Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Визуализация эндоплазматического ретикулума Локализованные мРНК в клетках млекопитающих

Published: December 17, 2012 doi: 10.3791/50066
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry, University of Toronto

Summary

Здесь мы опишем метод визуализации эндоплазматическая сеть связанных мРНК в клетках млекопитающих культуре ткани. Эта методика включает в себя селективный проницаемости плазмы мембраны с дигитонина удалить цитоплазматического содержимого последующим флуоресцентным

Abstract

У эукариот, большинство из РНК, (мРНК), которая кодирует выделяется и мембранные белки локализованы на поверхности эндоплазматической сети (ER). Тем не менее, визуализации этих мРНК может быть сложной задачей. Это особенно верно, когда только часть мРНК ER-ассоциированных и их распределение этой органеллы затруднен нецелевой (т.е. "свободный") стенограмм. В целях контроля ER-связанных мРНК, мы разработали метод, при котором клетки обрабатывают с коротким воздействием решение дигитонина добычи, избирательно permeabilizes плазматической мембраны, и таким образом снимает цитоплазматического содержимого, при одновременном сохранении целостности ER . Когда этот метод в сочетании с флуоресцентной гибридизации (FISH), можно четко визуализировать ER-связанного мРНК методом флуоресцентной микроскопии. С помощью этого протокола степени ER-ассоциации либо объемных поли (А) транскриптов или конкретных мРНК может быть оцененаи даже количественно. В этом процессе можно использовать этот анализ для исследования природы мРНК-ER взаимодействия.

Introduction

У эукариот мРНК, кодирующей выделяется и мембранных белков могут быть направлены на ER совместно трансляционно частицей 1,2 признание сигнала и может быть сохранен на ER через прямое взаимодействие между рибосомами и translocons во время перевода 3,4. Однако, независимо от мРНК могут быть направлены и поддерживается на ER зависит ни от рибосомы или перевода была неясна до самого последнего времени. Предыдущие исследования пытаются решить, есть ли перевод независимой мРНК связи с использованием ER сотовой методы фракционирования. Из-за суровых условиях химического должны были отделиться от рибосомы ER, полученных пузырьков, которые могут нарушить тонкий потенциально мРНК-ER ассоциации, эти исследования не дали результатов, что свидетельствует в течение 5-8 и против 9,10 рибосомных независимых закрепления мРНК ER .

Чтобы обойти эти проблемы мы разработали протоцв, чтобы изолировать и изображения ER-связанного мРНК. Эта процедура включает в себя мягкий лечения добычи, которая эффективно удаляет все цитоплазматического содержимого ячейки (в том числе не связанных ER-мРНК) при одновременном сохранении ER морфологии и все связанные с ней молекулы. С помощью этого протокола мы продемонстрировали, что подмножество мРНК ориентированы, а затем поддерживается на ER независимо от рибосомы или перевод 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка материалов для добычи

  1. Подготовка клетки
    1. Семенной культуре ткани клеток на обработанных кислотой покровные по крайней мере, за один день до эксперимента. Мы используем COS-7 или U2OS, так как эти две клеточные линии обладают надежной продукции секретируемых белков и имеют четко определенные ER. Обратите внимание, что для достижения высокой эффективности добычи, клетки не должны превышать 80% слияния на покровное в день эксперимента.
    2. Если конкретный экзогенных мРНК находится в стадии расследования, клетки трансфицируют один день после посева с плазмиды, содержащие ген, представляющий интерес, используя стандартные протоколы трансфекции. Затем клетки позволили выразить мРНК, по крайней мере 18 часов до извлечения.
  2. Обработки клеток Перевод ингибиторы
    1. Чтобы проверить эффект нетронутыми рибосомы на содержание мРНК связи с ER, клеток можно лечить с помощью перевода ингибиторы, которые нарушают ассоциациирибосом с мРНК 11.
    2. Ингибиторы инициации трансляции, такие как homoharringtonin (ННТ), pactamycin, или 2 - (4-метил-2 ,6-dinitroanilino) - N-methylpropionamide (MDMP), предотвратить новые рибосомы от общения с стенограмму одновременно позволяя заниматься рибосомы, чтобы Полный перевод 12-14. Так как перевод ставка для большинства белков в клетках млекопитающих составляет 5 аминокислот в секунду, независимо от кодонов или мРНК длиной 15, лечении 30 мин необходимо очистить от рибосомы сообщений с открытых рамок считывания до тех пор, 27000 нуклеотидов (кодирующих белки тех пор, как 9000 аминокислот).
    3. Ингибиторы, такие как пуромицин способствовать преждевременному выбросу зарождающейся цепи и таким образом сорвать полисом 12. Однако, чтобы полностью разрушить ассоциации пуромицин обращение рибосомы с мРНК, магния энтеросорбенты, такие как ЭДТА должна быть добавлена ​​в буфер дигитонина добычи 11.
      4. <li> В этом эксперименте клетки обрабатывали 200 мкМ пуромицин, 5 мкМ HHT или контрольной среды в течение 30 мин до извлечения.
  3. Подготовка буфера для экстракции дигитонина. Для визуализации ER-локализованных мРНК без препятствий свободной (то есть цитоплазматическая, не ER-попутного) стенограммы, мы выборочно permeabilize ячейки с дигитонина, стероидный гликозид, который взаимодействует преимущественно с 3β-hydroxysterols. При низких концентрациях дигитонина выборочно permeabilizes части плазматической мембраны, в результате чего "неплотности" 16. В отличие от мембраны ЭР и ядерной оболочки, которые бедны холестерином, остались нетронутыми 16,17.
    1. Дигитонина (Sigma Aldrich) порошок растворяют в дистиллированной воде при 5% вес / объем, и это маточный раствор аликвоты в небольших объемах и хранится в -20 ° C. По нашему опыту, нескольких циклов замораживания-оттаивания снижает эффективность растворения дигитонина.
    2. Исходный раствор10-кратный буфер CHO (1x рабочий раствор концентрацией: 115 мм Кац, 25 мМ HEPES рН 7,4, 2,5 мМ MgCl 2, 2 мМ EGTA и 150 мМ сахарозы) получают с РНКазы реагентов и хранить при температуре -20 ° C. Рабочий раствор (1x CHO буфера) получают путем разбавления раствора с РНКазы свободной воды и может храниться при температуре 4 ° C.

2. Добыча дигитонина

  1. Подготовка Добыча решения
    1. Нагревательный блок с плоской поверхностью предварительно нагретой до 40 ° С и выдерживают при этой температуре в течение с добычей.
    2. Для формирования плоской рабочей поверхности, что является РНКазы свободной, нагревательный блок смачивают небольшим количеством воды и выложил свежий кусок парафильмом M (Bemis Company, Inc). Пузырьки воздуха между листом парафильмом и отопление Блок сглаживаются использованием РНКазы перчатки и Kimwipes (VWR).
    3. 1x CHO буфера нагревают до 37 ° С путем инкубирования в водяной бане.
    4. 6-луночные планшеты используются для мытьяи исправить клетки. Каждая строка 3 скважины используются для одной обложкой скольжения. Для первых двух скважин в ряду, 2 мл подогретого буфера CHO добавлен. Для последних также, 2 мл фиксации решения (PBS + 4% параформальдегида (Electron наук микроскоп)) добавляется. Этот лоток могут быть сохранены в 37 ° С инкубатор пока клетки готовы к добыче.
    5. Дигитонина добычи раствор готовят путем разбавления раствора дигитонина до 0,025% с теплой CHO буфере непосредственно перед использованием. Опять же отметим, что для пуромицин обработанные клетки, извлечение буфер должен содержать дополнительно 20 мМ EDTA эффективно разрушать рибосомы 11. Капли 100 мкл экстракционного раствора помещают на покрытые парафином нагревательный блок непосредственно перед добычи.
  2. Добыча дигитонина и фиксации клеток
    1. Удалить клеток от 37 ° C инкубатора.
    2. Во время процесса экстракции, покровные манипулируют с помощью щипцов jewler автора. СЩипцы подобрать покровное и опустите ее в первый, а затем второй и содержащие CHO буфера, чтобы вымыть из питательной среды.
    3. Быстро промокните лишнюю буфера от задней стороне покровного стекла с Kimwipe и сразу же поместить покровное, сотовые стороной вниз, на добычу решения.
    4. Через 10 секунд, поднимите покровное с помощью пинцета и сразу же передать его, клетки вверх, к лунке, содержащей 4% буфера крепления параформальдегида.
    5. Пусть образец инкубируют в фиксатор в течение 15 мин при комнатной температуре.
  3. Подготовка неэкстрагированных контрольными клетками. Для определения общего количества мРНК в цитоплазме, что это хорошая идея, чтобы подготовить неэкстрагированных контрольного образца.
    1. Клетки, выращенные на покровных готовят, как указано выше (см. раздел 2.2), кроме того, что шаг дигитонина добычи (2.2.3) пропускается.
    2. После фиксации ООН извлеченные клетки должны быть проницаемыми в PBS + 0,1% TritonX-100 в течение 15 мин при комнатной температуре.

3. FISH окрашивания

  1. Проектирование датчиков для флуоресценции в гибридизация
    1. Первичной последовательности мРНК заинтересованных складывается с помощью РНК вторичного программного обеспечения предсказания структуры, такие, как RNAstructure 5,0 18. МРНК складки визуально оценивать для выявления области около 50 нуклеотидов, свободное от основной вторичной структуры.
    2. Обратный дополнением этого региона синтезируется с Alexa546 флуорофора прикреплен к 5 'концу зонда (приобретенный у интегрированные технологии ДНК).
    3. Зонд разбавляют РНКазы свободной воды в запасе концентрации 100 мкМ, которые могут храниться при температуре -20 ° C.
  2. Окрашивание с рыбой зондов
    1. Заметим, что хотя дигитонина экстракты клеток не требует дальнейшего проницаемости, рассматривая эти основные образцы с 2 мл 0,1% Triton X-100 разводили вPBS в течение 15 мин при комнатной температуре до FISH окрашивания, помогает снизить фоновый сигнал.
    2. Слайдов, затем дважды промывают PBS, чтобы удалить остатки параформальдегид или Triton X-100.
    3. Затем клетки промывают два раза с 25% до 60% формамида в 1X цитрат натрия буфера (150 мМ NaCl и 15 мМ цитрат натрия). Как правило, для специфических зондов рыб, которые составляют 50-60 нуклеотидов в длину, 60% формамид используется, но для поли (А) мРНК окрашивания олиго (дТ) FISH зонд, уровень формамида снижается до 25%.
    4. Для подготовки окрашивания камеры, в нижней части на 150 мм блюдо Петри покрыта водой и кусок парафильмом будет плавали на воде. Вода удаляется при повороте на блюдо, тем самым позволяя парафильмом присоединиться к нижней части блюда. Пузырьки воздуха удаляются вручную с Kimwipes.
    5. Для каждого покровное для окрашенных, пипетки 100 мкл каплю раствора, содержащего гибридизации зонда FISH интереса на номинальнуюafilm в окрашивании камеры. Зонд рыбных запасов разбавляют 25% до 60% формамида в гибридизации буфера (1х SSC, 100 мг / мл декстрана сульфата, 1 мг / мл тРНК дрожжей, 5 мМ комплекса ванадила riboside, 25-60% формамид) до рабочей концентрации 0,2 мкм. Обратите внимание, что количество формамида должны быть оптимизированы для конкретного зонда используется и находится в той же концентрации, что и в буфере SSC стирки (см. п. 3.3.3).
    6. Покровное стекло помещается лицом клетки вниз на FISH решения в окрашивании камеру и выдерживают в течение 5-24 часов при 37 ° C в увлажненной камере, такие как тканевая культура инкубатора.
  3. Стиральные и монтаж окрашенных образцов
    1. Для подготовки РНКазы зоны свободной мойки, легла полоса парафильмом на уровне плоской поверхности, например, лаборатории скамейке. Для того, чтобы парафильмом плоская, мокрый ровной поверхности, поместите парафильмом сверху и вручную удалить все пузырьки воздуха с Kimwipes.
    2. Окрашивание камерыудалить из инкубатора и помещен на ровной поверхности. Покровные затем плавал с помощью пипетки около 500 мкл промывочного буфера FISH на краю каждого покровное. Решение будет составлен в период между покровным и парафильмом с помощью капиллярного действия.
    3. Для каждого покровное, 1 мл промывочного буфера (1х SCC с 25-60% формамида, см. шаг 3.3.3) с помощью пипетки на стиральную области парафильмом (см. п. 3.4.1).
    4. Используя щипцы, покровные удаляются из камеры окраски и каждый помещается на каплю моющего буфера и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Стиральная процесс повторяется 3 раза.
    5. Предметные стекла промывали 70% этанолом и высушивали с Kimwipes.
    6. Для каждого покровное, 25 мкл монтажных решений (DAPI Fluoromount G, Southern Biotech) с помощью пипетки на слайде. Обратите внимание, что это решение содержит 4 ',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), который окрашивает ДНК и позволяет для визуализации ядер.
    7. Усинг щипцы и Kimwipes, в задней части покровного сушат и избыток промывочного буфера рыбы смыл с без сушки образца. Каждый покровное затем помещают клетки стороной вниз, на падение монтажные решения.
    8. Конная Затем образцы маркированы и могут быть хранить при 4 ° C.

4. Визуализации и количественной

  1. Изображениями
    1. Эпифлуоресцентной микроскоп используется для изображения клеток после FISH окрашивания. Трансфицированные клетки могут быть дифференцированы от нетрансфицированных клеток яркий флуоресцентный сигнал в соответствующем канале. В идеале, каждый приобретенный поле будет также содержать нетрансфицированных ячейки, которые будут использоваться для определения фоновой флуоресценции для количественной оценки.
    2. Для каждого поля изображения рыб и DAPI канал приобрел. Кроме того, если клетки совместно окрашенных белковых маркеров, образ иммунофлюоресценции канала также приобрели. Обратите внимание, что дигитонина добычи также может быть использованадля визуализации ER-связанного белка рибосом и 11.
    3. Чтобы убедиться, что интенсивность флуоресценции между полями можно сравнить, время экспозиции для каждого канала должна оставаться постоянной для каждого набора опыта.
    4. Опять же для того, чтобы флуоресцентные интенсивности между клетками на разных покровные можно сравнить, изо дня в день изменения в интенсивности эпилюминесцентной или распада в рыбе сигнал должен быть минимизирован путем визуализации все покровные в один присест.
  2. Количественное. Для определения количества мРНК, которая локализуется на ER, мы используем Nikon NIS элемента программного обеспечения. Однако другие программного обеспечения для анализа изображений, такие как ImageJ может быть использован.
    1. Использование элемента Nikon NIS инструмент анализа изображений, периферии клетки и ядра, изложены как отдельные области интересов (РИ).
    2. Для каждого ROI, интенсивность флуоресценции (I T для полной интенсивности клетке, и я п дляядерные интенсивности) и области (Т и N) записываются и экспортировать в таблицу Excel.
    3. Для каждого изображения, фон интенсивность флуоресценции (I B) определяется путем регистрации интенсивности, не трансфицированных клеток. Если поли (А) уровня мРНК в настоящее время анализируются, бесклеточной область выбрана.
    4. Общая сумма ER (в извлекаются клетки) или цитоплазматические (в неэкстрагированных клеток) флуоресценции рассчитывается по формуле:
      [T] [I T - I B] - [N] [N I - I B]
    5. Ядерные интенсивности окрашивания можно также рассчитать и использовать в качестве внутреннего контроля между различными процедурами. Поскольку ядра не влияет на дигитонина лечения 17 или нарушением рибосомы 11, количество ядерных мРНК должно оставаться постоянным между каждой из этих процедур. Для расчета ядерной флуоресценции используется следующая формула:
      [N] [N I - IB]
    6. Процентов цитоплазматических мРНК, которая является ER-целевого может быть рассчитана как среднее флуоресценции ER извлечены из 30-40 клеток (см. 4.2.4), деленное на среднее цитоплазматических флуоресценции от 30-40 неэкстрагированных клеток (опять же см. 4.2.4) . Очень важно, чтобы извлечь и неэкстрагированных клетки готовы, окрашенных и изображается в параллель.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для определения процентного содержания мРНК, которая является ER-связанные, COS-7 клетки, которые трансфицировали плазмидами, которые содержали плацентарной щелочной фосфатазы (ALPP) или цитохром P450-8B1 (CYP8B1) были либо экстрагируют дигитонина и затем фиксировали, или непосредственно зафиксирована (см. Рисунок 1, сравните "неэкстрагированных Ctrl" на "Извлеченные Ctrl"). Неядерной флуоресценции количественно в обеих выборках и доля ER-связанных мРНК была рассчитана (рис. 2). Наши данные ясно показывают, что для ALPP и CYP8B1, около 60% цитоплазматической мРНК связана с ER. Так как оба эти мРНК, кодирующих белки, которые обрабатываются в ER-люмен, наши результаты согласуются с идеей, что такие мРНК переводится на поверхности ER.

Для контроля ER-объединение этих транскриптов после рибосомы диссоциации, трансфицированных COS-7 клетки TReated с контролем средства массовой информации, пуромицин или HHT в течение 30 мин, затем извлечь, фиксировали и окрашивали помощью специальных зондов FISH направлены друг против мРНК (для представителя изображений см. Рисунок 1, для количественного определения ER-и ядерно-связанных мРНК см. Рисунок 3). Отметим, что только ALPP, а не CYP8B1 мРНК, поддерживается на ER после рибосомы разобрали с пуромицином или HHT (рис. 2-3). Важно уровня ядерной мРНК не изменилось между разному обработанные образцы для любой мРНК (рис. 3). Этот постоянный сигнал ядерной FISH указывает, что изменения в интенсивности флуоресценции во фракции ЕР не связаны с изменениями в экспрессии мРНК или изменения FISH окрашивания.

Из этих результатов можно заключить, что подмножество ER-целевой мРНК, таких как протокол ALPP, сохраняется на поверхности этой органеллы рибосомы после разборки.

"Jove_content" FO: Keep-together.within-страница = "Всегда"> Рисунок 1
Рисунок 1. ALPP, но не CYP8B1 мРНК остается связанной с ER независимо от рибосомы и перевод. COS-7 клетки трансфицировали плазмидами, содержащими либо ALPP (верхний ряд), или CYP8B1 (нижний ряд) генов и позволил выразить мРНК 18-24 час. Затем клетки обрабатывали ДМСО контрольной среде ("Ctrl"), пуромицин ("Puro") или HHT в течение 30 мин. Клетки были зафиксированы либо непосредственно ("неэкстрагированных") или сначала экстрагируют затем фиксируется. Обратите внимание, что в то время как контроль и HHT обработанные клетки были извлечены с дигитонина один, Puro-обработанные клетки были извлечены с дигитонина и ЭДТА. Клетки окрашивали на мРНК с использованием специфических зондов рыбы, и образ. Шкала бар = 20 мкм.

lways "> Рисунок 2
Рисунок 2. Количественная оценка уровня ER-ассоциации ALPP и CYP8B1 мРНК. Трансфицированных COS-7 клетки либо непосредственно зафиксирована для определения общего уровня мРНК в цитоплазме (см. Рисунок 1 ", неэкстрагированных Ctrl" клеток) или впервые выделен и затем фиксировали Для определения количества ER-связанных мРНК (см. Рисунок 1 ", извлеченного Ctrl" клеток). Для каждого эксперимента среднее ER-связанной флуоресценции 30-40 извлекаются клетки была разделена на среднюю цитоплазматических флуоресценции 30-40 неэкстрагированных клетки, чтобы дать доля ER-связанного мРНК (Y-ось). Каждая панель представляет собой среднее значение и стандартную ошибку трех независимых экспериментах.

Рисунок 3
Рисунок 3. Количественное ER-асдиссоциации ALPP и CYP8B1 мРНК рибосома после диссоциации. трансфицированных COS-7 клетки обрабатывали среде управления или различных ингибиторов перевода, добытых, фиксированные, витражи для мРНК с использованием специфических зондов рыбы и образ (см. Рисунок 1, «извлекали» клетки). Интенсивности флуоресценции мРНК в ядре ER и количественно. Каждая панель представляет собой среднюю и стандартную ошибку из трех независимых экспериментов, каждый из которых состоит из средней интегральной интенсивности 30 клеток по сравнению с фоновыми и нормированных к флуоресценции в ER контрольно-обработанных клеток (Y-ось). Отметим, что хотя рибосомы неудобства, вызванные CYP8B1 мРНК дистанцироваться от ER, уровня ядерной мРНК были затронуты.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Локализация мРНК в различных субклеточных сайтов, через взаимодействие с белками стенограммы мРНК локализации, является широко распространенным явлением важна для правильной сортировки белков в конечный пункт назначения, а также для тонкой настройки экспрессии генов в местные требования субклеточных 19,20 регионе.

С помощью анализа, описанного здесь, мы вернулись к вопросу о том мРНК, кодирующих белки секреторных может быть сохранен на ER в присутствии или в отсутствии рибосомы или перевода. Действительно, мы обнаружили, что часть этих мРНК имеют эту деятельность 11. Например, с помощью этого протокола экстракции, мы определили, что оба ALPP и CYP8B1 мРНК локализованы на поверхности ER в управлении рассматривается COS-7 клетки (рис. 1-2). Тем не менее, после обработки клеток с переводом ингибиторов пуромицин или HHT, только ALPP, но не CYP8B1 мРНК,остается связанной с ER в отсутствие функциональной рибосомы и перевод (рис. 1, 3). Кроме того, мы ранее обнаружили, что ALPP мРНК остается ER-связанных в COS-7 клетки, обработанные pactamycin 11. Так как эти различные методы лечения действовать через различные механизмы для очистки мРНК связанные рибосомы, маловероятно, что ER-ассоциации ALPP является результатом некоторых косвенных клеточный ответ на любой конкретный препарат. Чтобы подтвердить, что это перевод ингибиторы являются эффективными, это также полезно для проверки того, они препятствуют включению 35 S-метионином во вновь синтезированных белков. Например, мы обнаружили, что MDMP обращения (100 мкМ, 15 мин) может только тормозить 40-60% всех синтеза белка в COS-7 клеток (XA Кюи, А. Ф. Palazzo, неопубликованные данные). В результате, этот препарат не эффективно нарушить ER-локализацию мРНК, которые требуют перевода их адресности и техническое обслуживание (XA Кюи, А. Ф. Palazzo, неопубликованные данные).

Для дальнейшего обеспечения того, чтобы ER-таргетинга мРНК не зависит от последовательности закодированных сигналов или трансмембранных доменов, можно изменить экзогенных стенограммы, так что он кодирует цитоплазматический белок. Действительно, ранее мы показали, что версия мРНК ALPP, что не хватает как сигнальной последовательности и трансмембранный кодирующих областей все еще ​​в состоянии локализовать в ЭР 11.

Стоит также отметить, что метод, представленный здесь в сочетании с другими анализа используются для анализа мРНК ядерного экспорта 21, может быть использована для определения кинетики и требования мРНК транспорта из одного отсека в другой (например, от ядра к поверхности ER). Действительно, по microinjecting плазмиды, содержащие ген ALPP в ядра COS-7 клетки, которые были предварительно с переводом ингибиторы, ранее мы показали, что новоиспеченный ALPPмРНК нацелены на ER независимо от перевода или рибосома-ассоциации 11.

Хотя мы не в полной мере понять, как эти мРНК целевых и привязываются к ER, вполне вероятно, что это органеллы содержит мРНК рецепторов. Действительно, мы недавно идентифицированных P180, большой положительно заряженных мембраносвязанных белков, как необходимый для способности мРНК ALPP должна поддерживаться на ER независимо от перевода 11. Однако, вполне вероятно, что другие рецепторы мРНК должен находиться на поверхности ER 11. С помощью техники, изложенные здесь, мы надеемся определить и анализировать многие из молекулярных механизмов, которые помогают регулировать локализации мРНК в клетках млекопитающих.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами от Национального научного и инженерного исследовательского совета Канады XAC и AFP

References

  1. Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).
  2. Walter, P., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).
  3. Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation. Cell. 71, 489-503 (1992).
  4. Grlich, D., Rapoport, T. A. Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane. Cell. 75, 615-630 (1993).
  5. Milcarek, C., Penman, S. Membrane-bound polyribosomes in HeLa cells: association of polyadenylic acid with membranes. J. Mol. Biol. 89, 327-338 (1974).
  6. Lande, M. A., Adesnik, M., Sumida, M., Tashiro, Y., Sabatini, D. D. Direct association of messenger RNA with microsomal membranes in human diploid fibroblasts. J. Cell Biol. 65, 513-528 (1975).
  7. Cardelli, J., Long, B., Pitot, H. C. Direct association of messenger RNA labeled in the presence of fluoroorotate with membranes of the endoplasmic reticulum in rat liver. J. Cell Biol. 70, 47-58 (1976).
  8. Adesnik, M., Lande, M., Martin, T., Sabatini, D. D. Retention of mRNA on the endoplasmic reticulum membranes after in vivo disassembly of polysomes by an inhibitor of initiation. J. Cell Biol. 71, 307-313 (1976).
  9. Kruppa, J., Sabatini, D. D. Release of poly A(+) messenger RNA from rat liver rough microsomes upon disassembly of bound polysomes. J. Cell Biol. 74, 414-427 (1977).
  10. Adesnik, M., Maschio, F. Segregation of specific classes of messenger RNA into free and membrane-bound polysomes. Eur. J. Biochem. 114, 271-284 (1981).
  11. Cui, X. A., Zhang, H., Palazzo, A. F. p180 Promotes the Ribosome-Independent Localization of a Subset of mRNA to the Endoplasmic Reticulum. PLoS Biol. 10, e1001336 (2012).
  12. Pestka, S. Inhibitors of ribosome functions. Annu. Rev. Microbiol. 25, 487-562 (1971).
  13. Fresno, M., Jimnez, A., Vzquez, D. Inhibition of translation in eukaryotic systems by harringtonine. Eur. J. Biochem. 72, 323-330 (1977).
  14. Weeks, D. P., Baxter, R. Specific inhibition of peptide-chain initiation by 2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide. Biochemistry. 11, 3060-3064 (1972).
  15. Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes. Cell. 147, 789-802 (2011).
  16. Lerner, R. S., et al. Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes. RNA. 9, 1123-1137 (2003).
  17. Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors. J. Cell Biol. 111, 807-816 (1990).
  18. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
  19. Lcuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
  20. Lcuyer, E., Yoshida, H., Krause, H. M. Global implications of mRNA localization pathways in cellular organization. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 409-415 (2009).
  21. Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. Analysis of mRNA nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection. J Vis Exp. 46, e2387 (2010).

Tags

Клеточной биологии выпуск 70 биохимии генетики молекулярной биологии геномики локализации мРНК РНК дигитонина добычи фракционирования клетки эндоплазматическая сеть секреции микроскопия изображений флуоресцентный FISH клеточной биологии
Визуализация эндоплазматического ретикулума Локализованные мРНК в клетках млекопитающих
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Cui, X. A., Palazzo, A. F.… More

Cui, X. A., Palazzo, A. F. Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (70), e50066, doi:10.3791/50066 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter