Summary
Oftalmologia fotoacústica (PAOM), uma modalidade de imagem óptico-absorção de base, fornece a avaliação complementar da retina para as tecnologias de imagem disponíveis atualmente oftálmicas. Relata-se o uso de PAOM integrado com espectral-domínio tomografia de coerência óptica (SD-OCT) para imagens multimodal simultânea da retina em ratos.
Abstract
Tanto o diagnóstico clínico e investigação fundamental de doenças oculares grandes beneficiar muito de diversas tecnologias não invasivas de imagem oftálmicas. Existentes modalidades de imagem da retina, como a retinografia colorida 1, oftalmoscopia confocal a laser (cSLO) 2, e tomografia de coerência óptica (OCT) 3, têm contribuições significativas no acompanhamento inícios de doenças e progressões, e desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. No entanto, eles predominantemente contar com os back-refletidas fótons da retina. Como consequência, as propriedades de absorção ópticas da retina, que são normalmente fortemente associados ao estado fisiopatologia da retina, são inacessíveis pelas tecnologias de imagem tradicionais.
Oftalmoscopia fotoacústica (PAOM) é uma modalidade de imagem emergente da retina que permite a detecção dos contrastes de absorção óptica no olho com uma alta sensibilidade 4-7. Em PAOM nanpulsos de laser osecond são entregues através da pupila e digitalizados através do olho posterior para induzir fotoacústica (PA), os sinais que são detectadas por um transdutor de ultra-sons sem foco fixado à pálpebra. Por causa da forte absorção óptica de hemoglobina e a melanina, PAOM é capaz de forma não invasiva de imagem os vasculatures retina e coróide e o epitélio pigmentar da retina (RPE) de melanina em contrastes elevados 6,7. Mais importante ainda, com base no bem desenvolvida espectroscópicos imagiologia fotoacústica 5,8, PAOM tem o potencial para mapear a saturação do oxigénio da hemoglobina em vasos da retina, o que pode ser fundamental para o estudo da fisiologia e da patologia de várias doenças que causam cegueira 9, tais como a retinopatia diabética e degeneração macular neovascular relacionada à idade.
Além disso, sendo a única existente modalidade de imagiologia óptica, a absorção baseada em oftálmico, PAOM pode ser integrado com o clínico bem estabelecido oftálmica imaging techniques para conseguir mais abrangentes estudos anatômicos e funcionais do olho baseada em múltiplos contrastes óticos 6,10. Neste trabalho, nós integramos PAOM e espectral de domínio outubro (SD-OCT) para simultaneamente em imagens da retina de ratos in vivo, onde tanto a absorção óptica e propriedades de dispersão da retina são revelados. A configuração do sistema de alinhamento do sistema, e de aquisição de imagem são apresentadas.
Protocol
1. Configuração do Sistema
- PAOM Subsistema
- Fonte de iluminação: um laser Nd: YAG (SPOT-10-100, Elforlight Ltd, UK: 20 μJ / pulso, 2 ns duração de pulso, 30 kHz máxima taxa de repetição de impulsos).
- O laser de saída em 1064 nm é freqüência dobrada para 532 nm por um beta-borato de bário (BBO) cristal (CasTech, San Jose, CA). Depois da separação ainda mais por um espelho de feixe de laser, 532 nm de luz é entregue através de uma fibra óptica de modo único (P1-460A-FC-5, Thorlabs), e 1064 nm do laser é gravada por um fotodíodo (DET10A, Thorlabs), o que desencadeia PA a aquisição de sinal.
- A luz de laser que sai da fibra óptica de modo único é entregue na retina por um galvanómetro (GM, QS-7, Nutfield Technology) e uma configuração de telescópio (f1 = 75 mm e f2 = 14 mm, Edmund Optics) 6.
- Um transdutor de agulha sem foco (40-MHz frequência central, de 16 MHz de largura de banda, 0,4 × 0,4 mm 2 tamanho elemento ativo, NIH Recursos Center para as Tecnologias de transdutor de ultra-som, a Universidade do Sul da Califórnia) é colocado em contato com a pálpebra para detectar os sinais PA gerados a partir da retina. Gel de ultra-sons (Sonotech) é aplicada entre a ponta do transdutor e da pálpebra animal para acoplamento acústico boa.
- O sinal é amplificado PA por dois amplificadores (ZFL-500LN +, Mini-circuitos, e 5073PR, Olympus), e é digitalizado por uma placa de aquisição de dados (CS14200, Gage Aplicada).
- SD-OCT Subsistema
- Fonte de luz baixa coerência: um diodo luminescente super-banda larga (IPSDD0804, InPhenix; centro de comprimento de onda: 840 nm; 6-dB largura de banda: 50 nm), que determina a resolução axial de 6 m.
- A luz de infravermelho próximo é dividido para referenciar braço e braço de amostra por um 50 × 50 acoplador de fibra de modo único personalizado (OZ Optics).
- Depois de combinar com PAOM luz que ilumina por um espelho quente (FM02, Thorlabs), braço de amostra outubro partes a digitalização mesmo e entrega óptica with PAOM 6.
- Um espectrômetro construídos em casa é usado para gravar os sinais SD-outubro de interferência, onde uma linha de varredura câmera CCD (Aviiva SM2, e2v) permite uma taxa de uma linha de 24 kHz. Projeto de espectrômetros típicos podem ser encontrados a partir de várias literaturas publicadas anteriormente 11 e fibra acoplados SD-outubro espectrômetros estão disponíveis comercialmente. A sensibilidade SD-OCT é medido para ser melhor do que 90 dB.
- Esquema de varredura
- Fast 2-D raster de varrimento do galvanómetro é controlado por uma placa de saída analógica (PCI-6731, National Instruments), que também acciona tanto o PAOM disparo do laser e a aquisição de sinal de outubro espectrómetro. Como resultado, as aquisições de dados em PAOM e subsistemas de outubro estão sincronizados.
- A aquisição de dados PAOM é desencadeada por uma gravação fotodiodo PAOM sequência de laser (ver 1.1.2).
- Imagens em 3-D de volume ou imagens 2-D de fundo de olho são construídos a partir de 256 B-scan imagens (256 linhas por A B-Digitalizar a imagem).
2. Alinhamento sistema
- Maximizar a eficiência de frequência de duplicação do cristal BBO e a eficiência de acoplamento da fibra óptica de modo único. Use óculos de proteção (LG3 Thorlabs) para o pessoal de protecção quando otimizando o PAOM luz iluminadora.
- Colimar o laser de fibra de saída PAOM a 2,0 mm de diâmetro.
- Alinhe as luzes de iluminação combinados de PAOM e SD-OCT para ser coaxial.
- Definir a luz de excitação PAOM em ~ 40 nJ / pulso e SD-OCT sondagem luz em ~ 0,8 mW, ambos os quais são descritos como sendo segura olho 6,12.
3. Imagem in vivo Multimodal Retinal
- Transferir o rato a uma caixa de polipropileno transparente, e anestesiar os animais com uma mistura de ar com isoflurano (Phoenix farmacêutica, Inc.) e normal a uma concentração de 1,5% e uma taxa de fluxo de 2,0 litros / min, durante 10 min.
- Contenha o rato anestesiado em um homemade suporte, com cinco eixos liberdade ajustável (Figura 1), e manter a sua temperatura corporal em ~ 37 ° C por uma almofada de aquecimento (Repti terma, laboratórios Zoomed, Inc.). Manter a anestesia por inalação de gás de ar isoflurano e normal misturada com a concentração de 1,0% e 1,5 litros / min velocidade de fluxo ao longo da experiência.
- Cortar a pestana usando uma tesoura cirúrgica, dilatar as pupilas com uma solução de 1% Tropicamida oftálmica e paralisam o músculo do esfíncter da íris usando 0,5% solução oftálmica Cloridrato de tetracaína. Aplicar gotas de lágrimas artificiais (Systane, Alcon Laboratories, Inc.) para o olho do rato a cada minuto para evitar a desidratação da córnea e formação de catarata. Monitorar a freqüência cardíaca de animais, respiração e oxigenação do sangue por um oxímetro de pulso (8.600 V, Nonin Medical, MN) durante o exame.
- Ligue SD-OCT luz que ilumina e verifique a luz sondagem para ser ~ mW 0,8.
- Ative a digitalização galvanômetro. Alinhe o SD-OCT entrega luz de irradiaçãosobre a retina de rato e identificar a região da retina de interesse (ROI), ajustando o detentor dos animais de cinco eixos. Aqui, o disco óptico é intencionalmente colocada no centro do campo de visão, enquanto o ROI deve ser seleccionado com base nos requisitos de pesquisa.
- Ajustar ainda mais o suporte de animal para optimizar as qualidades SD-outubro de imagem da secção transversal da retina em ambos os sentidos de digitalização (mudando a direcção de exploração de varredura) até que o melhor foco óptico é alcançado.
- Prepare o transdutor agulha sobre uma plataforma de cinco eixos ajustável, aplicar uma gota de gel de ultra-sons para a ponta do transdutor, e gentilmente contactar a ponta do transdutor para a pálpebra animal.
- Definir PAOM laser para o modo de disparo externo-, iniciar a digitalização galvanômetro, e activar visualização em tempo real de PAOM imagem da secção transversal da retina animal. Cuidadosamente ajustar a orientação do transdutor até que a imagem PAOM tem a melhor relação sinal-ruído (SNR) e, ao mesmo tempo, mostra uma forma uniforme distributed padrões de amplitude PA em ambos os sentidos de digitalização.
- Definir os parâmetros de digitalização, e realizar a gravação simultânea da retina da SD-OCT e PAOM. Reconstruir as imagens tridimensionais de SD-OCT e PAOM off-line. Nossos códigos de reconstrução foram escritos em Matlab e visualização tridimensional foi alcançado uing um freeware (Volview, Kitware). O algoritmo para SD-OCT reconstrução pode ser encontrada na Ref. 11. Eo algoritmo para PAOM reconstrução podem ser encontradas na referência. 6 e Ref. 13. Se necessário, repita os procedimentos de 3,7) -3,9).
- Depois de experimentar, desligar a luz SD-OCT sondagem, remover o animal de titular imediatamente, e mantê-lo aquecido até que acorda naturalmente. Manter o animal em um ambiente escuro por uma hora extra para os olhos para se recuperar. A duração total experimental, incluindo a anestesia dos animais ea aquisição de imagem, é inferior a 30 min, para um operador experimentado.
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Representative Results
A Figura 2 mostra as imagens de 2-D de fundus SD-OCT e PAOM adquirida simultaneamente em um rato albino (A e B) e um rato pigmentado (C e D), respectivamente. Nas imagens SD-OCT fundus (Figuras 2A e 2C), vasos retinianos têm aparência escura devido à absorção de hemoglobina de sondagem luz. Além de vasos da retina (RV na Figura 2B), visualiza-se os PAOM vasculatures coróide (CV na Figura 2B) em olho albino por causa da falta de melanina RPE. Porque olho pigmentado tem a concentração elevada de melanina, PAOM imagens RPE (Figura 2D), com alto contraste, para além dos vasos da retina. Em todos imagiologia da retina, o ângulo de varrimento máxima é de 26 graus e a aquisição de imagem leva ~ 2,7 seg. Para demonstrar a capacidade de imagiologia tridimensional de PAOM, uma representação volumétrica dos dados mostrados na Figura 2b é dado na Figure 3.
Figura 1. Fotografia do titular animal de cinco eixos. As setas 1-5 destacar as cinco liberdades ajustáveis ea seta seis destaques a restrição animal.
Figura 2. Simultaneamente adquirido SD-OCT (A e C) e PAOM (B e D) de imagens de fundo de olho. A) e B) são adquiridos a partir de um rato albino, e C) e D) são adquiridos a partir de um rato pigmentado. RV: vaso da retina; CV: navio coróide; RPE: epitélio pigmentar da retina. Barra: 500 um.
<strong> Figura 3. visualização volumétrica de PAOM em uma retina de ratos albinos.
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Discussion
Aqui, apresentamos uma instrução detalhada em simultâneo em imagens da retina in vivo de olhos de ratos usando PAOM combinado com SD-outubro Optical-dispersão baseada SD-OCT é, talvez, o "padrão de ouro" para imagiologia clínica retiniana 3, porém, não é sensível para detectar a absorção óptica na retina. O PAOM recentemente desenvolvido é o único óptico-absorção baseada em modalidade de imagem oftálmico que fornece propriedades de absorção óptica da retina 6. Porque hemoglobina e melanina são endogenamente fortes ópticos pigmentos absorventes, PAOM permite a investigação da anatomia e funções dos vasos da retina / coróide e do RPE, sem recorrer a agentes de contraste adicionais.
Em PAOM, o transdutor de ultra-sons sem foco tem uma região de sensibilidade limitada (~ 2,8 x 2,8 mm 2) 10, devido ao seu elemento finito activa, o que faz com que a sensibilidade de detecção de sinais de decomposição de PA para tele periferia do campo de visão (FOV). Assim, o ângulo de inclinação do transdutor deve ser cuidadosamente ajustada para se obter um FOV homogénea da retina. Uma substituição potencial para o transdutor piezoelétrico tradicional consiste em aplicar o anel de micro-ressoador, que tem de ruído mais baixos valores de pressão e de equivalentes de directividade maior detecção de 14, o que pode proporcionar uma imagem mais homogénea da retina com melhor SNR em PAOM. Comparando com SD-OCT, PAOM tem resolução lateral similar (~ 20 mm) mas muito pior resolução axial (~ 23 mm) em função do momento de ultra-sons de banda limitada 6. A resolução axial da PAOM podem ser potencialmente melhoradas através da utilização do detector ultra-sónico novel também. O método de calibração de resoluções PAOM foi relatado anterior 6,15.
Em resumo, o integrado PAOM e SD-OCT sistema de imagem anatómica oferece mais abrangente e avaliação funcional da retina e, consequentemente, mantém em grandes promessaso diagnóstico clínico futuro e gerências de desordens oculares.
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Disclosures
Todos os procedimentos com animais experimentais foram aprovados pelo Animal Care Institucional e Comitê de Uso da Northwestern University.
Acknowledgments
Agradecemos o apoio generoso da National Science Foundation (CARREIRA CBET-1055379) e os Institutos Nacionais de Saúde (1RC4EY021357, 1R01EY019951). Agradecemos também o apoio da China Scholarship Council para Song Wei.
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