tunel positivitet. Lik resultatene i fosteret, er det mulig å se at puncta flekken positive med tunel analysen, men ikke med LysoTracker fargestoff, puncta som flekken bare med LysoTracker fargestoff, og puncta som har overlappende farging. Konsekvensen av anvendelsen av et cytotoksisk middel som induserer apopotosis er sammenlignet med serum sult betingelser som induserer autophagy (figur 2D). Celler som har gjennomgått en periode med serum sult (1 time) viser et annet mønster der LysoTracker og tunel flekker ikke høyt korrelert. LysoTracker farging mye økt sammenlignet med ubehandlede kulturer, men tunel positivitet er på normale nivåer.
Ansette standard verktøy tilgjengelig i Adobe Photoshop, kan LysoTracker flekker kvantifiseres med en enkel thresholding metodesom tillater en å beregne gjennomsnittlig farging nivå for en populasjon av celler. Figur 3A-B viser hvordan et eksempelbilde ser under kvantifisering prosessen. Starter med en baseline bilde med LysoTracker flekker i den røde kanalen og DAPI-farget kjerner i den blå kanalen (panel 3A), ble den røde kanalen av dette bildet thresholded å konvertere bildet til svart-hvitt og hvite piksler var deretter valgt og telles (figur 3A '). En thresholding nivå ble valgt som representerer LysoTracker flekker mønster. Som med alle kvantifisering metode som bruker bilder, er det viktig å unngå overeksponering bildene som dette kan potensielt føre til over-vekt forskjeller. Antallet kjerner i feltet kan deretter telles ved å se på bare den blå kanalen (figur 3B) og merking kjernene ved hjelp av en tegning, for eksempel en pensel mens telling (figur 3B '). Man kan da uttrykke the nivå av flekker ved å beregne det gjennomsnittlige nivået på farging per celle (antall piksler / kjerner count). Hvis man ønsker å bruke denne algoritmen for høy gjennomstrømning screening, kan de fleste screening pakker måle lysstyrke i en bestemt kanal, og også har et objekt identifikator funksjon som vil telle atomkjerner i et felt, men for de fleste typiske bruksområder av den manuelle metoden er rask og enkel. For å gi et eksempel, ble en prøve region fra figurene 2A-C kvantifisert og resultatene bekrefter at økende konsentrasjoner av H 2 O 2 resulterer i en høyere grad av LysoTracker farging (figur 3C).
Figur 1. LysoTracker farging i normal og Shh - / - embryoer. A, A 'Normal og Shh -. / - Mus embryoer på 10,5 DPC, farget med LysoTracker Red, montert i Vectashield og fotograferte i henholden epiflourescence disseksjonsmikroskop. Parentes angir plasseringen av forelimbs B, B 'forbena av vanlige og Shh -.. / - Embryoer avbildes ved høyere forstørrelse. Legg merke til den normale domener av celledød inkludert 'Posterior Nekrotisk Zone "(merket med en stjerne) og en region i proksimale mesenchyme av greinen bud (markert med en pil). Hysj null lemmer viser sterkere farging i mediale og distale delen . C, C '. Medial seksjoner gjennom forbena knopp av både normale og null lem knopper. Merke til tilstedeværelsen av fargingen i proksimale mesenchyme (pil) og AER (pilspiss) av den normale legemsdelen knopp, og sterk farging innenfor dorsal og ventrale og distale mesenchyme innenfor null lem knopp. DF. Den samme seksjon (12 mikron, frosset avsnitt) ble fotografert for LysoTracker og tunel flekker (Roche 1684795). Seksjonen passerer gjennom den distale delen av Shh null mesencHyme. Pilhodet peker på AER. Legg merke til hvordan den samlede mønsteret er svært lik med begge metoder, men fargingen ikke overlapper helt. G, G '. På høyere forstørrelse av AER og mesenchyme, kan en se både tilstedeværelsen av puncta som er LysoTracker eller Tunel-positiv bare samt puncta som har overlappende farging.
Figur 2. LysoTracker farging i differensierte ES celler. Skille celler ble platet på 8-kammer lysbilder i fravær av LIF. Å vise hvordan LysoTracker og Tunel farging sammenligne, ble apoptose vei indusert med 2 forskjellige doser av H 2 O 2, mens autophagy veien ble indusert ved å bruke 1 time serum sult. Disse bildene ble tatt med en Zeiss LSM5 Confocal mikroskop A-A'':. Ubehandlet kulturer viser noen normal apoptose som indikert av LysoTRacker og tunel flekker. Mønsteret med begge teknikker meste overlapper (hvite piler), derimot, kan man se noen puncta som er LysoTracker positive bare (røde piler) B-B'', CC ":. Behandling med økende mengder av H 2 O 2 stimulerer apoptose . Den lavere dose viser mer LysoTracker og tunel positive puncta forhold til ubehandlede celler. Jo høyere dose induserer i enda mer LysoTracker og tunel positive puncta. Hvite piler peker på overlappende flekker, mens røde piler peker på puncta som er positive for LysoTracker bare. Det er også mulig å se puncta som er bare positivt for Tunel farging (grønne piler) DD ":. Serum sult kan indusere autophagy, som kan stimulere til en opphopning av materiale i lysosomer og autophagolysosomes. Legg merke til hvor mange flere LysoTracker puncta er synlige i forhold til ubehandlede kulturer. Tunel positive puncta er til stede (de fleste som har overlappende LysoTracker flekkening, hvite piler), er imidlertid ikke nummeret betydelig økt sammenlignet med ubehandlede tilstander. I tillegg, under serum sult forhold, LysoTracker bare positive puncta er svært utbredt (røde piler).
Figur 3. Kvantifisering metode for å vurdere nivået av flekker i en populasjon av celler ved hjelp av Adobe Photoshop. A: En del av fig 2A ble valgt og LysoTracker (rød kanal) og DAPI farging (atomkjerner, blå kanalen) er vist i dette panelet A ':. Den røde kanal av figur 3A ble thresholded å konvertere det til et svart- -hvitt bilde. De hvite piksler kan da velges og telles ved hjelp av histogrammet funksjonen B-B ':. Den blå kanal viser kjernene og mens telle dem, kan bildet være merket med en tegning funksjon som en pensel C:. Dette er en exrikelig kvantifisering av en prøve fra paneler 2A-C. Dataene er representert som piksler per kjerner. Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Viktige kjennemerkene apoptose inkluderer påvisning av DNA-skade med Tunel analysen sammen med påvisning av kaspase-aktivitet (påvist med mAbs eller bindingsmolekyl som ZVAD-FMK), observasjon av cellulære endringer, og presentasjonen av fosfatidylserin (PS ) på membranoverflaten (detektert av Annexin V binding). Det er noen ulemper med hver av disse analysene. For eksempel gjelder terminalen transferase brukt i tunel analysen ikke trenge utover noen få cellelagene. Også Annexin V kan markere celler som ikke gjennomgår apoptose slik som de som har membran skade (Annexin V kommer inn i cellen og markerer PS på den indre pakningsvedlegget). I tillegg caspase analyser kan oppdage caspase aktivitet som ikke er knyttet til apoptose. LysoTracker er ikke en erstatning for disse analysene, men det kan være et nyttig supplement analysen avhengig av konteksten.
LysoTracker farging har flere fordelerover andre metoder. Fordi det er et lite molekyl fargestoff i motsetning til et protein slik som terminal transferase (brukt i tunel analysen) eller Annexin V, diffunderer det lett gjennom tykke vev. Dette betyr at LysoTracker farging er spesielt nyttig å se på endringer i den generelle mønsteret av apoptose. Dermed er en spesielt nyttig program for LysoTracker flekker som et første-pass analyse for å fastslå mønstre av PCD i embryoer eller celler av ulike genotyper eller å se på den samlede effekten av anvendelsen av visse giftstoffer eller medikamentell behandling. I tillegg, den høye signal-til-støy-forhold av fargestoffet, dens brukervennlighet (kan celler eller vev simpelthen dyppes), dens evne til å bli løst og utholdenhet av fluoroforen gjøre bruken av LysoTracker ideell for høyvolums screening av celler eller vev som kan utvise PCD.
Som med en hvilken som helst analyse for PCD imidlertid sammenheng med eksperimentet viktig å vurdere. Under tidlig mus embryonaleutvikling, i fravær av et immunsystem, kan døende celler phagocytosed etter nabocellene 22. Det er ikke kjent hvor raskt dette skjer. Imidlertid, siden det er mulig å finne Tunel positiv puncta som ikke LysoTracker positiv (figur 1G), kan cellene være gjennomgår de senere stadier av apoptose (DNA-fragmentering) før de blir fjernet ved fagocytose. Når tunel og LysoTracker flekker overlapping, kan dette tyde på at en celle eller celle fragment som inneholder fragmentert DNA blir phagocytosed. Endelig kunne LysoTracker-positiv-kun puncta indikere cellulært avfall som ikke inneholder DNA, men blir ryddet av nabocellene. Således, under tidlig mus utvikling, uavhengig av analysen (tunel eller LysoTracker), kan fargingen mønsteret indikerer begge celler som dør og nabocellene inneholdende rusk.
Våre resultater (figur 2A-C) viser at LysoTracker kan være svært nyttig for å vurderePCD i dyrkede differensierende ES celler og derfor er sannsynlig å være nyttige for en rekke dyrkede celletyper. Interessant, når cellene blir stimulert med H 2 O 2 til å gjennomgå apoptose, mest tunel positiv puncta er også LysoTracker positiv (figur 2B ", 2C"). Dette tyder på at i monolayer kultur, kan nabocellene fortsatt kunne phagocytose nærheten døende celler. Faktisk med en betydelig høyere dose av H 2 O 2 (10mm), det store flertallet av cellene inneholder tunel positive puncta og det er relativt lite LysoTracker flekker, noe som tyder på at når så mange celler dør, ingen er friske nok til å fungere som ikke- profesjonelle fagocytter (data ikke vist). Et viktig poeng som ikke er godt verdsatt, er at uansett analysen, kan det være vanskelig å avgjøre om en ser på en døende celle som har høy lysosomal aktivitet eller liket av en døende celle blir oppslukt av en nabo celle, spesielt nårceller er i umiddelbar nærhet.
LysoTracker har også vært et nyttig verktøy for å vurdere autophagy 23-26 og svar på serum sult, differensierte ES celler viser en markert økning i antall LysoTracker flekker puncta (sammenligne Figur 2D med 2A). Dette sannsynligvis indikerer en økning i dannelsen av autophagolysosomes og lysosomer i respons til redusert næringsstoffer (som har blitt vist i andre sammenhenger som bruker LysoTracker 24,25). I kontrast er Tunel flekker, mens fortsatt i stor grad overlappende med LysoTracker flekker, ikke sterkt økt, noe som indikerer at selv om cellene opplevde stress fra tap av serum, etter 24 timer, dette stress var ikke tilstrekkelig til å indusere apoptose.
Dermed en påminnelse til å vurdere (eller potensiell fordel, avhengig av hva man ønsker å analyse) er at mens LysoTracker kan markere deler av apoptose (døende celler samt naboing ikke-profesjonelle fagocytter), kan det også markere celler som er under autophagy. Å bestemme den nøyaktige mekanismen for PCD, er det best å gjøre flere analyser og hvis mulig, bruk stor forstørrelse optiske eller elektron mikroskopi teknikker for å skille mellom de ulike mulighetene. I sammendraget, disse eksemplene viser at LysoTracker er et flott verktøy for å vurdere PCD men at konteksten for analysen bør vurderes nøye siden LysoTracker positive puncta kunne representere en økning i lysosomer aktivitet på grunn av ikke-profesjonelle fagocytose eller på grunn av autophagy 27,28 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker medlemmer av Mariani lab for å få hjelp med å redigere protokollen. Dette arbeidet ble finansiert av en CIRM Postdoktor Training Grant (JLF), en CIRM BRIDGES internship (TZTT), Robert E. og mai R. Wright Foundation (fvm), og University of Southern California (fvm).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | #L-7528 | |||||||||||||||
| Hanks BSS | Invitrogen | 14025-076 | |||||||||||||||
| Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |||||||||||||||
| Vectashield | VECTOR | H-1200 | |||||||||||||||
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |||||||||||||||
| Non-essential amino acids | Cellgro | 25-025-CI | |||||||||||||||
| Sodium pyruvate | Cellgro | 25-000-CI | |||||||||||||||
| FBS | Hyclone | SH30071.02 | |||||||||||||||
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140-122 | |||||||||||||||
| b-Mercapt–thanol, 50 mM | Invitrogen | 21985-023 | |||||||||||||||
| LabTek-II Chamber slides (8-well) |
Nalge Nunc International | 154534 | |||||||||||||||
| 0.1% Gelatin | Millipore | ES-006-B | |||||||||||||||
| Dulbecco's PBS (D-PBS) | Cellgro | 21-031-CV | |||||||||||||||
Solution Recipes 4% Paraformaldehyde For 100 ml:
WARNING: Paraformaldehyde in 'frill' form (compressed small pellets) is less powdery and can therefore be measured outside of a hood. However you should still wear a protective dust mask (N95 at least) during handling. EB Culture Media For 500 ml EB Media:
|
|||||||||||||||||
References
- Baehrecke, E. H. How death shapes life during development. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 779-787 (2002).
- Meier, P., Finch, A., Evan, G.
- Ikonomidou, C. Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome. Science. 287, 1056-1060 (2000).
- Dunty, W. C., Chen, S. Y., Zucker, R. M., Dehart, D. B., Sulik, K. K. Selective vulnerability of embryonic cell populations to ethanol-induced apoptosis: implications for alcohol-related birth defects and neurodevelopmental disorder. Alcohol Clin. Exp. Res. 25, 1523-1535 (2001).
- Price, O. T., Lau, C., Zucker, R. M. Quantitative fluorescence of 5-FU-treated fetal rat limbs using confocal laser scanning microscopy and Lysotracker. Cytometry A. 53, 9-21 (2003).
- Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
- Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
- Qu, X. Autophagy gene-dependent clearance of apoptotic cells during embryonic development. Cell. 128, 931-946 (2007).
- Grimsley, C., Ravichandran, K. S. Cues for apoptotic cell engulfment: eat-me, don't eat-me and come-get-me signals. Trends Cell Biol. 13, 648-656 (2003).
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
- Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
- Zucker, R. M., Hunter, S., Rogers, J. M. Confocal laser scanning microscopy of apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos. Cytometry. 33, 348-354 (1998).
- Zucker, R. M., Hunter, E. S. 3rd, Rogers, J. M. Apoptosis and morphology in mouse embryos by confocal laser scanning microscopy. Methods. 18, 473-480 (1999).
- Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119, 493-501 (1992).
- Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
- Chiang, C. Manifestation of the limb prepattern: limb development in the absence of sonic hedgehog function. Dev. Biol. 236, 421-435 (2001).
- Ishibashi, M., McMahon, A. P. A sonic hedgehog-dependent signaling relay regulates growth of diencephalic and mesencephalic primordia in the early mouse embryo. Development. 129, 4807-4819 (2002).
- Schuldiner, M. Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Brain Res. 913, 201-205 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Dumont, A. Hydrogen peroxide-induced apoptosis is CD95-independent, requires the release of mitochondria-derived reactive oxygen species and the activation of NF-kappaB. Oncogene. 18, 747-757 (1999).
- Hampton, M. B., Orrenius, S. Dual regulation of caspase activity by hydrogen peroxide: implications for apoptosis. FEBS Lett. 414, 552-556 (1997).
- Wood, W. Mesenchymal cells engulf and clear apoptotic footplate cells in macrophageless PU.1 null mouse embryos. Development. 127, 5245-5252 (2000).
- Scott, R. C., Juhasz, G., Neufeld, T. P. Direct induction of autophagy by Atg1 inhibits cell growth and induces apoptotic cell death. Curr. Biol. 17, 1-11 (2007).
- Rodriguez-Enriquez, S., Kim, I., Currin, R. T., Lemasters, J. J. Tracker dyes to probe mitochondrial autophagy (mitophagy) in rat hepatocytes. Autophagy. 2, 39-46 (2006).
- Bampton, E. T., Goemans, C. G., Niranjan, D., Mizushima, N., Tolkovsky, A. M. The dynamics of autophagy visualized in live cells: from autophagosome formation to fusion with endo/lysosomes. Autophagy. 1, 23-36 (2005).
- Boya, P., Mellen, M. A., de la Rosa, E. J. How autophagy is related to programmed cell death during the development of the nervous system. Biochem. Soc. Trans. 36, 813-817 (2008).
- Galluzzi, L. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
- Klionsky, D. J. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes. Autophagy. 4, 151-175 (2008).
