Summary
Wir beschreiben die schnelle Isolierung von primären murinen Typ II Alveolarepithelzellen (AECII) mittels Durchflusszytometrie negative Selektion. Diese AECII zeigen eine hohe Rentabilität und Reinheit und sind für ein breites Spektrum von funktionellen und molekularen Untersuchungen hinsichtlich ihrer Rolle bei der respiratorischen Erkrankungen wie Autoimmun-und Infektionskrankheiten geeignet.
Abstract
In den letzten Jahren hat sich der Beitrag des alveolären Typ II Epithelzellen (AECII), um verschiedene Aspekte der Immunregulation in der Lunge zunehmend anerkannt. AECII Es wurde gezeigt, der Zytokinproduktion in entzündeten Atemwegen teilzunehmen und sogar als Antigen-präsentierende Zellen sowohl Infektion und T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankungen 1-8. Daher sind sie besonders interessant auch in klinischen Kontexten wie Atemwegs-Hyperreaktivität der Außen-und Selbst-Antigene sowie Infektionen, die direkt oder indirekt abzielen AECII. Allerdings bleibt unser Verständnis der detaillierten immunologische Funktionen durch alveolare Typ II Epithelzellen in der gesunden Lunge sowie bei Entzündungen serviert fragmentarisch. Viele Studien zur AECII Funktion erfolgt über Maus oder Mensch Alveolarepithelzellen Zelllinien 9-12. Arbeiten mit Zelllinien bietet sicherlich eine Reihe von Vorteilen, wie zum Beispiel die Verfügbarkeit von großen Zahlen of Zellen für umfangreiche Analysen. Wir glauben jedoch, die Verwendung von primären murinen AECII ermöglicht ein besseres Verständnis der Rolle dieses Zelltyps in komplexen Prozessen wie Infektionen oder Autoimmunerkrankungen Entzündungen. Primäre murine AECII können direkt von Tieren, die an solchen Atemwegserkrankungen, das heißt, sie galten alle weiteren äußeren Faktoren eine Rolle spielen, in der analysierten Einstellung isoliert werden. Als ein Beispiel können lebensfähige AECII aus Mäusen intranasal mit Influenza A-Virus, das in erster Linie an diese Zellen zur Replikation 13 infiziert isoliert werden. Wichtig ist, dass durch die ex vivo Infektion AECII von gesunden Mäusen isoliert, können Untersuchungen der zellulären Reaktionen auf die Infektion montiert werden weiter ausgebaut.
Unser Protokoll für die Isolierung von primären murinen AECII auf enzymatische Verdauung des Mauslunge durch Markieren des resultierenden Zellsuspension mit Antikörpern, die für CD11c, CD11b, gefolgt F4/80 basiert,CD19, CD45 und CD16/CD32. Körnigen AECII werden dann als unmarkiertem und seitliche Streuung hoch (SSC hoch) Zellpopulation identifiziert und durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung 3 getrennt.
Im Vergleich zu alternativen Methoden zur Isolierung von primären Epithelzellen aus Mauslungen ergibt unserem Protokoll für die durchflusszytometrische Isolierung AECII durch negative Selektion unberührt, sehr überlebensfähig und pure AECII in relativ kurzer Zeit. Zusätzlich und im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren zur Isolierung durch Schwenken und Depletion von Lymphozyten durch Bindung von Antikörper-gekoppelten Magnetkügelchen 14, 15, ermöglicht flusszytometrischen Zellsortierung Diskriminierung mittels Zellgröße und Granularität. Da Instrumentation für die durchflusszytometrische Zellsortierung zur Verfügung steht, kann das beschriebene Verfahren bei relativ niedrigen Kosten angewendet werden. Neben Standard-Antikörpern und Enzymen für Lungen-Zerfall, keine zusätzlichen Reagenzien wie z. B. magnetischeKügelchen benötigt. Die isolierten Zellen eignen sich für eine breite Palette von funktionellen und molekularen Studien, die in vitro Kultur und T-Zell-Stimulation Assays sowie Transkriptom-, Proteom oder Sekretom Analysen 3, 4 enthalten.
Protocol
Details bezüglich erforderlichen Reagenzien und Materialien sind in der Tabelle am Ende des Protokolls unten aufgeführt. Vor Beginn der Arbeiten, bereiten 15 ml Röhrchen (eine pro Maus) mit 4 ml Dispase und Vorwärmen sie 37 ° C in einem Wasserbad. In einem Heizblock, kurz erhitzen kleinen Aliquots von 1% Low-Melt-Agarose (in Wasser) auf 95 ° C bis verflüssigt und anschließend kühlen bis 45 ° C bis zur Verwendung.
Ein. Vorbereitung der Maus Lung
- Sacrifice der Maus durch CO 2 Ersticken. Anmerkung: Führen Genickbruch da dies die Trachea verletzen wird, so dass im Anschluss Schritte des Protokolls, wie Installation der Lunge mit Flüssigkeit kann nicht erfolgreich durchgeführt werden. Stellen Sie sicher, Verlust von nozizeptiven Reflexen.
- Sprühen Sie die Maus mit Ethanol und einen langen Schnitt entlang der ventralen Mittellinie des Körpers. Ziehen Sie das ventrale Fell und Haut und später auch sorgfältig geschnitten und entfernen Sie das Bauchfell.
- Exsanguinate dieMaus, indem Sie die linke und rechte Halsschlagader (Vena jugularis) sowie die Nierenarterie (Arteria renalis). Entfernen fließt Blut mit Gewebe.
- Sorgfältig Punktion und entfernen Sie dann die Membran, die Herz und Lunge durch Wegschneiden die Rippen aussetzen. Achten Sie besonders darauf, um die Lunge zu verletzen.
- Mit einer 26G Kanüle und einer 10 ml-Spritze mit kalter Phosphat gepufferten Kochsalzlösung (PBS), Punktion der rechte Ventrikel des Herzens und der Lunge perfundieren mit PBS bis sie frei von Blut.
- Schneiden und entfernen Sie die Speicheldrüsen die Luftröhre aussetzen. Auch sorgfältig schneiden die Muskeln rund um die Luftröhre.
- Legen Sie eine 22G Verweilkanüle in die Luftröhre, entfernen Sie die Nadel und drücken Sie die Kunststoff-Katheter in Richtung der Lunge. Befestigen Sie den Katheter durch die Kopplung ein kleines Stück Garn um Luftröhre und Katheter.
2. Enzymatische Verdauung des Lungengewebes
Falls gewünscht, kann eine bronchoalveoläre Lavage Fluidprobe seinhergestellt durch Spülen der Lunge durch den Katheter in die Trachea mit PBS oder Medium eingeführt, bevor der nächste Schritt.
- Verwendung einer 2 ml Spritze, sorgfältig instill ein maximales Volumen von 2 ml Dispase (aus 4 ml Aliquot) in die Lunge durch den Katheter, so dass alle Lappen vollständig expandiert werden. Tauschen Sie die Spritze mit einer 1 ml Spritze mit 0,5 ml des verflüssigten Agarose und auch in der Lunge zu vermitteln.
- Lassen Sie die Spritze auf dem Katheter zum Rückfluss der Agarose zu verhindern und sofort in die Lunge mit Labor Seidenpapier und Eis. Lassen Sie das Agarosegel für ein paar Minuten.
- Entfernen Sie das Seidenpapier, Eis, Spritze und Katheter, schneiden die Luftröhre und Verbrauchsteuern die Lunge, Herz und Thymus aus der Brust. Dann spülen die Lunge in einer Schüssel mit PBS und entfernen Sie das Herz, Thymus und die verbleibenden Luftröhre.
- Setz die Lunge in den verbleibenden 2 ml Dispase und Inkubieren bei Raumtemperatur für 45 min.
3. Vorbereitung der LungeZellsuspension
- Entfernen Sie die Lunge aus dem Dispase und übertragen sie in eine Schale mit 7 ml anti-CD16/32 Antikörper (1 ug / ml Endkonzentration) in DMEM-Medium und 100 ul DNase.
- Mit Pinzette vollständig zerfallen das Lungengewebe durch Auseinanderziehen und inkubiere für 10 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schaukeln auf einer Wippe auf 200 Umdrehungen pro Minute. Falls gewünscht, kann die Zellsuspension dann bei 4 ° C bis zum nächsten Schritt gespeichert werden.
- Filtern Sie die Zellsuspension durch Nylon Maschen zunächst mit 100 um und anschließend mit 70 um, 48 um und 30 um Poren. Kümmern, jeden Mesh sowie den Rohren und Geschirr gründlich mit DMEM spülen, um Verlust von Zellen zu minimieren und Ausbeute. Wenn Sie Pooling Proben werden, kann dies hier durch anschließendes Hindurchführen Zellen Suspensionen aus Mäusen der einen Gruppe durch das gleiche Filter erreicht werden. Erneuern Sie den Filter im Falle von Verstopfung.
- Abhängig von dem Volumen, das Filtrat zu übertragen, um einen oder mehrere 50 ml-Tuben undzentrifugieren für 15 min bei 160 × g und 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand.
- Resuspendieren des Zellpellets in 2 ml Erythrocyten Lysepuffer (0,15 M NH 4 Cl, 0,01 M KHCO 3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2) und schnell beenden Lyse durch Zugabe von 13 ml DMEM-Medium. Die Lösung wird in einem 15 ml Röhrchen und Zentrifuge für 12 min bei 160 × g und 4 ° C.
4. Antikörperfärbung für die durchflusszytometrische Cell-Sortierung
- Die Zellen in 3 ml primäre Antikörper-Cocktail, in DMEM-Medium in Verdünnungen für Durchflusszytometrie hergestellt. (Antikörper wurden bisher für optimale Arbeitsbedingungen Verdünnungen durch Färben 1 x 10 6 Splenozyten in einem Volumen von 100 ul titriert. Formate 3 ml der primäre Antikörper-Cocktail mit den optimalen Konzentrationen für jede der verwendeten Antikörper für Zellen aus bis zu fünf Mäusen gepoolt. Wenn mehr Mäusen zu einer Probe vereinigt werden, die Lautstärke einstellen).
- Zum Färben, inkubiere die Zellen für 10 min im Dunkelnbei 4 ° C.
- Waschen der Zellen durch Füllen des Rohres mit 15 ml DMEM-Medium und Zentrifugation für 12 min bei 160 × g und 4 ° C.
- Bei ungekoppelten oder biotinyliert Antikörper wurden in 4,1 verwendet: Entfernen Sie den Überstand und die Zellen in 2 - 3 ml sekundären Antikörper-Cocktail. Färbemittel für 10 min bei 4 ° C im Dunkeln.
- Waschen der Zellen durch Füllen des Rohrs mit DMEM und Zentrifugation für 12 min bei 160 × g und 4 ° C.
- Die Zellen in 1 ml DMEM und Vorfilter durch einen 50 um Filter in ein Rohr für die Zell-Sortierung. Optional: Zählen Sie die Zellen, um die gesamte Zellzahl in der Lunge Zellsuspension zu erhalten.
5. Zellsortierung
- Mischen Sie die Zellen durch Vortexen vor Sortierung. Verwenden Sie ein 100 &mgr; m Düse für Zell-Sortierung AECII. Umhüllungsfluid Druck sowie Laseremission und Detektionswellenlängen hängen vom Instrument zum flusszytometrischen Zellsortierung sowie den Fluorochromen im antib verwendetody Färbung.
- Gate auf den SSC hohen Zellen, die negativ sind für den Fluorochromen zum Färben und Sortieren in ein Röhrchen mit DMEM verwendet. Verwenden Vorwärtsstreuung Höhe (FSC-H) vs Bereich (FSC-A) und seitwärts Streuung Höhe (SSC-H) vs Bereich (SSC-A) Fenster, um alle Dubletten oder Zellverbände auszuschließen (siehe Einzelheiten der Gating-Strategie Abbildung 1 a).
- Um die sortierten Zellen Zentrifuge für 20 min bei 280 × g und 4 ° C gesammelt
- Resuspendieren der Zellen in Kultur-Medium oder Puffer wie für die spätere Analyse erforderlich.
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Representative Results
Beim Sortieren Lunge Zellsuspensionen aus gesunden Mäusen isoliert, wird die Gate-AECII typischerweise für etwa 42 ± 10% ausmachen aller Ereignisse. Dieser Prozentsatz kann merklich niedriger, wenn Mäuse mit Atemwegserkrankungen wie eine virale Infektion verwendet werden, wie die anfängliche Zellsuspension wird ein erheblich höherer Anteil von Lymphozyten und anderen Immunzellen rekrutiert zu den Atemwegen enthalten. Für AECII der IAV infizierten Lunge am Tag 3 nach der Infektion isoliert konnte eine Verringerung der Häufigkeit von Zellen in der AECII Gate von etwa 50% beobachtet.
Eine typische Art sowie Re-Analyse der sortierten Zellen ist in den Abbildungen 1 b und 1 c dargestellt. Wie angedeutet, entfällt die Reinheit der isolierten Zellen in etwa 92 ± 5%. In Abbildung 2a zeigen wir, dass erfolgreiche Trennung von reinen Zellpopulationen durch Färbung für Tensid-Proteine C, die ausschließlich ausgedrückt bestätigt werdenAECII 16, 17.
Wir haben beobachtet, dass die Anzahl der AECII je Tier isoliert hängt stark vom Mausstamm verwendet. Während BALB / c-Mäuse liefern typischerweise 1 x 10 6 AECII / Maus, die C57Bl / 6 Belastung nur Ausbeuten von 1 bis 3 x 10 5 AECII / Maus. Die Anzahl der Mäuse pro Experiment verwendet hängt daher von dem Maus-Stamm sowie der Art der nachfolgenden Analysen durchgeführt werden.
Hinsichtlich der Rentabilität der abgerufenen AECII wir in der Regel zu finden Überlebensraten von ca. 90% nach durchflusszytometrischen Zellsortierung. Dieser hohe Anteil von lebensfähigen Zellen werden dann erlaubt die direkte funktionelle Analysen sowie kurzfristigen Kultur der isolierten primären murinen AECII.
Abbildung 1. Übersicht over. das Gating Strategie zur Isolierung des flusszytometrischen primären murinen AECII durch negative Selektion verwendet. (A) Schematische Überblick über die Gating-Strategie. (B) Repräsentative Plots einer Lunge Zellsuspension sort. (C) Vertreter Ergebnis einer Re-Analyse der sortierten Zellen. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 2. Charakterisierung und molekulare Analyse der sortierten primären murinen AECII. (A) Cytospins sortierter AECII wurden für das Surfactant Protein C (SPC) gefärbt. Verglichen mit Phasenkontrastmikroskopie wurden nahezu 100% der Zellen gefunden werden SPC positiv. (B) Repräsentative RNA-Profil von sortierten primären murinen AECII nach der RNA-Isolation. Spezifische Peaks für 18S und 28S-ribosomalen RNA zusammen mit dem berechneten Faktor RIN repräsentieren RNA i ntegrity und Qualität für intakte isolierte RNA aus AECII.
Abbildung 3. Analyse des Influenza-A-Virus-Nukleoprotein (NP)-Expression in primären murinen AECII aus infizierten Mäusen isoliert. C57Bl / 6 Mäuse wurden intranasal verabreicht phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder Influenza-A-Virus PR8/A/34 an den Tagen 1, 2 oder 3 vor der Isolierung AECII . (A) Repräsentative Plots der Lunge Zellsuspensionen aus einem nicht infizierten sowie eine dreitägige infizierte C57BL / 6 Mäuse gebeizt zum Sortieren. (B) Influenza-A-Virus NP Expression in sortierter AECII wurde durch intrazelluläre Färbung mit einem NP-spezifischen Antikörper und anschließende durchflusszytometrische Analyse analysiert. (C) Die Tabelle zeigt die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) des NP-Färbung.
Abbildung 4. Analyse der Influenza-A-Virus Nukleoprotein (NP)-Expression in ex vivo infiziert primären murinen AECII. (A) Repräsentative durchflusszytometrische Analyse von ex vivo Influenza A-Virus infiziert PR8/A/34 AECII durch intrazelluläre Färbung für die Influenza-A-Virus NP 6 hr nach der Infektion. (B) Zusammenfassung der repräsentative Ergebnisse von NP-Färbung der ex vivo Influenza A-Virus infiziert AECII 6 h nach Infektion mit verschiedenen Virus-Verdünnungen.
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Discussion
Unser Protokoll für die Isolierung von murinen AECII durchflusszytometrisch bietet einen schnellen Weg für den Zugriff primären Zellen aus der Maus Lunge für eine ganze Reihe von funktionellen und molekulare Studien. Das beschriebene Verfahren liefert sehr überlebensfähig und reine Populationen AECII, die in ausreichender Zahl zur direkten nachfolgenden Analysen, wie RNA-Isolierung (siehe Bild 2b) und Transkriptom Studien sind. Für funktionelle Anwendungen ist es auch möglich, die Kultur isolierte Zellen, so dass z. B. die Erzeugung von AECII konditionierte Medium oder Co-Kultur-Experimente. Als Vorteil speziell für diese funktionellen Studien, liefert die Isolierung von Primärzellen durch negative Selektion, wie hier beschrieben unberührte Zellen, die nicht unterzogen wurden Antikörper-Bindung. Trotz der Vorteile der Untersuchungen in primären AECII gegenüber jenen in Zell-Linien durchgeführt wird, gibt es praktische Einschränkungen für die Verwendung dieser primären Zellen. Neben der reinen Beschränkung in Zahlen, Was möglicherweise nicht den Anforderungen des Studiums erfordern umfangreiche Screening, primäre AECII in Kultur überleben nur für eine begrenzte Zeit, die wir auf durchschnittlich rund 48 Stunden beobachtet. In diesen Kurzzeitkultur Experimenten haben wir die Wahl des Kulturmediums von der Art der nachfolgenden Assays das konditionierte Medium in AECII wurde verwendet und wurden zufriedenstellende Ergebnisse erzielt mit IMDM (IMDM Glutamax, Gibco Cat. Nr. 31.980), ergänzt mit 10% FCS, Standard-Antibiotika und 0,25 mM β-Mercaptoethanol.
Das hier beschriebene Protokoll zeigt eine relativ einfache und schnelle Weise zu isolieren lebensfähig und rein primären murinen AECII in guten Zahlen. Die Reinheit der Zellen ergab nach Trennung hängt entscheidend von dem Verfahren der Zell-Sortierung. Eine klare und starke Färbung der Zellpopulationen, die ausgeschlossen werden sollen, ist ebenso wichtig wie die strengen Gating auf den SSC hohen Veranstaltungen, so dass Verunreinigungen mit lymphoiden Zellen sowie ArtI Epithelzellen werden minimiert. Bezüglich der Ausbeute von abgetrennten Zellen haben wir beobachtet, dass dies durch umfangreiche Spülen von Rohrleitungen, Filter kämmt und Platten während der Herstellung der rohen Zellensuspension sowie durch vollständigen Zerfall des Gewebes nach enzymatische Verdauung wird maximiert. Ein Hauptvorteil der Arbeit mit primären AECII ist, dass sie direkt von den Hosts leiden an Erkrankungen der Atemwege isoliert werden. Solche AECII wird auf alle Faktoren, die in ihrer natürlichen Mikro-Umgebung und somit auch die in vivo Situation ausgesetzt gewesen. Anders als für den menschlichen AECII 18, 19, kann es zu einer Vielzahl von experimentellen Systemen verlängert werden beim Arbeiten in murine Modelle. Wir haben die Vorteile dieser in Studien zur autoimmunen Entzündung sowie virale Infektion der Lunge. Dabei fanden wir, dass AECII von Mäusen mit CD4 +-T-Zell-vermittelten Entzündungen der Atemwege exprimieren perfektes inflammatTheorie Gene, die ihr Potenzial zur Regulierung Lungenkrebs Immunreaktionen 3 demonstriert. Darüber hinaus könnten wir diese AECII Anzeige Selbst-Antigene durch Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse-II-Moleküle, die in der funktionellen Aktivierung von autoreaktiven CD4 + T-Zellen führt zu zeigen. Gleichzeitig AECII aufrechtzuerhalten Lunge Toleranz durch Sekretion Faktoren Förderung der Induktion der Foxp3 + regulatorische T-Zellen 4.
Bezüglich virale Infektion der Lunge haben wir erfolgreich primären AECII aus Mäusen mit Influenza A-Virus infiziert isoliert. Wie bereits oben erwähnt, hier AECII Konto für einen kleineren Anteil an der gesamten Lunge Zellsuspension, wie eine beträchtliche Anzahl von Immunzellen in der Lunge werden in Reaktion auf eine Infektion rekrutiert (siehe Abbildung 3a). Intrazelluläre Färbung des Influenza-A-Virus-Nukleoprotein (NP) in den isolierten Zellen zeigt die Steigerung der Expression des viralen Proteins im Laufe der Zeit wie in
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir möchten M. Höxter für die technische Unterstützung bedanken Sortieren primären murinen AECII vom Sicherheitsstufe 2 Proben.
Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) an die DB (SFB587, TP B12 und BR2221/1-1) und einem Stipendium der Hannover Biomedical Research School (DFG GSC 108), AA unterstützt. DB wird durch die Initiative des Präsidenten und Vernetzungsfonds der Helmholtz-Gemeinschaft Deutscher Forschungszentren (HGF) unter Vertrag Anzahl W2/W3-029 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| indwelling cannula Introcan 22G | Braun | REF 4252098B | |
| Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) | BD Biosciences | 354235 | aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C |
| Biozym Plaque Agarose | Biozym | 840101 | 1% w/v in H2O |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial | Sigma-Aldrich | D4263 | freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM |
| DMEM | Gibco | 22320-022 | used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES) |
| cell strainers (100 μm, 75 μm) | BD Falcon | 352360, 352350 | |
| nylon mesh(48 μm, 30 μm) | Bückmann GmbH | 03-48/26-1020, 03-30/18-108 | |
| CellTrics 50 μm filter | PARTEC | 04-0042-2317 | |
| anti-mouse CD16/CD32 | BioLegend | 101302 | clone 93; purified |
| anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123116 | clone BM8; APC coupled |
| anti-mouse CD11b | BioLegend | 101208 | clone M1/70; PE coupled |
| anti-mouse CD11c | BioLegend | 117310 | clone N418; APC coupled |
| anti-mouse CD45 | BioLegend | 103102 | clone 30-F11; purified |
| anti-mouse CD19 | eBioscience | 12-0193-83 | eBio 1D3; PE coupled |
| polyclonal goat anti-rat IgG | BD Pharmingen | 550767 | polyclonal, PE coupled |
Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available. |
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References
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