Summary
تغيير وجهة نظرنا النظرية الافتراضية (BCP) خوارزمية يستند دولة من بين الفن النمذجة التقدم في التغيير عبر نقاط نماذج ماركوف المخفية ويطبقها على لونين مناعي التسلسل (ChIPseq) تحليل البيانات. BCP يؤدي جيدا في كل أنواع البيانات واسعة النطاق والمنقط، ولكن تتفوق في تحديد بدقة قوية والجزر استنساخه من تخصيب هيستون منتشر.
Abstract
ChIPseq هو أسلوب يستخدم على نطاق واسع للتحقيق في البروتين DNA التفاعلات. يتم إنشاء ملفات تعريف الكثافة قراءة باستخدام التسلسل التالي من البروتين DNA محددة وقصيرة محاذاة يقرأ إلى الجينوم مرجعية. وكشف مناطق التخصيب والقمم، والتي تختلف في كثير من الأحيان بشكل كبير في الشكل، اعتمادا على البروتين الهدف 1. على سبيل المثال، غالبا ما تربط عوامل النسخ في موقع وبطريقة تسلسل معين وتميل إلى إنتاج الذروة نقطي، بينما هي تعديلات بسيطة أكثر انتشارا وتتميز الجزر، واسعة الانتشار من تخصيب 2. تحديد هذه المناطق بشكل موثوق كان محور عملنا.
استخدمت خوارزميات لتحليل البيانات ChIPseq منهجيات مختلفة، من الاستدلال 3-5 على نماذج أكثر صرامة الإحصائية، على سبيل المثال نماذج ماركوف المخفية (HMMs) 6-8. سعينا إلى حل تقلل من ضرورة يصعب تحديد والمخصصة المعلمات التي غالبا ماتنازلات القرار ويقلل من قابليتها للاستخدام بديهية من الأداة. فيما يتعلق HMM القائم على الأساليب، ونحن تهدف للحد من إجراءات تقدير المعلمة وبسيطة، والتصنيفات الدولة محدودة التي تستخدم في كثير من الأحيان.
بالإضافة إلى ذلك، تحليل البيانات التقليدية ChIPseq ينطوي التصنيف من المتوقع قراءة ملامح كثافة نقطية أو إما منتشر ثم طلب بعد ذلك الأداة المناسبة. نحن تهدف إلى زيادة الحاجة إلى استبدال هذين النموذجين متميزة مع نموذج واحد أكثر تنوعا، والتي يمكن أن تعالج باقتدار طائفة كاملة من أنواع البيانات.
لتحقيق هذه الأهداف، ونحن لأول مرة بناء إطار إحصائي أن غرار طبيعي ChIPseq هياكل البيانات باستخدام مسبقا في طليعة HMMs 9، والتي تستخدم فقط الصيغ الصريحة، والابتكار حاسما لمزايا أدائها. نماذج الكشف عن مجريات الأمور أكثر تعقيدا بعد ذلك، لدينا تسع دول HMM مخفي لا حصر له من خلالالنظرية الافتراضية النموذج. طبقنا لتحديد نقاط تغيير معقول في كثافة القراءة، التي تحدد مزيد من شرائح تخصيب اليورانيوم. كشف تحليلنا كيف لنا نقطة تغيير النظرية الافتراضية (BCP) خوارزمية كان التعقيد يشهد انخفاض الحسابية من قبل وقت التشغيل مختصرة وأثر الذاكرة. تم تطبيق الخوارزمية بنجاح BCP إلى كل من الذروة ونقطي منتشر تحديد الجزيرة مع دقة قوية ومحدودة المعلمات المعرفة من قبل المستخدم. هذا يتضح كلا من براعة وسهولة الاستخدام. وبناء على ذلك، فإننا نعتقد أنه يمكن تنفيذها بسهولة في مدى واسع من أنواع البيانات والمستخدمين النهائيين على نحو تتم مقارنة بسهولة ويتناقض، مما يجعلها أداة عظيمة لتحليل البيانات ChIPseq التي يمكن أن تساعد في التعاون وتأييد بين المجموعات البحثية. هنا، علينا أن نبرهن تطبيق BCP إلى عامل النسخ الموجودة والبيانات 10،11 اللاجينية 12 إلى توضيح فائدتها.
Protocol
1. إعداد ملفات الإدخال لتحليل BCP
- محاذاة قصيرة التسلسل يقرأ المنتجة من أشواط (رقاقة والمكتبات المدخلات) إلى الجينوم مرجعية مناسبة باستخدام المحاذاة المفضل قراءة قصيرة البرمجيات. ينبغي تحويل المواقع تعيينها إلى 6 بيانات العمود الموسعة متصفح (BED) شكل 13 (UCSC متصفح الجينوم، http://genome.ucsc.edu/ )، وهو خط المفصول في قراءة معين مما يدل على كروموسوم معين، تبدأ الموقف (0-إلى)، نهاية الموقف (نصف مفتوحة)، وقراءة الاسم ونقاط (اختياري)، وحبلا.
2A. نشر مقروءة الملامح: تشيب تجهيزها لقراءة كثافات الكشف عن اليورانيوم في جزر البيانات منتشر
- تمديد رقاقة والمواقع الإدخال تعيينها إلى طول القطعة محددة سلفا، أي. حجم جزء استهدفت خلال عملية الهضم الانزيم أو sonication من الحمض النووي، وعادة حوالي 200 سنة مضت. التهم هي جزء ثم aggregaتيد في صناديق المجاورة. افتراضيا، يتم تعيين حجم بن لطول جزء تقدر ب 200 BP.
- إن أي تغيير محتمل في نقاط مجموعة من صناديق متطابقة مع قراءة معظم التهم سقوط المحتمل في الحدود الخارجية أكثر. وبناء عليه، فإنه ليس واردا أن نقطة التغيير سوف يحدث في الحدود الداخلية بين اثنين من صناديق مع التهم قراءة نفسه. لذلك، مجموعة صناديق المجاورة، مع مطابقة يقرأ في بن، في كتلة واحدة، أي. bedGraph شكل 13.
2B. منقط ملامح القراءة: رقاقة تجهيزها وملفات الإدخال BED لكشف البيانات في قمم المنقط
- تداخل الكلي ليقرأ المعالج حبلا زائد وناقص يقرأ بشكل منفصل. ينبغي أن حبلا محددة كثافة قراءة تشكيل الملف الشخصي ذات النسقين من قمم زائد وناقص. بالإضافة إلى اختيار أزواج / ناقص من قمم معظم المخصب واستخدام المسافة بين القمة على أنها تقدير لمكتبة طول القطعة.
- تحويل شريحة والمدخلات يقرأ نصف جنيه جزءngth إلى المركز وإعادة حساب الكثافة للقراءة بالإضافة إلى تحول ودمج وناقص يقرأ حبلا. اعتمد هذه المنهجية لتقدير طول جزء من تشانغ، وآخرون. 3. ينبغي تجميع مواقف متطابقة مع دمج التهم إلى كتل، على غرار الخطوة 2a.2.
3. تقدير متوسط الخلفي كلمة كثافة استخدام كل كتلة لدينا تقريب BCMIX
- وعلى غرار كثافة قراءة كل كتلة وتوزيع بواسون، تغييرنقاط POI (θ ر)، مع معلمة يعني بعد خليط من توزيعات غاما، Γ (α، β)، واحتمال مسبقة من نقطة التغيير التي تحدث في أي كتلة الحدود ع. تكييف تغييرنقاط POI (θ ر) على G (α، β) يجعل نموذج فعال لHMM الدولة لانهائية. تقدير فرط المعلمات، α، β، و ف، وذلك باستخدام أقصى احتمال الخلفي.
- حساب تقديرات بايز صراحة عنكل كتلة، ر θ، وE (θ ر | γ Z). استبدال المستهلكة التقليدية ولكن الوقت إلى الأمام والخلف الفلاتر غالبا ما تستخدم في HMMs، مع تقريب التعقيد أكثر كفاءة خليط حسابيا لتقدير وسائل يحدها الخلفي، θ ج. وسوف تنتج وسائل الخلفي يكون "ممهدة" في ملف تعريف تقريبي المستمر piecewise ولذلك يجب كتل مع ج، θ متطابقة، ومنعت كذلك مع الحدود تحديث الإحداثيات.
4A. نشر مقروءة الملامح: ما بعد العملية يعني الخلفي إلى قطاعات لتخصيب منتشر
- استخدام عدد من المدخلات يقرأ في كل كتلة جديدة ج θ، حيث وصل سعر الخلفية، تغييرنقاط POI (λ أ) وتحديد تخصيب باستخدام اختبار فرضية بسيطة، تنبني على ما إذا كان يعني رقاقة الخلفي، θ ج، يتجاوز بعض δ العتبة. ال 90 </ سوب>-quantile هو د الافتراضي وغير مناسبة في معظم الحالات.
- دمج المجاورة θ ج الكتل التي يتجاوز تخصيب في منطقة واحدة ودمج التقرير في شكل إحداثيات BED بسيطة. بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن تقرير θ ج لكل كتلة في شكل bedGraph للحفاظ على تفاصيل عالية الدقة للتقديرات الكثافة قراءة.
4B. منقط مقروءة الملامح: ما بعد العملية يعني الخلفي إلى المرشحين الذروة
- تحديد النسبة الخلفية، تغييرنقاط POI (λ أ)، ومتوسط قراءة جميع التهم الموجهة إليه (γ 2) وتحديد جميع الكتل التي تتجاوز عتبة، د. ومن المتوقع منذ قمم منقط إلى أن تكون أكثر بكثير المخصب، يتم تعيين الافتراضي إلى δ-quantile ال 99 من النقاط المهمة (λ أ).
- تعيين كتلة (ج) مع θ القصوى كمرشح قمة الذروة وتجاور كتل المرافقة التي تشترك في دين قراءة مماثلةsity (± 1 قراءة الاعتماد للسماح اختلاف طفيف). يتم تعريف هذه المنطقة ملاصقة كموقع مرشح ملزمة.
- حساب λ (2)، التهم متوسط قراءة في موقع المرشح المعالج اختبار الفرضية الملزمة وهذه الخلفية المدخلات مقابل كانت فرضية العدم، H 0، هو أن λ 1 ≥ λ (2) ورفض H 0 استنادا عتبة ف القيمة. قمم مرشح الإخراج في تنسيق BED.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BCP تتفوق في تحديد مناطق واسعة في تخصيب تعديل البيانات هيستون. كنقطة مرجعية، ونحن في السابق مقارنة نتائجنا لتلك التي SICER 3، أداة القائمة التي أثبتت أداء قويا. لتوضيح مزايا أفضل BCP، ودرسنا على تعديل هيستون التي تم دراستها بشكل جيد لإرساء أساس لتقييم معدلات النجاح. ومع وضع هذا في الاعتبار، ونحن ثم تحليلها H3K36me3، منذ فقد تبين أن أضم بقوة مع الهيئات الجينات المحولة بنشاط (الشكل 1). في المقابل، قد H3K36me3 أيضا ثبت أن تكون حصرية المتبادل لعلامات H3K27me3 القمعية. نحن الاستدانة مزيد من هذه العلاقات معروفة لتوضيح مزايا الأداء من BCP في دقة المكالمات الجزيرة من خلال تحديد جزء من التداخل مع الجمعيات المعروفة وdisassociations، في علاقة تأثير وارتباط مكافحة. هنا، ونحن كذلك إثبات مزايا إضافية باستخدام أمثلة BCPعالية الأداء.
أظهرت عملنا السابق ميل لحجم أكبر من ذلك بكثير في جزيرة BCP، 23،9 حتي 25،8 كيلوبايت، من SICER، 2،7 حتي 10،7 كيلو بايت؛ أكبر الجزر كونها أكثر انسجاما مع توقع التقليدية من الجزر المنتشرة واسعة من H3K36me3 تخصيب (بلوس شركات بيو، المقدم). بطبيعة الحال، أكبر الجزر وحده لا تشير الدقة. لذلك، قررنا مدى تداخل هذه المناطق مع الجينات المعروفة كان ويتناقض هذا مع درجة من التداخل بين الجينات مع الفضاء، مؤشرا على معدل إيجابية كاذبة (FPR). وتراوحت تغطية الجينات في BCP 0،492 حتي 0،497 مقارنة 0،276 حتي 0،437 في SICER دون التأثير بشدة FPR؛ التداخل بين الجينات نطاق 0،89 حتي 0،90 و0،85 حتي 0،98 في BCP وSICER، على التوالي. هنا، نقدم ممثل منطقة عرض إضافية علاقة وثيقة بين حدود تخصيب الجين وهيئات التمييز بوضوح بالموقع وقمعإد النسخ (الشكل 1). هذا يدعم مزيد من المطالبة في أن يحافظ على التداخل BCP عالية من الجينات النشطة H3K36me3 الجزر مع حدود تحالف وثيق للهيئات الجينات دون زيادة درجة التداخل إيجابية كاذبة مع الفضاء بين الجينات، الجينات مع النسخ المكبوت، أو علامة H3K27me3 القمعية.
في حين تقييم استنساخ BCP الجزيرة يدعو في مجموعتين البيانات تكرار، لاحظنا BCP لم تعاني من شدة الاعتماد على عمق التغطية قراءة في الخوارزمية المتنافسة، SICER. نحن نقدم أدلة إضافية من قوة BCP واستنساخ من خلال دراسة مناطق مختلفة إضافية تبين حدود الجزيرة يتفق على الرغم من انخفاض عمق التغطية (محاكاة عن طريق اخذ عينات من يقرأ مجموعة البيانات الكاملة) (الشكل 2).
لإظهار براعة تماما BCP، حصلنا على مجموعة واسعة من تعديل البيانات هيستون، بما في ذلك علامة المنقطق H3K27ac، H3K9ac، وH3K4me3، وعلامة منتشر، H3K9me3، بالإضافة إلى H3K27me3 وH3K36me3. قمنا بتحليل هذه البيانات يحدد باستخدام الإعدادات الافتراضية لكل من المعلمة وBCP SICER (الشكل 3). هذه العلامات تمثل مجموعة واسعة من قراءة ملامح الكثافة وتسمح لنا للتركيز على هذه المنطقة التي يوضح العديد من الميزات المرتبطة عادة معها. تقع في مركز التخصيب في H3K36me3 الجين PXDN بمناسبة النسخ النشطة. انخفاض متوقع في بداية النسخ موقع هي منقط إضافية، علامات بالموقع، H3K27ac، H3K9ac، وH3K4me3. فقط هو قمع المصب PXDN الفضاء بين الجينات التي تميزت H3K27me3 تخصيب اليورانيوم. على الجهة المقابلة تقع على الجينات المكبوتة H3K27me3. الانتقال خطوة أخرى من يتم إسكاتها لونين، كما يدل على ذلك وجود H3K9me3 تخصيب الذي يظهر للإشارة إلى إسكات SNTG2 وMYT1L، وربما إلى حد ما أقل عابرة ثم H3K27me3 القمع. هذه المنطقة تضم معظم الظواهر ENورد في ChIPseq من التعديلات هيستون ويوضح كيف أن الطبيعة الديناميكية لتحديد كل من BCP يمكن أستلة نقطي وعلامات H3K4me3 في الوقت نفسه التمييز جزر متجاورة كبيرة من H3K27me3 وH3K9me3 القمع وH3K36me3 النسخ النشطة. أن أكرر، يمكن BCP تفعل مثل كل هذه التحليلات ببساطة في الإعدادات الافتراضية و، كما يتبين ذلك، ما زالت تنتج نتائج جيدة، بغض النظر عن نوع البيانات. الخوارزمية هي أيضا سريعة وكفاءة الذاكرة، وبالتالي يوفر فائدة مقنعة من الناحية العملية.
الشكل 1. منتشر قراءة ملامح كثافة تعديلات بسيطة. H3K27me3 (أعلى) وH3K36me3 (القاع) تجسد واسعة، الجزر تخصيب منتشر يرتبط بقوة مع الهيئات الجين (مربعات خضراء). H3K27me3 يرتبط مع الجينات المكبوتة والفضاء بين الجينات وanticorrelates مع TR بنشاطالهيئات الجينات anscribed. العكس هو الصحيح لH3K36me3. تصور البيانات في متصفح الجينوم UCSC ( http://genome.ucsc.edu ).
الشكل 2. BCP قوية وقابلة للتكرار. الجزيرة يدعو H3K36me3 في اثنين ويعيد في أعماق أخذ العينات 30٪ و 50 و 70 من ورقة العمل كامل 1 تكرار حللت مع BCP. وتكرار الثاني، مع تغطية أقل بكثير للقراءة، عن المطالبة الجزيرة مماثلة وأبقي للغاية لدرجة التداخل بغض النظر عن نسبة العينات. وعلاوة على ذلك، ظلت الجزر دقة كما رأينا في محاذاة الحدود مع إغلاق الشروح RefSeq الجسم الجينات.
الشكل 3. BCP هو العكسخوارزمية البلاط التي يمكن تطبيقها على جميع أنواع هيستون تعديلات البيانات. واستخدمت BCP وSICER لتحليل سلسلة من أنواع البيانات، من علامات نقطية مثل H3K27ac، H3K9ac، وH3K4me3، لنشر مثل علامات H3K27me3، H3K36me3، وH3K9me3. باستخدام المعلمات الافتراضية لكل من الخوارزميات، BCP جزر التقاط كثافة اليورانيوم بغض النظر عن اتساع في حين SICER شظايا في كثير من الأحيان في العديد من المناطق شبه الجزر. حتى في حالة واسعة للغاية ومنتشر من H3K9me3، BCP والأداء معقول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
شرعنا في تطوير نموذج لتحليل البيانات التي يمكن أن ChIPseq تحديد كل منقط ومنتشر بشكل جيد على قدم المساواة هياكل البيانات. حتى الآن، كانت مناطق التخصيب، ولا سيما المناطق المنتشر، والتي تعكس حجم التوقع يفترض من جزيرة كبيرة ويصعب التعرف عليها. لمعالجة هذه المشاكل، ونحن استخدام التقدم في تكنولوجيا أحدث HMM، التي تمتلك العديد من المزايا أكثر النماذج القائمة والكشف عن مجريات الأمور HMMs أقل المبتكرة.
نموذجنا يجعل من استخدام إطار النظرية الافتراضية مع الصيغ الصريحة. هذا هو التمييز الحاسم من HMMs أخرى، لأنه يمكننا من حساب وسائل الخلفي، و. المتوقع قراءة كثافة كل قطعة، مع العمليات الحسابية البسيطة، بدلا من الاعتماد على المحاكاة وقتا طويلا ومكلفة حسابيا مثل سلسلة ماركوف طرق مونت كارلو ونتيجة لذلك، يتم تخفيض حساب لدينا بشكل كبير مرة ومتطلبات الذاكرة. استخدام عالية الأداء حساب مجموعات وايال المزدوج الأساسية، 2.0 غيغاهرتز مع العقد 2 غيغابايت من الذاكرة 64-بت لتحليل ~ 23000000 H3K27me3 يقرأ أو يقرأ ~ 21000000 H3K36me3، BCP استغرق أقل من ساعة للتحليل الجينوم مقارنة عدة ساعات إلى أيام اللازمة لأساليب أخرى. ويمكن تحقيق هذه timesavings فقط مع 2 غيغابايت من الذاكرة متواضعة.
بالإضافة إلى ذلك، الظروف نموذجنا مختلف وسائل كل قطعة، أي. النقاط المهمة (θ)، على توزيع غاما المستمر. أساسا، وهذا يسمح للدول ممكن لانهائية لكل قطعة. يمكن توفير أكثر من BCP التصنيفات الثنائية البسيطة من اليورانيوم مقابل الخلفية ويحافظ على كثافة المقادير قراءة لكل قطعة عن طريق وسائل الانتاج الخلفي.
ونحن أيضا الاستفادة من الخوارزمية BCMIX لتحقيق الكفاءة الحسابية. وهذا يمكن البحث عن نقاط شاملة بالقرب تغير بين التخصيب وخلفية كل المواقف الجيني ممكن. هذا يوفر دقة متزايدة لا جonfined من تعريفات إطار التعسفي، مع تأثير ضئيل على وقت التشغيل أو مطالب الذاكرة.
ويتم إنجاز كل هذا دون احداث بلبلة دقة، سواء من الناحية النظرية، منذ النموذج هو دقيق إحصائيا وتتقارب نتائجها إلى مقدر النظرية الافتراضية، وكذلك من الناحية العملية، كما بينا ذلك من هنا. تغطية الجينات من نتائجنا تشير H3K36me3 المكالمات الجزيرة هي درجة عالية من الدقة دون التعدي في الفضاء بين الجينات المعروفة استبعاد بعضها بعضا أو تخصيب H3K27me3. كانت النتائج استنساخه بشكل ملحوظ وقوي وأظهرت الاعتماد قليلا على عمق التغطية، داعيا جزر مماثلة مع تغطية عالية والجينات FPR منخفضة على الرغم من أعماق أخذ العينات منخفضة تصل إلى 30٪. كان يستخدم على نطاق واسع BCP، دون أية تعديلات على المعلمات الافتراضية، لتحليل مجموعة واسعة من البيانات وتعديل هيستون النسخ ChIPseq عامل وأداء جيدا في جميع الحالات. نأمل أنه نظرا لدقتها العالية، متانة، واستنساخ، BCP سيكون بمثابة فعالةأداة لتحليل البيانات، والتعاون، والتثبت في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
STARR مؤسسة جائزة (MQZ)، NIH منحة ES017166 (MQZ)، NSF منحة DMS0906593 (HX).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Linux-based workstation |
References
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat. Rev. Genet. 10, 669-680 (2009).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Zhang, Y., et al.
- Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25, 1952-1958 (2009).
- Jothi, R., Cuddapah, S., Barski, A., Cui, K., Zhao, K. Genome-wide identification of in vivo protein-DNA binding sites from ChIP-Seq data. Nucleic Acids Res. 36, 5221-5231 (2008).
- Qin, Z. S., et al. HPeak: an HMM-based algorithm for defining read-enriched regions in ChIP-Seq data. BMC Bioinformatics. 11, 369 (2010).
- Song, Q., Smith, A. D. Identifying dispersed epigenomic domains from ChIP-Seq data. Bioinformatics. 27, 870-871 (2011).
- Spyrou, C., Stark, R., Lynch, A. G., Tavaré, S. BayesPeak: Bayesian analysis of ChIP-seq data. BMC Bioinformatics. 10, 299 (2009).
- Lai, T., Xing, H. A simple Bayesian approach to multiple change-points. Statistica Sinica. , (2011).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nat. Methods. 4, 651-657 (2007).
- Stitzel, M. L., et al. Global epigenomic analysis of primary human pancreatic islets provides insights into type 2 diabetes susceptibility loci. Cell Metab. 12, 443-455 (2010).
- Bernstein, B. E., et al. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat. Biotechnol. 28, 1045-1048 (2010).
- Karolchik, D., et al. The UCSC Table Browser data retrieval tool. Nucleic Acids Res. 32, 493-496 (2004).
- Matys, V., et al. TRANSFAC: transcriptional regulation, from patterns to profiles. Nucleic Acids Res. 31, 374-378 (2003).
- Portales-Casamar, E., et al. JASPAR 2010: the greatly expanded open-access database of transcription factor binding profiles. Nucleic Acids Res. 38, D105-D110 (2010).
