Summary
我们描述了一种电化学传感器的测定方法，细菌的快速检测和识别。的测定法涉及官能化的传感器阵列与DNA的核糖体RNA（rRNA基因）的种属特异性序列的寡核苷酸捕捉探针。目标rRNA基因的捕获探针和辣根过氧化物酶相连的DNA寡核苷酸检测探针的夹心杂交产生可测量的安培电流。
Abstract
电化学传感器被广泛用于快速，准确地测量血糖，并能适用于各种各样的分析物的检测。电化学传感器操作成一个有用的电信号传导生物识别事件。信号转导的发生了耦合到安培的电极的氧化还原酶的活性。传感器的特异性，使用固有特性的酶，葡萄糖氧化酶的葡萄糖传感器的情况下，或的酶和抗体，该抗体或探针之间的关系的商品。
在这里，我们描述的电化学传感器检测方法直接探测和识别细菌。在每一种情况下，这里所描述的探针DNA的寡核苷酸。此方法是基于夹心杂交的捕获和检测探针与目标的核糖体RNA（rRNA基因）。捕获探针被固定到所述传感器表面，而检测器的探头与步骤horseradish过氧化物酶（HRP）。当基片，例如3,3'，5,5' - 四甲基联苯胺（TMB）被添加到绑定到其表面上的复合物与捕捉目标检测器的电极被氧化，在基板由HRP减少工作电极。此氧化还原循环的结果是穿梭的电子从电极到辣根过氧化物酶的底物，生产电极中电流的流动。
Introduction
使用rRNA基因作为目标分子的细菌检测和鉴定了许多优点。 rRNA基因在细菌细胞中的丰度低至每毫升250个细菌提供了一个灵敏度极限，而不需要对目标扩增1。包含独特的物种特异性细菌rRNA基因序列与DNA探针杂交。因此，电化学传感器的阵列可用于识别未知的细菌，其中每个传感器与不同的种属特异性捕获探针官能。应积极控制传感器包括合成的寡核苷酸的目标，“小桥流水”的捕获和检测探针，建立内部校准信号。
电化学传感器有着广泛的基础和转化研究中的应用。例如，这里所描述的测定法被用于精确测量大肠杆菌的效果大肠杆菌生长阶段RRNA和预rRNA基因的拷贝数，这是极大的兴趣，感兴趣的研究人员在细菌生理学2。电化学传感器测定的灵敏度确定的信号噪声比。已探索各种信号放大和降噪方法。我们发现，改善传感器的表面的化学性质，以减少检测器的探头和/或HRP酶的非特异性结合是关键的。混合单层的alkanedithiols mercaptohexanol特别是，已经发现，以减少背景更完全地覆盖在电极表面，同时保持可访问性的捕获探针的目标杂交3。在这些表面化学处理涉及复杂生物样品的分析是特别重要的。
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Protocol
1。电化学传感器的官能
- 制备巯基化的捕获探针的浓度为0.05μM，300μM1,6 - 己二硫醇（HDT）的10mM的Tris-HCl，1mM EDTA和在黑暗中孵育10分钟，在室温下，pH值8.0，0.3M NaCl的。孵化的巯基化的捕获探针与HDT确保捕获探针的硫醇基团上的减少，导致更一致的结果。
- 氮气流中应用裸金16的传感器阵列芯片（s），持续5秒，以除去水分和/或颗粒物。
- 6微升的HDT-巯基化的捕获探针混合物应用到所有的16个传感器的传感器阵列的工作电极，并在有盖培养皿中存储的传感器芯片（次），在4℃下过夜。巯捕获探针直接绑定到裸金电极和HDT起到防止装填过量的捕获探针，并让他们在一个伸展的构象，促进杂交与目标。
- 该第二天，洗涤的去离子H 2 O的传感器芯片，具有2〜3秒，干燥氮气流中下持续5秒。
- 适用于6微升的10mM的Tris-HCl，1mM EDTA的0.3M NaCl的pH值为8.0，1 mM的6 - 巯基-1 - 己醇（MCH），所有的16个传感器，并孵育50分钟的工作电极。这和所有随后的传感器芯片孵育在有盖的培养皿中，在室温下进行。 MCH作为封端剂，巯基化的捕获探针或热变形温度是在电极表面上不存在的任何间隙填充。
2。样品制备
- 吸取1毫升细菌培养的数生长期（OD 600≈0.1）离心管和离心16,000 XG 5分钟。取出培养物上清液。将细菌沉淀可立即处理，或储存于-80℃供以后使用。
- 彻底将细菌沉淀重新悬浮于10μl的1 M NaOH中，通过将移液管尖的机器人TOM离心管吹打向上和向下几次。悬浮液在室温下孵育5分钟。
- 中和细菌裂解液加入50μl的1M磷酸缓冲液，pH值7.2，含2.5％牛血清白蛋白（BSA）和0.25 mM的荧光素改性的探针检测器。孵育10分钟，在室温下中和裂解液。荧光改性探测器探针杂交细菌rRNA的目标分子。
3。电化学传感器检测
- 从所述传感器芯片与去离子H 2 O洗涤的MCH为2-3秒，干燥氮气流中下，持续5秒。
- 适用于中和细菌裂解液4微升各14个传感器的工作电极上，并孵育15分钟。目标检测探针复合杂交巯基化捕获探针固定。
- 应用4微升1纳米桥寡核苷酸在1M磷酸缓冲液，pH值7.2，含2.5％BSA和0.25＆亩，M荧光改性探测器探头2阳性控制传感器（用于信号正常化）和孵育15分钟。
- 在2-3秒，干燥洗净的传感器芯片与去离子H 2 O下氮气流中，持续5秒。
- 应用在1M磷酸盐缓冲液，pH 7.2，含有0.5％酪蛋白的所有的16个传感器的工作电极上的4微升0.5 U / ml的抗荧光素-HRP孵育15分钟。的抗荧光素-HRP结合到固定化的荧光素改性探测器探头。
- 在2-3秒，干燥洗净的传感器芯片与去离子H 2 O下氮气流中，持续5秒。
- 以及应用的膜，贴纸的表面进入传感器芯片安装在传感器芯片和负载。吸取50μLTMB底物到所有16个传感器和接近传感器芯片安装。
- 获取安培法和循环伏安法测量所有16个传感器使用的Helios芯片读卡器。安培的电流是成比例的汇率的TMB r在传感器表面上的排出（参见图1）。
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Representative Results
我们描述了同样的结构的双抗体夹心ELISA的电化学检测。在图1中所示，目标核糖体RNA（rRNA基因）杂交，捕获和检测探针开发的催化氧化还原反应的HRP标记的抗荧光素抗体片段结合到探测器上的探针的3'荧光素联动。检测灵敏度的一个重要组成部分是金电极的表面化学性质。我们已经发现，由巯基化的捕获探针，mercaptohexanol，和己二硫醇组成的三元单层显着提高了信号-噪声比通过减少非特异性背景结合的报告蛋白3。这里所描述的试验雇用GeneFluidics 16的传感器阵列芯片， 如图2所示。在数组中的每一个传感器都包含三个电极，工作中，参考，和辅助，其中有在芯片4的边缘的接触点。该芯片读呃有与各接触点连接的弹簧单高跷销。该芯片读取器作为传感器阵列的一个接口，用于通过一个电位器控制的计算机算法。
图3中所示实施例的电化学传感器的电流。中的电流传感器安培测量开始后的最初几秒钟期间，因为从应用到传感器表面发起的读者算法的TMB的时间内积累的氧化基板虚高。当前流量迅速达到一个稳定的状态，并可靠地获得精确的传感器读数可以在六十秒。通常传感器的测定一式两份进行，作为内部控制传感器变异。我们已经发现，传感器到传感器的可变性是相对恒定的，因此它是能够进行16种不同的传感器检测并行上GeneFluidics 16传感器阵列芯片。阳性和阴性对照埃森TIAL。作为阳性对照，包括合成的“桥接”的DNA寡核苷酸杂交的捕获和检测器探头作为一种人工合成的已知浓度的目标。以这种方式，得到的结果使用桥接的寡核苷酸作为内部校准控制功能，以尽量减少芯片到芯片的变化。
测试时，捕获和检测探针，检测限应确定由已知浓度的样品连续稀释。 如图4所示，样品的浓度和测定的动态范围的信号输出超过数-对数的线性相关性。的检出限被定义为目标所需的浓度，以产生一个信号大于背景信号5的平均值，标准偏差是3.29。为了确定未知样品中的细菌，一组相关的捕获和检测器探头对被选中。探头的选择我这决定了怀疑在一个特定类型的样品的细菌类型。当然，偶尔可以找到不同寻常的细菌，在任何样品，所以我们建议包括有能力杂交保守的rRNA区域的任何细菌，真细菌探针对图5显示了具有代表性的结果，样品中含有大肠杆菌 。 大肠杆菌和K。肺炎 ，这是经常尿路感染患者尿液中发现。传感器的信号将是低的和类似的，这些阴性结果可合并使用作为背景信号。
图1。金电极的电化学传感器测定的概略图。涂覆与mercaptohexanol和己二硫醇，并通过加入官能化的巯基化的DNA寡核苷酸捕获探针（蓝色）。夹心ħybridization目标的16S rRNA的DNA寡核苷酸捕捉探针和荧光素标记的DNA寡核苷酸检测探针（红色），结果，在检测到一个复杂的，通过加入抗荧光素 - 辣根过氧化物酶（HRP）结合和TMB底物。安培的电流所产生的氧化还原循环，从氧化TMB HRP和减少由电子从电极的TMB的结果。
图2。细菌鉴定传感器阵列和芯片安装在阵列中的每个传感器包括三个电极：中央工作电极的圆周的参比电极和辅助电极信号稳定。阵列中的每个传感器的工作电极与面板中的捕获探针的特定细菌种类还官能（ 见表3），因为我们会作为欧盟（真细菌）的捕获探针杂交的所有细菌的16S rRNA分子和BrOl的“桥接”的寡核苷酸，作为阳性对照信号校准功能。信号的测量是通过放置在一个芯片上的阅读器与弹簧单高跷销阵列，接口与传感器电极的接触点。
图3。平行阵列中的所有16个传感器在测量过程中安培的电流输出。安培的电流测量。当前流动最初是极为不利的，因为氧化TMB底物的积累，将阵列连接到芯片的读者，开始测量前。此后，电流迅速稳定和传感器的读数记录在60秒。具有更大的负电流的电极具有最高的信号。
“图4”SRC =“/ files/ftp_upload/4282/4282fig4.jpg”/>
图4。串行稀释十倍的大肠杆菌串行10倍稀释的已知浓度的大肠杆菌， 大肠杆菌 ，以确定检测极限。传感器，一式两份进行测试大肠杆菌裂解物。所观察到的信号的读数，绘制为黑色圆圈，被用来预测一个理想化的信号曲线。合并的标准偏差为所有复制和被用来计算检测（蓝线），定义为在背景3.29标准偏差的限制，在最低的目标浓度的背景信号。
图5。代表电化学传感器的检测结果，对大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌 ， 大肠杆菌大肠杆菌和K。 pneumonIAE 表2和3中所述的探针对反应性进行了测试。反应与KE探头对区分K。从大肠杆菌肺炎大肠杆菌桥接的寡核苷酸（BrOl）作为阳性对照，内部校准标准。
| 探测器名称 | 核糖体亚基和地点* | 序列 |
| KE第10米 | 16S 74 | 5'-S AGCTCTCTGT的 |
| KE侦探11M | 16S 63 | 5'-GCTACCGYTCG-F |
| EK第15米的 | 23S 1492 | 5'-AGCCTTGATTTTCCG-S |
| EK侦探15米 | 23S 1507 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EL第17米的 | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAAAAGGTACCG-S |
| EL第18米的 | 23S 1507 | 5'-AGCGTTAADAAGGTACCG-S |
| EL侦探15米 | 23S 1492 | 5'-F-TCGTCATCACACCTC |
| EB第23M | 16S 1275 | 5'-S ACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCT的 |
| EB侦探23M | 16S 1252 | 5'-CGCGAGGTCGCCTTCCTTTGTAT-F |
| PM第15米 | 16S 183 | 5'-S TTTGGTCCGTAGACA的 |
| PM侦探17米 | 16S 166 | 5'-TTATGCGGTATTAGCCA-F |
| PA第11M | 16S 453 | 5'-S ACTTACTGCCC的 |
| PA侦探14米 | 16S 439 | 5'-TTCCTCCCAACTTA-F |
| 欧盟GN第19M | 16S 1502 | 5'-S GTTCCCCTACGGTTACCTT的 |
| 欧盟侦探18M | 16S 1484 | 5'-GTTACGACTTCACCCCAG-F |
| 欧盟BrOl37米 | 5'-CTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAAC的 |
表2中。 DNA寡核苷酸探针对序列捕捉“（第）探针的合成与巯基键（S）。检测器（DET）探针的合成与荧光素（F）的修改。需要注意的是探针对涉及5'-巯基化的捕获探针和3'-荧光素改性的检测探针或3'-巯基化的捕获探针和5'-荧光素改性的检测器探头。两个EL捕获探针在使用前混合。为了简化检测，检测器探头可以被应用到每个传感器作为没有显着的交叉反应性的混合物。 KE - 克雷伯氏菌和阴沟 ，EK - 大肠杆菌和K。肺炎 ，EL - E. EB - 阴沟肠杆菌 ， 肠杆菌科 ，下午- 体育杆菌 ，PA - P。铜绿假单胞菌 ，欧盟-真细菌，BrOl的-过渡寡核苷酸。 * - n号位置深茶色的距离指的16S或23S基因的启动。
| 细菌种类 | 活性探针对 |
| 大肠埃希氏菌 | EK + EB |
| 肺炎克雷伯氏菌 | KE + EK + EB |
| 奇异变形杆菌 | PM + EB |
| 铜绿假单胞菌 | PA |
| 肠杆菌属 | KE + EB或EL + EB或KE + EL + EB |
表3中。探针对识别的细菌种类。
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Discussion
这里描述的电化学传感器测定使靶核酸的快速检测。的敏感性和特异性取决于靶 - 探针杂交的自由能，而这又取决于捕获和检测器探针的长度和GC含量的一部分。我们通常执行的的杂交步骤在环境温度（约20℃）5，6。然而，在杂交步骤（3.2和3.3）也可以在杂交烘箱中在较高温度下进行，如果芯片被放置在有盖的腔室，其中包含湿润滤纸，以防止蒸发7，8。获得最佳的信号与检测器捕获探针杂交的靶核酸不相邻的网站上的杂交位点8之间的间隙的对。通过碱基对的堆叠和杂交无障碍相邻的区域，被称为一个“助手探针”的效果通过增加这个信号增强被认为是工作。捕获检测概率ê杂交到相邻站点也很重要，因为碱裂解的细菌导致碎裂的rRNA的目标5。此方法可应用到的RNA或DNA的检测，与各种临床和研究的应用程序。例如，它应该是可以使用此方法来研究细胞功能调节的小分子RNA或DNA或mRNA的检测抗生素抗性基因目标。预扩增，可能是必要的，以检测低拷贝数存在于目标。此外，核糖核酸酶抑制剂应加样品制备过程中潜在的不稳定的RNA目标，防止退化。
这种方法有几个优于其他方法的检测和识别细菌。标准的临床微生物学方法需要识别方法进行定量分析和应用琼脂培养基上的细菌生长。可见菌落的细菌增长通常涉及孵育过夜，大大延迟时间从标本采集结果的报告。有极大的兴趣，发展更加快速，病原体检测的分子生物学方法，包括电化学传感器9。然而，很少有人注意原料的生物样品的DNA生物传感器的性能。这里描述的电化学传感器检测可以直接进行血清和尿液样本，没有重大损失的灵敏度7。巯基化的捕获探针的使用，这里描述的混合单分子膜呈现在传感器表面耐非特异性蛋白质的吸收，保持在原始生物标本包括血清或尿10的灵敏度。尽可能少的为每个传感器1细菌细胞（每毫升250个细菌）是可以检测到的，这是媲美的灵敏度PCR扩增技术1。已经描述了11，1的几个基于PCR的细菌鉴定方法2。虽然PCR可以检测潜在的比这里描述的电化学传感器测定目标分子较少，基于PCR的方法已取得了有限的采用，因为高设备的购置和/或试剂的成本，相对于标准的临床微生物学方法。与此相反，电化学传感器是相对廉价的生产。即使制作电极由金溅射，每个芯片上的金的量是低的，因为电极的厚度为1000埃。
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Disclosures
所有的作家都描述的方法相关专利的发明者。这些专利之一已授权公司Qvella的。 BMC和DAH权益在Qvella公司。 VG是的总统GeneFluidics，电化学传感器阵列芯片的制造商，芯片的贴装，本文中所描述的芯片读卡器。
Acknowledgments
支持这项研究是由国家过敏和传染病研究所的合作协议奖AI075565（DAH）和温迪和肯红宝石基金在小儿泌尿外科研究卓越。 BMC是在小儿泌尿外科Judith和主席罗伯特·温斯顿。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. | |||
References
- Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
- Halford, C., et al. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform. Antimicrob. Agents Chemother. 56, In Press (2012).
- Campuzano, S., et al. Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples. Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).
- Gau, V., et al. Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification. Methods. 37, 73-83 (2005).
- Patel, M., et al. Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens. J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).
- Mastali, M., et al. Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature. J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).
- Liao, J. C., et al. Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens. J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).
- Liao, J. C., et al. Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection. J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).
- Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms. Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).
- Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples. Talanta. 85, 1330-1337 (2011).
- Ecker, D. J., et al. Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology. Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).
- Casalta, J. P., et al. Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).
