Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hel Mount RNA Lysrör Published: January 30, 2013 doi: 10.3791/50057
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1,2, 1,2, 1, 1, 1,2
1Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM), 2Department of Biochemistry, Université de Montréal
* These authors contributed equally

Summary

Här beskriver vi en hel-mount lysrör

Abstract

Bedöma uttrycksmönstret av en gen, liksom subcellulära egenskaper lokalisering av dess transkriberade RNA är viktiga egenskaper för att förstå dess biologiska funktion under utveckling. RNA in situ hybridisering (RNA-ish) är en kraftfull metod som används för att visualisera RNA fördelning egenskaper, oavsett om det vid organismbiologi, cellulära eller subcellulära nivå 1. RNA-ISH är baserad på hybridiseringen av en märkt nukleinsyrasond (t ex antisens-RNA, oligonukleotider) komplementär till sekvensen av ett mRNA eller ett icke-kodande RNA-mål av intresse 2. Eftersom förfarandet kräver primära sekvensinformation enbart för att generera sekvensspecifika prober, kan den allmänt tillämpas på en brett spektrum av organismer och vävnadsprov 3. I själva verket har ett antal storskaliga ISH studier genomförts för att dokumentera genuttryck och RNA lokalisering dynamiken i olika modellorganismer, vilket har lett tilletablering av viktiga samhällets resurser 4-11. Medan en mängd sond märkning och strategier upptäckt har utvecklats under åren, den kombinerade användningen av fluorescensmärkta detektionsreagens och enzymatiska signal steg förstärkning erbjuder betydande förbättringar i känslighet och upplösning av förfarandet 12. Här beskriver vi en optimerad fluorescent in situ hybridisering metod (FISH) använder tyramid signalförstärkning (TSA) för att visualisera RNA-uttryck och dynamik lokalisering i iscensatta Drosophila embryon. Förfarandet utförs i 96-brunnars PCR-platta format, vilket avsevärt underlättar samtidig bearbetning av ett stort antal prover.

Protocol

1. RNA-sond Framställning

Översikt: Följande avsnitt beskriver de steg som krävs för att göra digoxigenin (dig)-märkta RNA-sonder som lämpar sig för FISH. Det första steget involverar kloning eller PCR amplifiering av en sekvens som motsvarar den transkriberade regionen av en gen av intresse som kommer att användas för att generera en sekvens-specifik sond. Detta kan uppnås genom att först klona gensegmentet i en plasmid i vilken det multipla kloningsstället flankeras av element bakteriofag promotor (T7, T3 eller SP6), som sedan kan tjäna som en mall för PCR med användning av flankerande primrar som inkorporerar de promotorsekvenser , således genererande en linjär PCR-produkt med olika promotorsekvenser vid varje ände (Figur 1A). Alternativt, för att undvika kloning steget, kan man utföra även PCR-amplifiering från genomiskt DNA eller cDNA med användning av oligonukleotider som inkluderar T7, T3 eller SP6 sekvenser vid sina 5 'ändar (t.ex. T7:5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 ', T3: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; Sp6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 '). De linjära PCR-produkterna används sedan som mallar för att göra Dig-märkt sense-eller antisense-RNA-prober genom avrinning transkription in vitro med den lämpliga polymeraset (Figur 1B). När du gör sönder för specifika gener, rekommenderar vi att förbereda både förnuft och antisens RNA-sonder med olika polymeraser, som kommer att vara till hjälp för att bedöma specificitet FISH signal (dvs. om genen av intresse transkriberas i antisensorienteringen kommer sens-RNA sond avslöja nivå av bakgrundssignal). I alla följande steg bör man noga för att undvika eventuella nedbrytning genom kontaminerande ribonukleaser (RNAs) genom att först rengöra alla bänk och utrustning med 70% etanol eller kommersiella RNAse-lösningar sanering och genom att använda RNas-fri leveranser (t.ex. vatten, tips, mikrocentrifugrör).

Material

  • 1,5 ml mikrocentrifugrör, (ABgene, Rochester, NY, USA Kat. Nr 0900)
  • Gel-extraktion kit (Qiagen, Mississauga, ON, Kanada,. Kat.nr. 28.706).
  • RNas fritt vatten (Visent, Inc. Cat. Nr 809-115-CL)
  • RNA-polymeraser (T7, T3 eller SP6). (20 U / l, Fermentas Biosciences. Cat. Nr EP0101, EP0111, EP0131).
  • RNAse-OUT ribonukleas-hämmare (40 U / ul), (Invitrogen, Burlington. Canada.Cat. Nr 10.777-019).
  • Digoxigenin (DIG) nukleotid mixar (dig-11-UTP Roche Applied Biosciences, Laval, QC, Kanada. Cat. No.11209256910).

Utrustning

  • Bordsskiva mikro-centrifug
  • Gel-elektroforesapparat
  1. PCR-amplifiera gen-specifika sekvensen från genomiskt DNA, cDNA, eller plasmid-DNA för att generera en linjär PCR-produkt flankerad av bakteriofag T7, T3 eller Sp6-promotorsekvenser. Följ tillverkarens rekommendationer för PCR förhållanden.
  2. Kontrollera kvaliteten och size av PCR-produkten genom agarosgelelektrofores. Punktskatter och renar PCR-produkt med användning av en vanlig gel-extraktion-kit enligt tillverkarens rekommendationer och eluera produkten i 50 pl buffert.
  3. Fälla ut PCR-produkten genom att tillsätta 5 pl 3M natriumacetat (pH 5,2) och 150 pl iskall 100% etanol, och placera rören vid -70 ° C över natten. Centrifugera rören vid 13.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C och tvätta pelleten med 70% etanol. Snurra igen, ta bort alla spår av etanol och lufttorka pelleten. Återsuspendera i 25-50 ul RNAs-fritt vatten.
  4. Transkribera Gräv-märkt prob med användning av 200-500 ng renad PCR-produkt i en 20 pl reaktion enligt följande: 2 yl 10X T7-transkription buffert (Invitrogen), 1 pl (20 U / | il) av RNAs-inhibitor, 2 pl Dig-NTP-blandning , och 2 pl T7 RNA-polymeras (20 U / ^ il). Bringa den slutliga volymen till 20 pl med RNAs-fritt vatten. Inkubera transkriptionsreaktionen vid 37 ° C under 3-4 timmar.
  5. Justera transcription blandning till 50 ul med RNas-fritt vatten och fälla ut Dig-märkt RNA-sond som beskrivs i steg 4. Resuspendera den tvättade RNA-pelleten i 100 | il RNAs-fritt vatten. Förvara de återsuspenderade proverna vid -70 ° C.
  6. Kvantifiera proben med användning av en spektrofotometer NanoDrop. För att verifiera sonden kvalitet, köra en 1-2 pl prov på en 1-2% agarosgel färgad med etidiumbromid.

2. Insamling och Fixering av Drosophila embryon

Översikt: Detta avsnitt beskriver steg för skörd och förädling iscensatt Drosophila embryo. Beroende på antalet nödvändiga embryon, kan flugor hållas i befolkningen burar av olika storlekar. Följande steg är för samlingar utföras med 900 cm 3 cylindriska burar med 100mm äpple plattor juice samling. Korrekt fixering kräver avlägsnande av två skyddande skikt som omger embryot: den yttre korion och den inre vitelline membranet 13. När skördas, embryona först badade i en 50% blekmedel lösning för att ta bort chorion, då de blandas i en bifasisk innehållande heptan (permeabilizes vitellinmembranet) och PBS innehållande 3,7% formaldehyd. Vitellinmembranet därefter knäckt och avlägsnas genom att överföra embryon till en bifasisk blandning av heptan och metanol. Korrekt embryo fixering och avlägsnande av vitellinmembranet är avgörande för framgång nedströms FISH proceduren.

Material

  • Apple-juice agarplattor (40% äppeljuice, 4% sackaros, 3,5% agar, 0,3% metylparaben) med dime-stora jäst pasta (bagerijäst blandas med vatten till smör konsistens)
  • Pulveriserat paraformaldehyd (elektronmikroskopi Sciences, Hatfield, PA, USA,. Cat No 19.208)
  • Heptan
  • Metanol
  • 3% Blekmedelslösning
  • 20 ml glas scintillationsfläskor (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Kanada,. Cat No 03-337-15).

Utrustning

  • Befolkning burar
  • Collection korgar (med användning av ett Nitex mesh och den övre delen av ett snitt 50 ml polypropylenrör i vilken ett hål har skurits i locket).
  • Liten pensel
  • Bordsskiva virvel
  1. Pre-klara välnärda befolkning burar med en färsk äppeljuice / jäst platta under 1 h vid 25 ° C.
  2. Lägg till en ny äppeljuice / jäst platta till buren för att skörda tidigt stadium embryon. Inkubera buren under 4 h vid 25 ° C (notera att insamling gånger kan justeras beroende på de önskade stegen).
  3. Bered en färsk 37% formaldehyd-lösning genom att kombinera 3,7 g paraformaldehyd pulver, 70 pl av 2N KOH och 7,3 ml MilliQ-vatten i en glasscintillationsflaska under en kemisk huv. Koka lösningen tills paraformaldehyd pulvret är helt upplöst, kyl sedan till rumstemperatur och filtrera till nya scintillationsampull.
  4. Bered en bifasisk fixeringslösning genomkombinera 2,25 ml 1X PBS med 250 ml 37% formaldehyd i en scintillationsflaska, därefter tillsätta 7,5 ml heptan.
  5. Skörda äppeljuice plattan från buren och samla embryon genom att lägga en bit av rumstemperatur kranvatten och försiktigt borsta embryon från plattan med pensel. Överför de resuspenderade embryon i en korg och skölj med ljummet kranvatten.
  6. Dechorionate embryon för 90 sekunder genom att bada insamling korgar i blekmedel och skölj noga med ljummet kranvatten (tills blekmedel lukt är borta).
  7. Demontera insamling korgen, samla embryon försiktigt med en pensel och överföra dem till den bifasiska fixering lösningen. Embryona ansamlas vid gränsytan mellan PBS och heptan skikt.
  8. Seal scintillationsfläskor och fäst till en vortexblandare. Skaka i 20 min på lägsta inställningen.
  9. Avlägsna och kassera de flesta av de lägre PBS och övre heptan faser med användning av en Pasteur-pipett. Aspireraresterande PBS / heptan / embryon blandningen i pipetten. I droppvis, kassera den undre PBS fasen från pipetten, se till att inte eliminera embryon. Deponera embryona till ett 1,5 ml rör innehållande en tvåfasig lösning av 500 pl heptan (övre fas) och 500 pl metanol (undre fasen).
  10. Skaka rören kraftigt för hand för 30-45 sekunder att knäcka de vitelline membranen. När knäckt kommer embryona sjunka in i metanol.
  11. Kasta den övre heptan fasen och osprucken embryon vid heptan / metanol interfas och tillsätt 500 pl metanol. Skaka i 5 sek.
  12. Tvätta 3 gånger med metanol och lagra embryon vid -20 ° C (vid denna punkt embryon kan lagras under veckor / månader).

3. Post-fixering Processing, hybridisering och efter hybridisering Tvättar

Översikt: Detta avsnitt beskriver bearbetningsstegen för embryo permeabilisering före FISK, före hybridisering,hybridisering med RNA-prober och efter hybridisering tvättar. För de inledande stegen permeabilisering embryona hanteras som en pool i ett enda rör (steg 1-9 nedan, siktar för 10-15 pl av avvecklade embryon / prov), men de är alikvoterades i individuella brunnar i en 96-brunnars PCR-platta innan du fortsätter med för-hybridisering (steg 10 nedan). Detta bidrar till att säkerställa en jämn behandling av alla embryon i de inledande faserna av experimentet. När du ställer in en FISK experiment är det viktigt att inkludera negativa kontroller för att fastställa graden av bakgrundssignalen i enskilda experiment. För detta rekommenderar vi även en "no-sondens prov och, som nämnts i avsnitt 1, ett prov hybridiserad med" mening "RNA-sond, som normalt ger en signal som är jämförbar med den" icke-sondens kondition.

Material:

  • Metanol
  • Fosfatbuffrad saltlösning med 0,1% Tween-20 (PBT)
  • Proteinas-K 1 mg / ml stamlösning (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Kanada. Katalog nr P2308)
  • Glycin (20 mg / ml stamlösning)
  • Hybridiseringslösning: 50% formamid, 5X SSC, 0,1% Tween-20, 100 g / ml klippt laxsperma-DNA, 100 pg / ml heparin.
  • 0,2 ml halfskirted 96-håls PCR-plattor, ABgene, Rochester, NY, USA Cat. Nej 0900)

Utrustning

  • Hybridisering ugn, digitala värmeblock eller vattenbad inställt på 56 ° C, 80 ° C eller 100 ° C, eller en PCR-maskin.
  • Multichannel pipetter (rekommenderas för att förenkla tvättsteg)
  • Nuterande blandare
  1. Skölj embryon i metanol, sedan i en 1:1 blandning av metanol: PBT, och sedan två gånger i PBT.
  2. Fäst embryon för 20 minuter i 1 ml PBT innehållande 3,7% formaldehyd (nyberedd enligt beskrivningen i steg 11) med konstant gungande på en nutator.
  3. Tvätta embryon för 3 gånger under 2 min i PBT under gungande.
  4. Bered en lösning av 3 pg / ml av proteinas K (PK) utspädd i PBT och lägg500 pl av lösning till prover. Inkubera proverna i 10 min vid rumstemperatur utan skakning. Blanda embryon var 2 min genom att spruta med en pipett eller genom att försiktigt vända rören.
  5. Överför embryon prover på is under 1 timme.
  6. Flytta prover till rumstemperatur och avlägsna PK lösning. Tvätta 2 gånger under 2 min med 1 ml av PBT + 2 mg / ml glycin.
  7. Fix prover 20 min i 1 ml av PBT + 3,7% formaldehyd med skakning. Skölj embryon 5 gånger i PBT.
  8. Skölj embryon med 1 ml av en 1:1 blandning av PBT och Hyb-lösning. Ersätt med 0,5-1 ml 100% Hyb-lösning (vid detta steg embryona kan lagras under flera dagar / veckor vid -20 ° C).
  9. Alikvoter embryon i enskilda brunnar i en 96-brunnsplatta (mål för ~ 10-15 ul avvecklade embryon / brunn, vara noga med att använda stor bländare tips för att undvika att skada embryon).
  10. Koka 100 pl / prov av Hyb lösning under 5 min och kyl sedan på is under 5 minuter. Denna lösning används för prov före hybridisering (Pre-Hyb).
  11. Tillsätt 100 | il / prov av Pre-Hyb lösning och inkubera under åtminstone 2 timmar vid 56 ° C.
  12. För varje prov, späd ~ 100 ng sond i 100 ul Hyb-lösning. Värm vid 80 ° C under 3 minuter, kyl sedan på is under 5 minuter (uppvärmda sönder kan hållas på is under flera timmar).
  13. Ta bort den före Hyb lösning från embryon och ersätta med RNA sond lösningen.
  14. Hybridisera vid 56 ° C under 12-16 timmar.
  15. Pre-varma följande tvättlösningar vid 56 ° C: (A) 200 pl / prov av Hyb-lösning, (B) 100 pl / prov av en 3:1 blandning av Hyb: PBT, (C) 100 | il / prov av en 1:1 blandning av Hyb: PBT, (D) 100 ul / prov av en 1:3 blandning av Hyb: PBT, (E) 400 | il / prov av PBT.
  16. Skölj prover med 100 pl tvättlösning A, sedan utföra tvättsteget med 100 pl / prov av lösningar AD vid 56 ° C under 15 min vardera. Därefter, tvätta prover 4 gånger under 5 min med 100 pl / prov av lösning E vid 56 ° C.
  17. Cool prover till rumstemperatur.

Översikt: Detta avsnitt beskriver de antikroppar och reagens upptäckt används för att detektera och visualisera fördelningen av RNA sond signalen efter hybridisering. Dessa steg beskrivs schematiskt i fig 2. Här presenterar vi endast de vanliga detektionsreagens som vi använder för robust signalförstärkning, men det finns en mängd kommersiellt tillgängliga reagens som kan användas som alternativ, speciellt när de utför dubbla FISK experiment att samarbeta upptäcka olika RNA samtidigt för protein-RNA dubbel färgning. Exempel på resultat som erhållits med detta protokoll visas i mRNA-expression / lokalisering mönster mosaik i figur 3.

Material

  • HRP-konjugerat mus-monoklonal anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. Cat. Nr 200-032-156)
  • Biotin-konjugerad mus-monoklonal anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. Cat. Nej 200-062-156)
  • Streptavidin-HRP-konjugat (Molecular Probes, Eugene OR, USA, Cat. No.S991)
  • Cy3-tyramid konjugat (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA, kat. Nr SAT704A)
  • DABCO montering lösning: I en 50 ml rör, späd 1,25 g DABCO (1,4-diazabicyklo [2.2.2] oktan, Sigma D-2522) i 15 ml 1X PBS, tillsätt sedan 35 ml glycerol och blanda tills helt homogen. Genom förblandning med PBS är DABCO pulvret löst mycket snabbt. Lagra montering lösning vid -20 ° C.
  • Glasskivor, täckglas

Utrustning

  • Nuterande blandare
  • Multikanalspipett
  • Fluorescensmikroskop
  1. Bered PBTB lösning, innehållande PBT + 1% fettfri torrmjölk (vanligen 50-100 ml är tillräckligt för alla detektionsreagenset inkubation och tvättsteg).
  2. Blockera prov under 10 minuter vid rumstemperatur i 100 pl PBTB / provet medan gungande på nutator.
    3. <li> Ta bort blockering lösning från embryon och inkubera prover för 1,5-2 timmar vid rumstemperatur med 100 pl / prov den monoklonala biotin anti-DIG-antikropp lösning (utspädd 1/400 från lager till PBTB) med skakning.
  3. Tvätta prover 6 gånger under 5 minuter vardera med 100 pl PBTB / prov med gungande.
  4. Inkubera 1,5 h vid rumstemperatur med 75 ml / prov av streptavidin-HRP-lösning (utspädd 1/100 från lager i PBTB, 10 pg / ml slutlig koncentration) med skakning.
  5. Tvätta prov 6 gånger under 5 min vardera 100 pl PBTB / prov med gungande (för DNA motfärgning, utspädd DAPI till 1X arbetskoncentration i PBTB och använda denna lösning i det första tvättsteget).
  6. Skölj embryon med PBT, tvätta sedan 2 gånger under 5 min med PBS.
  7. Inkubera proverna under 2 timmar vid rumstemperatur på nutator med 50 pl / prov av Cy3-tyramid lösning (utspädd 1/50 i tyramid amplifieringsbuffert). Från detta steg på, se till att hålla prover i en avskärmad lätt behållare. </ Li>
  8. Tvätta prover 6 gånger under 5 minuter vardera med 100 pl PBS / prov på nutator.
  9. Avlägsna PBS och tillsätt 100-125 pl / prov av montering lösning innehållande 70% glycerol och 2,5% (DABCO). Förvara proverna vid 4 ° C. Dessa prover kan lagras under flera år.
  10. Med hjälp av ett brett hål spets, återsuspendera embryona genom att försiktigt pipettera proverna och överför 25 | il embryon på en glasskiva, sedan placera ett täckglas över embryon och tätningen på bilden med nagellack.
  11. Analysera embryo prover med användning av ett fluorescensmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

När genomförts framgångsrikt, erbjuder detta förfarande en påfallande ökad detaljnivå i tid och rum analys av genuttryck och mRNA dynamik lokalisering under början Drosophila embryogenes. Faktiskt, såsom visas i fig 3A för den klassiska par-regeln genen Runt (kör), kan man använda detta protokoll att observera händelser genuttryck genom detektion av begynnande transkript foci i grupper om uttrycka kärnor. Dessutom, såsom visas i embryot mosaik i fig. 3B, möjliggör metoden visualisering av funktioner mRNA lokalisering i hög upplösning.

Figur 1
Figur 1. Disposition av RNA sond förberedelse förfarande. (A) Schematisk representation av vår strategi för att syntetisera Dig-märkta RNA-sonder genom in vitro transkription usinga linjär DNA-mall flankerad med bakteriofag RNA element polymeraspromotor. (B) Bild av standard 1% agarosgel visar exempel på in vitro transkriberade RNA-prober för histon H2A, kör och doc transposoninfogningar RNA. Vi har vanligtvis en sida-vid-sida elektrofores av både PCR-mallen och RNA-prob. RNA visas vanligtvis som ett intensivt diskret band med högre mobilitet än mallen

Figur 2
Figur 2. Schematisk representation av stegen proben detektering i FISH metoden. Efter probhybridisering bearbetade embryon, är Dig-märkta sönder redovisas användning av en biotinylerad α-Dig-antikropp, som sedan komplexbinds till HRP-konjugerat streptavidin. Tyramid signalförstärkning (TSA) utförs sedan resulterar i omvandlingen av den tyramid reagens till fri radikal form through aktiviteten av HRP. Övergående reaktiva tyramid fria radikaler binder kovalent till aromatiska rester av närliggande proteiner, förhindrar deras diffusion från sonden plats. Den tyramid substrat är komplexbunden till fluorescerande färgämnen, som kan detekteras med fluorescensmikroskopi.

Figur 3
Figur 3. Exempel på resultat som erhållits med denna fisk procedur belyser mångfalden av mRNA uttryck och subcellulära mönster lokalisering i Drosophila embryon. (A) FISH analys av par-regeln gen köra på olika stadier av embryogenes avslöjar hur den initiala breda uttryck i mittpartiet av embryot i fosterstadiet 4 förädlas till en segmenterad randmönster i senare skeden. (B) Mosaik skildring av fisk resultat visar olika sorter av mRNA localization mönster i steg 4-7 embryon. FISH utfördes med användning av DIG-märkta antisense-prober som har hybridiserat och detekterades genom sekventiella inkubationer med den biotinylerade anti-Dig-antikropp, streptavidin-HRP och Cy3 tyramid. RNA = blå, DNA = röd. Skala bar i (A) = 25 | iM, medan den i (B) = 50 | iM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

För steg probe syntes skapar vi vanligtvis run-off antisens RNA-sonder genom in vitro transkription från hellånga Drosophila cDNA förstärkta från plasmider finns i Drosophila gensamlingen (DGC), en resurs som beskrivs på följande webbplats: http://www .fruitfly.org / DGC / index.html 14,15. Detta tillvägagångssätt har använts i stor utsträckning i stora studier skala ISH syftar till att kartlägga genuttryck och mRNA mönster lokalisering i Fly embryon 9,16. DGC plasmider kan beställas från Drosophila Genomisk Resource Center ( https://dgrc.cgb.indiana.edu/vectors/ ). Flexibiliteten i utgångsmaterial och utforma egna primers med T7, SP6 eller T3 överhäng gör att man enkelt generera prober för att detektera specifika mRNA-isoformer (t.ex. alternativt splitsade varianter) or icke-kodande RNA som inte finns representerade i de vanliga cDNA samlingar. När man överväger utforma isoform-specifika prober, har vi funnit att mallar från 250-1,000 baser kan ge utmärkt fisk resultat.

För fisk i flyga embryon vi inte fragment våra sonder genom karbonat behandling, utan vi använder fullängds run-off-transkript, som kan variera i storlek mellan 500-5,000 baser. När du utför FISK på andra vävnader som är mindre genomsläpplig för stora sonder, kan fragmentering gynna verkligen sond penetration. Vi föredrar emellertid möjlighet att förbereda prober använder mindre PCR-förstärkta DNA-mallar, eller samla flera individuellt syntetiserade små sonder tillsammans istället för att genomföra kemisk fragmentering av stora sonder som kan ge olika resultat och minska de totala sond kvalitet.

Som beskrivits i stegen embryosamlingsgrupper lägger vi brukar jäst pasta på plattorna embryosamlingsgrupper. Jäst pasta kommer kraftigtöka antalet ägg som flugorna, som äggproduktion beror på den näringsmässiga miljö 17. Dessutom kommer Drosophila flugor lägger ofta sina ägg direkt i jäst pastan. Dessa embryon kan lätt uppsamlas genom upplösning jästen klistra i vatten med användning av en liten pensel och låta blandningen passera genom en samling korg. För dechorionation steg, en 3% blekmedel, framställd genom utspädning kommersiella blekmedel (typiskt 6% koncentration) 1:1 med vatten, används i de flesta protokoll 13,18,19. Enligt vår erfarenhet har vi funnit att inkubera embryon med en 3% blekmedel lösning för 90 sekunder erbjuder effektiv dechorionation. Dessa parametrar kan behöva justeras beroende på den kommersiella blekmedel lösning som är tillgängliga, men man bör se till att inte överexponera embryona att bleka eftersom detta kan skada proverna. För att övervaka dechorionation proceduren närmare, är det möjligt att titta på embryon under ett mikroskop tO Se till att dechorionation reaktionen är fullständig, dvs embryon förlorar sina dorsala bihang när de dechorionated. Slutligen, för att säkerställa korrekt embryo fixering använder vi nyberedda formaldehydlösningar som gamla lösningar tenderar att falla ut. För ytterligare referens har detta förfarande har beskrivits i tidigare metoder artiklarna 13,18,19.

För steg avseende permeabilisering av embryonala vävnader med proteinas K, eller reagenser upptäckt såsom antikroppar och Cy3-tyramid har vi funnit optimala resultat med spädningar som beskrivs i detta protokoll. På grund av variationer i lab miljöer och lager reagens, rekommenderar vi att varje laboratorium empiriskt testa sina egna reagens för att bestämma den bästa arbetande koncentrationer för deras specifika behov. Dessutom har vi funnit de optimala reagenskoncentrationer kan variera beroende på de analyserade vävnaderna.

För att säkerställa att FISH förfarandet is ger konsekvent reproducerbara resultat, rekommenderar vi alltid att lägga flera positiva kontroller analysen, vilket kan inkludera prober för utskrifter med väldefinierade uttryck / mönster lokalisering (t.ex. kör). Avskrifter med slående mönster mRNA lokalisering under tidig Drosophila embryogenes kan hittas på flugfiska webbplats ( http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca/ ). Omvänt, för att kontrollera bakgrund signaldetektering, såsom nämnts ovan, bör man inkludera även "no-prob" och / eller sense RNA-prov sond.

Förutom den Cy3 tyramid konjugatet som beskrivs i detta protokoll, finns det en mängd andra kommersiellt tillgängliga fluorokromkonjugerade tyramid reagenser från Perkin Elmer Life Sciences eller Molecular Probes (Invitrogen, Kanada, Inc), som kan ge ytterligare flexibilitet för multicolor avbildning experiment . Även om denna metod beskriver vår grundläggande procedure för enstaka RNA-FISH, varianter av denna metod kan implementeras för mer komplexa experiment, såsom dubbel-RNA-FISH eller RNA-protein-sam-detektering. För mer information avseende dessa förfaranden, rekommenderar vi följa de förfaranden som beskrivs i befintliga FISH metoder papper 18-20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Arbetet utförs i LÉCUYER laboratoriet stöds av medel från National Sciences och teknik Council of Canada (NSERC), den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR) och Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ). Fabio Alexis Lefebvre och Gaël Moquin-Beaudry stöds av NSERC grundutbildningen forskning doktorandtjänster, medan Carole Iampietro stöds av Angelo Pizzagalli postdoktorsstipendium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T7, T3 or SP6 RNA Polymerase Fermentas Life Sciences EP0101,EP0111,EP0131 Kits contain reaction buffer.
DIG RNA Labeling Mix Roche Applied Science 11 277 073 910
RNAguard Amersham Biosciences 27-0816-01
3M sodium acetate
Cold 100% ethanol.
Cold 70% ethanol.
Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water.
Heptane
Methanol
proteinase K Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada Catalog No. P2308
40% formaldehyde solution, freshly prepared
PBS-Tween solution (PBT) 1xPBS, 0.1% Tween-20
Glycine solution 2 mg/ ml glycine in PBT
HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc 200-032- 156 (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB
HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG Roche Applied Science, Laval, QC 1 207 733 1/500 dilution of stock solution in PBTB
Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA 200-062-156 (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB
Streptavidin-HRP conjugate Molecular Probes, Eugene OR, USA S991 (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilcox, J. N. Fundamental principles of in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).
  2. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
  3. Lecuyer, E., Tomancak, P. Mapping the gene expression universe. Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).
  4. Tomancak, P., et al. Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).
  5. Thisse, B., et al. Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening. Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).
  6. Quiring, R., et al. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
  7. Pollet, N., et al. An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis. Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).
  8. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
  9. Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
  10. Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312, 1183-1187 (2006).
  11. Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos. Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).
  12. Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O'Farrell, P. H., Davis, I. Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei. Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).
  13. Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo dechorionation. CSH Protoc. , (2007).
  14. Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).
  15. Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287, 2222-2224 (2000).
  16. Tomancak, P., et al. Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 3, (2002).
  17. Terashima, J., Bownes, M. Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 1711-1719 (2004).
  18. Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).
  19. Lecuyer, E. High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila. Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).
  20. Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846 (2004).

Tags

Utvecklingsbiologi Cellulär biologi molekylärbiologi genetik genomik, Embryo Lysrör FISH genuttrycksmönstret RNA Lokalisering RNA tyramid signalförstärkning TSA knockout bananfluga hela berget embryogenes djurmodell
Hel Mount RNA Lysrör<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering av<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Legendre, F., Cody, N., Iampietro,… More

Legendre, F., Cody, N., Iampietro, C., Bergalet, J., Lefebvre, F. A., Moquin-Beaudry, G., Zhang, O., Wang, X., Lécuyer, E. Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (71), e50057, doi:10.3791/50057 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter