Summary
像自由游动的线虫的微生物
Abstract
土壤和水生微生物的生活和行为在一个复杂的三维环境。相反，大多数微小的有机体行为的研究，已用显微镜为基础的方法，极限的运动和行为，近一个狭窄的二维重点领域。我们提出了一种新的分析方法，提供实时分析自由游泳C.而不依赖于显微镜为基础的设备中的一个反应杯中线虫 。这种方法包括跟踪引导激光通过比色皿的光所产生的时间的周期性的X射线衍射图案。我们测量振荡频率为自由游动的线虫。
远场衍射图案的分析揭示了有关波形的线虫的线索。衍射是弯曲物体周围的光的过程。在这种情况下的光被衍射的生物体。光波的干涉，并可以形成广告也是衍射极限的格局。一种远场，或夫琅和费衍射图案形成，如果屏幕到对象的距离为远远大于衍射对象。在这种情况下，衍射图案可以计算（模拟）使用傅里叶变换。
是自由生活的线虫生活在土壤中的线虫，在三维空间导航。他们移动的正弦运动器官的模式称为爬行，在不同的模式称为游泳液体在固体基质，如土壤或琼脂。3扮演的角色的感官信息提供mechanosensory，化学感受，thermosensory的细胞，支配塑料运动器官的变化模式和开关模式才刚刚开始被阐明。我们描述一个光学测量线虫运动在三个方面，不需要显微镜，让我们开始探索线虫运动的复杂性，根据不同的合作方式条件。
Protocol
1。C.线虫的准备工作视频分析
- 将10-20妊娠的成年线虫新鲜的NGM琼脂填充的Petri板使用薄，扁平铂金线挑。充满的NGM琼脂的培养皿中包含一个小的圆形光斑，E.大肠杆菌 （增长有限应变，OP50，给出了最好的结果）的线虫吃。允许的线虫产卵3-5小时，然后取出大人，从而建立了一个小的，同步发展的文化50-150线虫。允许线虫增长到成年早期的Petri板在20℃下孵育4-5天。这些培养方法是基于既定的程序（Stiernagle 2006）5
- 在当天的视频分析，年轻的成年线虫1毫升去离子水，蒸馏水冲洗板，收集50-150蠕虫，从同步的文化。类似M9或PBS缓冲溶液也可以被使用。使用的离心旋转的w奥姆斯管的底部，或允许他们重力沉降约15分钟。从管中移除大部分的水，并替换它与1毫升去离子水，蒸馏水，为了洗掉从线虫任何粘附的细菌。
- 将在水或缓冲液的石英比色皿，用微量的线虫。重要的是要与一个小数目，甚至更少的在同一时间或约5-10线虫数量，以便在一个时间的一个线虫是可能要由激光照射。如果在上的培养板的线虫的数目太大，稀释在水或缓冲液中的蠕虫，直到达到所希望的密度。另外，也可以挑选个别线虫一滴上新鲜的琼脂平板上的水或缓冲液洗并转移到比色皿的个别蠕虫。在我们的研究中，我们使用1毫米，2毫米和5毫米比色皿尺寸检查的物理限制的游泳行为的影响。
2。光学视频Analysi设置小号
- 使用543 nm（绿色）氦氖（氦氖）激光，两个前表面铝镜，一个小杯保持器，一投影屏幕上，和一个高速的摄像头（卡西欧高速卡西欧），能够执行安装，如在图1中示出〜240 fps的拍摄。两个反光镜被用于引导的激光束，通过比色皿中。可以使用不同尺寸的比色皿，根据性质的研究。作为一个例子，我们使用的比色皿的5毫米厚的游泳频率显示的空间约束的影响。的激光束必须满足要求的过采样， 即 ，生物体应阻碍的激光束的不超过三分之一。对于C。线虫 ，激光束应该是大约2毫米的直径，当它与线虫交互。的激光束应不大于5毫米的直径，因为衍射图案将难以定位。在屏幕上的衍射机体的距离要大得多机体本身。
- 将石蜡膜的比色皿的顶部上，并倒转混合线虫到水柱。放置，使比色皿中的比色皿支架的蠕虫是最初的比色皿的顶部附近。使用反射镜时，引导的激光束，通过该中心的比色皿中。由于线虫的密度比水的，它们会慢慢下降的比色皿的底部，而在相同的时间内的水柱游泳。
- 在投影屏幕上，彩色的点，对应于所发送的激光束黑，以减少散射作为发送波束满足投影屏幕上（ 图2）。或者把在投影屏幕上的开口，以允许的发射光束通过屏幕。消除或减少的发射光束的散射，将保持饱和由于发送波束的相机的CCD阵列。
- 要捕获的衍射图案的大小的度量，画一条线约5厘米，在投影屏幕上不干扰的衍射光图像的情况下所发送的激光束光斑的旁边。
- 开始用相机记录房间的灯是5厘米的线段是在同一个镜头的衍射图像。打开房间的灯关闭。记录衍射图像在屏幕上的摄像头，如蠕虫通过激光束。
3。视频数据准备
- 在电脑上安装视频分析程序（记录仪专业版： http://www.vernier.com/products/software/lp/ ）。将视频导入到视频分析程序
- 设置原点，以配合所发射的激光光斑。设置使用在5厘米线的规模，在投影屏幕上。
- 追踪每个使用的视频分析软件的线虫所形成的衍射图像（ 图3）的角位移
- 要找到安古拉ŕ位移的反正切（Y / X），复制和粘贴数据到电子表格（Excel）和180°或π的所有负面的角度来产生连续的曲线（Figure. 4）。
4。即时观察游泳运动频率的实时数据采集
- 使用相同的设置为视频分析，放置一个光电二极管（DET10A来自Thorlabs公司）与偏离中心的小区域（〜1毫米2）中的衍射图案，在投影屏幕的右前方。
- 数字示波器（由笔克科技的PicoScope）连接到电脑通过USB端口连接的光电二极管。注意在计算机屏幕上的颠簸模式。
- 在ASCII文本格式保存采集到的数据集。
5。数据分析
- 导入采集的数据使用视频或光电二极管的拟合波形数据分析程序，能够用卡方最小化。这里使用的程序是地（ http://www.originlab.com/ ），。合身的正弦曲线，以确定抖动频率（ 图4和图5）。
- 平均频率从各种样品的游泳池，并确定变异。在这项研究中，数据进行统计学分析使用单因素方差分析，接着用Bonferroni多重比较测试。 p值<0.05为差异有统计学意义。
6。使用数学模型衍射图样为例
注：可以使用许多不同的计算工具来模拟衍射图案。此过程会有所不同不同的计算工具，如MATLAB，Excel中，原产地等。
- 创建映像：显微镜载片上，使用传统的显微镜拍摄的线虫。
- 二值化图像导入蠕虫图像的蠕虫“我置身于数学的图像拖动到Mathematica。将图像转换成黑白图像（二值化）。这样就可以实现“二值化”命令，在Mathematica：BlackandWhiteImage二值化蠕虫。然后，该图像可以被视为一个黑色和白色图像。
另外，使用“EdgeDetect”命令来创建一个BlackandWhiteImage：EdgeDetect蠕虫，6.0,0.035]，其中两个尾随的数字，控制粗糙的边缘。 - 转换图像转换成0和1的矩阵：这样就可以实现在Mathematica“的ImageData”命令：矩阵的ImageData [BlackandWhiteImage]。
- 傅立叶变换矩阵：在Mathematica中使用'傅立叶命令进行傅立叶变换的矩阵使用指定的FourierParameters：FTransform傅立叶矩阵，FourierParameters - > {0，-2}]。
- 广场的绝对模平方矩阵得到的的衍射矩阵和改善图像的对比度：值矩阵，并查看所得到的图像，这是对应于原始图像的衍射图案。此外，使用“日志”功能来缩放图像的对比度：ImageContrast图片[登录[1 +（ABS [FTransform]）^ 2] / 0.5]。
- 调整图像大小，方便查看：作物中央衍射图案调整为所需的ImageResize ImageContrast [Y]，100，500]。
- 比较建模的衍射图案与衍射图案获得自由游动的蠕虫。 （图6）
Representative Results
作为一个例子，我们研究了C.线虫在石英比色皿1厘米宽，5毫米厚，4厘米高的比色皿。采样一个单一的蠕虫使用视频分析，从视频分析获得的平均游泳频率在5毫米厚的比色皿是大约2.5赫兹的（ 图4）。同样，采样蠕虫病毒利用一个单一的实时数据采集方法，我们得到一个游泳池，频率约为2.7赫兹（ 图5），使用数字示波器（PicoScope软件），这个过程可以重复许多蠕虫。自由游泳的蠕虫的详细研究表明平均游泳频率2.37赫兹5毫米比色皿中。6正如预期的那样，在游泳池频率是高于爬行蠕虫（〜0.8赫兹）。3使用该衍射方法，平均游泳的频率是 C。 线虫 ，这仅限于显微镜载玻片上，已经发现，2 Hz的频率相匹配的原样的值。1,7
ve_content“>以下程序3），然后6）允许建模游泳衍射图案，与用常规的显微镜获得的图像的蠕虫的帮助。建模的衍射图案是用来模拟的线虫游泳周期（实际可行的连续游泳游泳的频率相匹配的模式，由图6）。一个成功的典范。该蠕虫病毒应该是在游泳周期结束时相同的形状，因为它是在游泳周期的开始。
图1。一个绿色的氦氖激光被用来创建一个的动态衍射图案采用现场C.线虫 。衍射图谱在240 fps的拍摄。
图2绘制直线翼一个黑点增加的发射光束的吸收。相机由于散射光的饱和性被降低，变得可见的衍射图案。
图3。屏幕截图的视频分析软件（记录仪专业版）的蠕虫被跟踪的衍射图案。 点击此处查看大图 。
图4的视频数据对应于5毫米比色皿中的线虫游泳周期。曲线拟合揭示了游泳〜2.5 Hz的频率。
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图5。实时数据对应于5毫米比色皿中的线虫游泳周期。曲线拟合揭示了游泳〜2.7 Hz的频率。
图6的最上面一行表示实际的衍射图案和相匹配的建模的底部行中的衍射图案。使用显微镜载片上（中间行）的蠕虫生产建模的衍射图案。
Discussion
我们已经开发出一种新颖的方法来运动的实时测量和简单的运动器官的行为在微观有机体如线虫，不需要使用显微镜。8这种方法的方法也可以用于研究许多微生物，如原生生物。此方法只限于所使用的光的波长。的生物体不应该是小于光的波长。除了所需要的设备的成本节省和便携性，这种方法的一个主要优点是在实时和在三个维度的行为的能力来衡量，在显微镜下的图像平面没有狭窄的限制。它也可以使用这种技术，研究重力或许多其他条件的行为，可以不使用显微镜为基础的方法进行研究的影响。因此，我们可以更好地了解微生物的自然运动器官BEHAviors从显微镜载玻片上滴或专门的微流体室（Park 等 ，2008年）的限制中解脱出来。
的衍射图案中的相位信息的缺乏不允许衍射自远场衍射图案的傅立叶变换的绝对值的平方成正比的对象相对应的图像的直接检索。因此，我们现蠕虫图像计算衍射图案，使他们能够自由游泳线虫（ 图6）与衍射图案的匹配。
这种方法已经取得了阶段性成果，为真正的自由游泳C.线虫，并可以应用到任何微观物种回旋像水或许多不同的离子溶液中的光学透明的环境。只允许常规显微镜研究微米的顺序上与焦点深度11，这是由于有限的景深时的光线聚焦：
这里的F-数N有互惠关系的混乱（三）与圆 ，短焦距与大C。12,13衍射法虽然这肯定不是一个替代传统的显微镜，它能够很快，所以甚至可以被操纵，物种实时低成本提供定量结果。的衍射图案，可以得到与任何激光指针。可以以较低的时间分辨率，使用普通的数码相机拍摄的衍射图案。虽然用户可能没有随时可用显微镜或光电二极管，在此实验中，如测量抖动的频率和评价衍射图案的关键部位，可以以非常低的成本完成。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢Tzlil Rozenblat，亚历山德拉·贝洛和卡尔·Spuhler的技术援助。这项工作是由瓦瑟学院本科生科研暑期学院（URSI），露西·梅纳德·鲑鱼研究基金和美国航空航天局奖＃NX09AU90A，国家科学基金会（National Science Foundation）卓越研究中心科学与技术奖（NSF-CREST）＃0630388和美国国家科学基金会奖＃1058385。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 543 nm HeNe Laser | Melles Griot | LGX1 | Any laser in the visible range with less than 5 mW can be used. |
| 2 Front Surface Aluminum Mirrors | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
| High Speed Exilim Camera | Casio | ||
| Quartz Cuvette | Starna Cells | 21/G/5 | |
| LoggerPro (Software) | Vernier | http://www.vernier.com/products/software/lp/ | |
| Mathematica 8 | Wolfram | http://www.wolfram.com/ |
References
- Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans. J. Exp. Biol. 210, (2007).
- James, J. F. A student's guide to Fourier transforms with applications in physics and engineering. , Cambridge Univ. Press. (1995).
- Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 20982-20987 (2008).
- Li, W., Feng, Z., Sternbert, P. W., Xu, X. Z. S. A C. elegans stretch receptor neuron revealed by a mechanosensitive TRP channel homologue. Nature. 440, 684-687 (2006).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. ed, W. ormB. ook, , (2006).
- Dynamic Diffraction Analysis and the Transformation of C. elegans. Eells, R., Lueckheide, M., Magnes, J., Susman, K., Rozenblat, T., Kakhurel, R. Symposium for Undergraduate Research, Division of Laser Science (APS) - LS XXVII, San Jose, CA, , (2011).
- Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. Analysis of Freely Swimming C. elegans using Laser Diffraction. O. J. Biphys. , (2012).
- Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Sampson, A., Eells, R. Locomotive Analysis of C. Elegans through Diffraction, Control number: 348 Session: JTuA - Joint FiO/LS Poster Session I Pres. number: JTuA39. FiOs/LS, October 26, Rochester, NY, , (2010).
- Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. J., Zoval, J., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. Gravity fource transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/EnaC channel modulates DAF-16/FoxO activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 177, 835-845 (2007).
- Park, S., Hwang, H., Nam, S. -W., Martinez, F., Austin, R. H., Ryu, W. S. Enhanced Caenorhabditis elegans locomotion in a structured microfluidic environment. PLOS One. 3, e2550 (2008).
- Keller, H. E. Objective Lenses for Confocal Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , 3rd edition, Springer. 145-161 (2006).
- Conrad, J. Depth of Field in Depth. , Large Format Page. Available from: http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf (2011).
- Martin, L. C. TECHNICAL OPTICS. II, Pitman Publishing Corporation. (1950).
