इकट्ठा करने और मापने सर्जिकल घाव में घाव पीब बायोकेमिकल मध्यस्थों

Summary

इस अनुच्छेद के सर्जिकल घाव सिजेरियन डिलीवरी के बाद साइट पर जैव रासायनिक भड़काऊ और nociceptive मध्यस्थों को इकट्ठा करने और मापने के लिए एक पद्धति की एक विस्तृत और दृश्य विवरण प्रदान करता है. यह मानव bioassay घाव और सीरम cytokine सांद्रता और घाव साइटोकिन्स, chemokines और neuropetides में दवा की मध्यस्थता परिवर्तन के बीच सहसंबंध का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.

Abstract

हम एक पद्धति है जिसके द्वारा हम सर्जिकल घाव साइट में जैव रासायनिक भड़काऊ और nociceptive मध्यस्थों को इकट्ठा करने और मापने के लिए सक्षम हैं का वर्णन करता है. साइट विशिष्ट जैव रासायनिक मार्करों एकत्रित सीरम और शल्य चिकित्सा घाव में स्तरों के बीच संबंधों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, मध्यस्थ रिहाई, दर्द, एनाल्जेसिक उपयोग और हित के अन्य परिणामों के बीच किसी भी संगठन का निर्धारण, और सर्जिकल घाव पर प्रणालीगत और परिधीय दवा प्रशासन के प्रभाव का मूल्यांकन जैव रसायन. इस पद्धति स्वस्थ रीढ़ की हड्डी संज्ञाहरण के साथ वैकल्पिक सीजेरियन प्रसव के दौर से गुजर महिलाओं के लिए लागू किया गया है. हम रोगी के दर्द स्कोर और 48 घंटे के बाद सिजेरियन प्रसव के लिए दर्दनाशक दवाओं की खपत के रूप में एक ही समय के अंतराल पर घाव exudate और सीरम मध्यस्थों मापा गया है. इस पद्धति का उपयोग हम तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF), प्रोस्टाग्लैंडीन E2 (पीजी E2) पदार्थ पी, आईएल 1β, IL-2, IL-4, IL-6, आईएल -7 सहित विभिन्न जैव रासायनिक मध्यस्थों का पता लगाने में सक्षम है, आईएल -8,, आईएल -12, आईएल -13, आईएल -17, TNFα, INFγ, जी - सीएसएफ, जीएम-CSF, MCP-1 और एमआइपी - 1β. 10-आईएल इस मानव शल्य घाव bioassay लगाने अध्ययन घाव और सीरम cytokine सांद्रता या उनके समय रिलीज प्रोफाइल के बीच कोई correlations पाया है (जम्मू दर्द 2008, 9 (7) :650-7) ¹ हम भी तकनीक की उपयोगिता दस्तावेज की पहचान. घाव cytokine सामग्री में दवा की मध्यस्थता में परिवर्तन (Anesth Analg 2010; 111:1452-9) ^2.

Introduction

एक शल्य चीरा के बाद, निवासी और भड़काऊ कोशिकाओं पलायन समर्थक और विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स, prostanoids, neuropeptides और chemokines कि शुरुआत और बनाए रखने के दर्द के लिए महत्वपूर्ण हैं ^3,4 साइट विशिष्ट जैव रासायनिक मार्करों इकट्ठा करने की क्षमता जारी निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है. सीरम और शल्य चिकित्सा घाव में स्तरों के बीच संबंध, मध्यस्थ जारी है और शल्य चिकित्सा के दर्द के बीच जटिल संबंधों को समझने की, और सर्जिकल घाव जैव रसायन पर दोनों प्रणालीगत और परिधीय दवा प्रशासन की प्रभाव का मूल्यांकन करने में सक्षम हो. अध्ययन जैव रासायनिक मध्यस्थों के प्रणालीगत माप पर ध्यान केंद्रित किया है और नहीं माना जाता है. साइट विशेष रिहाई साइटोकिन्स और chemokines के ^5,6 सीरम माप हो सकता है और नहीं हो सकता है स्थानीय सर्जिकल घाव जैव रासायनिक घटनाओं के चिंतनशील केवल एक वैश्विक शल्य चोट प्रणालीगत प्रतिक्रिया से संकेत मिलता है. यह लेख इस पद्धति की एक विस्तृत और अद्वितीय दृश्य वर्णन है कि प्राथमिकी था प्रदान करता हैसेंट दर्द के जर्नल में 2008 में संदर्भित ¹ इस जौव लेख के उद्देश्य के लिए तरीकों की एक अद्वितीय और नेत्रहीन बढ़ाया वर्णन प्रदान करना है.

Protocol

1. अध्ययन प्रोटोकॉल

• संस्थागत समीक्षा बोर्ड के अनुमोदन और लिखित सूचित सहमति प्राप्त है.
• अध्ययन के संचालन के लिए एक उपयुक्त शल्य जनसंख्या का चयन करें. इस पद्धति केवल सीजेरियन प्रसव घाव लागू कर दिया गया है, लेकिन सबसे शल्य घाव उपयुक्त होगा.
• अपने अध्ययन में भागीदारी के लिए शामिल किए जाने और अपवर्जन मानदंड पर विचार करें. सर्जिकल घाव संक्रमण की उच्च दर के साथ मरीजों और प्रक्रियाओं को उपयुक्त नहीं हो सकता.
• सभी संभावित confounders से बचने के रोगियों के लिए संज्ञाहरण और पश्चात प्रबंधन मानकीकरण.

2. Nociceptive और भड़काऊ बायोकेमिकल मध्यस्थ संग्रह

• पर क्यू SilverSoaker (मैं प्रवाह, झील वन, CA) के साथ पर क्यू PainBuster उपचर्म परत में सम्मिलित करने के लिए बस से पहले बंद करने (अन्य ऊतक परतों में माना जा सकता है) घाव. पर क्यू PainBuster दर्द राहत सिस्टम लगातार 2 मिलीग्राम / घंटे की दर पर सामान्य नमक बचाता है. कंघी वाहक हो सकते हैंसाथ ined या ब्याज की एक स्थानीय संवेदनाहारी और गैर स्टेरायडल विरोधी inflammatories रूप में ऐसी दवाओं की तुलना में.
• इस प्रणाली में एक मानक तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी को शामिल करने के लिए निर्दिष्ट समय बिंदुओं पर घाव exudate की आकांक्षा की अनुमति. निरंतर प्रेरणा के थक्के से कैथेटर को रोकता है और प्रणाली की विश्वसनीयता में सुधार करने के लिए exudate नमूनों का उत्पादन. यदि exudate की आकांक्षा कठिन है (मामलों के लगभग 5%), धीरे घाव ऊपर धक्का, विषय स्थिति बदल रहा है (उदाहरण के लिए, रोगी बैठे या उन्हें फ्लैट झूठ बोल रही है), एक 0.5-1 मिलीग्राम सामान्य खारा फ्लश का उपयोग कर या वापस लेने पर विचार कैथेटर 1-2 सेमी.
• प्रोटोकॉल (उदाहरण के लिए, 1, 4, 6, 24, और सिजेरियन प्रसव के बाद 48 घंटा) द्वारा निर्दिष्ट समय बिंदुओं पर aspirate और घाव exudate के 1 मिलीग्राम वापस लेने का. एक polyethylene proteinase अवरोध करनेवाला के 30 μl युक्त कप में exudate स्थानांतरण. हम हमारे उद्देश्यों के लिए पूरी proteinase एफडीए (बायोसाईंस Roche, पालो अल्टो, CA) का इस्तेमाल किया है.
• संग्रह के 1 घंटे के भीतर, बर्फ और अपकेंद्रित्र पर 10 मिनट के लिए 3,000 rpm नमूने डाल दिया.
• एक मानक microcentrifuge और -20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब की दुकान में सीरम और घाव supernate और जगह निकालें

3. परख विश्लेषण

• एक बार सभी अध्ययन exudate और सीरम के नमूने एकत्र कर रहे हैं और संग्रहीत पिघलना है और एक ही समय में नमूनों का विश्लेषण.
• हम एक मल्टीप्लेक्स immunoassay का उपयोग साइटोकिन्स और chemokines मापा गया है. मल्टीप्लेक्स इम्युनो परख तकनीक हमें छोटे (50 μl) मात्रा नमूनों से कई analytes परख करने की अनुमति देता है. मल्टीप्लेक्स एलिसा के साथ प्राप्त उन लोगों के साथ तुलनीय परिणाम का उत्पादन. हम 17-plex जैव PlexTM प्रणाली का इस्तेमाल किया है (BioRad, Hercules, सीए हमारे विश्लेषण के लिए). इस परख ट्यूमर परिगलन कारक α (TNFα), इंटरफेरॉन α (INFα), इंटरल्यूकिन 1β (आईएल 1β), 2 इंटरल्यूकिन (IL-2), 4 इंटरल्यूकिन (आईएल-4), 5 इंटरल्यूकिन (आईएल-5 को मापने के लिए सक्षम है ), इंटरल्यूकिन 6 (IL-6), 7 इंटरल्यूकिन (आईएल-7), 8 इंटरल्यूकिन (आईएल-8), इंटरल्यूकिन (आईएल -10), 12 इंटरल्यूकिन (आईएल -12), 13 इंटरल्यूकिन (आईएल -13), इंटरल्यूकिन 17 (आईएल -17), कॉलोनी उत्तेजक कारक (G-CSF), granulocyte-बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-CSF), monocyte chemoattractant प्रोटीन 1 (MCP-1) और बृहतभक्षककोशिका भड़काऊ प्रोटीन 1 (एमआईपी - 1β). तंत्रिका वृद्धि कारक NGF DY256 एंटीबॉडी के साथ प्लेट 17-plex यह जैव Plex amine युग्मन किट के साथ जोड़कर मापा गया था.
• अच्छी गुणवत्ता विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए, प्रत्येक माप दो प्रतियों में किया जाना चाहिए. प्रत्येक analyte के लिए मानक घटता संदर्भ निर्माता द्वारा आपूर्ति analytes का उपयोग (0.20 की सांद्रता में, 0.78, 3.13, 12.5, 50, 200, 800, 3200 स्नातकोत्तर / एमएल प्लस द्वारा उत्पन्न कर रहे हैंसामान्य नमक के लिए एक शून्य मानक). मानक घटता प्रत्येक चलाने में शामिल कर रहे हैं और नमूना सांद्रता जैव Plex प्रबंधक सॉफ्टवेयर के साथ गणना कर रहे हैं.
• मादक द्रव्यों के पी और प्रोस्टाग्लैंडीन E2 अत्यधिक संवेदनशीलता एलिसा किट का उपयोग कर मापा गया. हम इस विश्लेषण के लिए परख डिजाइन इंक (एन आर्बर, मिशिगन) का इस्तेमाल किया है. निर्माता विनिर्देश के अनुसार दो प्रतियों में विश्लेषण प्रदर्शन.

Representative Results

इस पद्धति का उपयोग हम सभी जैव रासायनिक घाव exudate और प्लाज्मा में आईएल-5 के अपवाद के साथ ऊपर उल्लिखित मध्यस्थों का पता लगाने में सक्षम हो गया है ^1,2 कुछ अतिरिक्त साइटोकिन्स प्लाज्मा में पता नहीं (IL-4, आईएल 17, TNFα थे,. INFγ जीएम-CSF) ¹ रिपोर्ट के अध्ययन में मापा साइटोकिन्स और chemokines के समय पाठ्यक्रम अनुरूप थे, कि 24 घंटे के प्रेक्षण अवधि के लिए निरंतर था पहले कुछ घंटों के भीतर एक पठार .. ^1,2 हालांकि, NGF में तेजी से वृद्धि हुई है तक पहुँचने 24 घंटे के संग्रह अवधि, जबकि PGE2 1 घंटे के भीतर नुकीला और फिर तेजी से कमी हुई. ¹ विशेष रूप से उल्लेखनीय परिणाम स्पष्ट रूप से आईएल-10 के स्तर को कम कर रहे हैं और स्थानीय संवेदनाहारी bupivacaine, के साथ संगत के साथ डाले घावों में पदार्थ पी के स्तर में वृद्धि हुई एक समग्र समर्थक एक अलग अध्ययन में दवा की भड़काऊ प्रभाव (1 चित्रा). ² हम सिजेरियन डे के बाद कि एनाल्जेसिक खपत का प्रदर्शनपोशाक सर्जरी नकारात्मक घाव exudate IL-6, आईएल-1 β, और जी सी.एस.एफ. सांद्रता (2 चित्रा) के साथ सहसंबद्ध था ^1.

चित्रा 1-10 इंटरल्यूकिन (आईएल -10) और पदार्थ पी exudate स्तर (पीजी / एमएल) स्तर 1 पर मापा, 3, 5, 7, और 24 घंटे के बाद सिजेरियन प्रसव घाव. सामान्य नमक समूह ग्रे हीरे में संकेत दिया है, और bupivacaine समूह काले चौकों के साथ दिखाया गया है. * काफी समूहों के बीच अलग = (पी <0.005).

चित्रा 2 interleukin-6 (पीजी / एमएल) और सिजेरियन डिलीवरी के बाद पहले 24 घंटे में अफ़ीम की खपत के बीच सहसंबंध.

Discussion

ऊपर उल्लिखित पद्धति काफी संवेदनशील घाव exudate में जैव रासायनिक भड़काऊ और nociceptive मध्यस्थों का पता लगाने होना पाया गया है. विभिन्न समय बिंदुओं पर नमूनाकरण भी हमें इन मध्यस्थों के समय के साथ परिवर्तन ^1,2 हम किसी भी अन्य मानव शल्य घाव परख है कि serially सर्जिकल घाव exudate में सूजन और nociceptive मध्यस्थों की रिहाई प्रोफाइल उपाय कर सकते हैं के बारे में पता नहीं कर रहे हैं निरीक्षण करने के लिए अनुमति दी गई है. शल्य चीरा साइट से हमारे घाव exudate संग्रह की पद्धति से परिणाम संयुक्त कूल्हे, ^7,8 जो पता चलता है कि चमड़े के नीचे घाव मध्यस्थ रिहाई intraarticular या शरीर के अन्य जैव रासायनिक मध्यस्थ रिहाई cavities से अलग हो सकता है कि से नालियों का उपयोग अध्ययन से अलग है. इसके अतिरिक्त, नालियों में प्राप्त परिणामों के घाव में खून की कमी से चकित किया जा सकता है, और इसलिए वे सही स्थानीय जैव रासायनिक मध्यस्थ रिहाई प्रतिबिंबित नहीं कर सकते.

बीच सहसंबंध गरीबघाव और सीरम के स्तर साइट विशेष रिहाई निर्धारित जब शल्य घाव का अध्ययन के महत्व को दर्शाता है. स्थानीय परिवर्तन और प्रणालीबद्ध अंतर शल्य आघात और तनाव के जवाब में प्रणालीगत और स्थानीय उत्पादन सहित कई कारकों के कारण यह नहीं परिलक्षित किया जा सकता है. हालांकि हम समर्थक और विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स और chemokines के एक विशेष चयन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से NGF सपा, और पीजी E2 सिजेरियन डिलीवरी घाव exudate, ^1,2 से इस पद्धति अन्य शल्य मॉडलों के लिए लागू किया जा सकता है और कई अन्य उपाय करने के लिए चुना है जैव रासायनिक मध्यस्थों.

सर्जिकल घाव स्थानीय संवेदनाहारी टपकाना पश्चात दर्द में सुधार के लिए एक सामान्य तकनीक का इस्तेमाल किया है ⁹ पद्धति लागू, हम कि शल्य घाव में स्थानीय संवेदनाहारी टपकाना प्रदर्शित करता है घाव जैव रसायन को प्रभावित करने में सक्षम हो गया है. ² आईएल-10 में कमी और पदार्थ पी में वृद्धि bupivacaine टपकाना घाव exudates में एक व्यवधान ओ पता चलता हैच मॉडुलन विरोधी भड़काऊ. Peripherally प्रशासित स्थानीय anesthetics जिससे सूजन प्रक्रियाओं, ^10,11, जो आंशिक रूप से सर्जरी के बाद चतनाशून्य करनेवाली औषधि के प्रेरित जोड़ों में स्थानीय उपास्थिलयन के लिए खाते सकता है प्रभावित कर सकता है. ¹²

पर क्यू PainBuster दर्द राहत सिस्टम एक अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) 1998 है कि स्थानीय anesthetics के सर्जिकल घाव साइट पर प्रसव के लिए प्रयोग किया जाता है करने के लिए सर्जरी के बाद दर्द को कम करने के बाद से डिवाइस को मंजूरी दे दी है. सतत घाव इस और अन्य कैथेटर का उपयोग टपकाना बढ़ घाव संक्रमण के साथ जुड़ा नहीं है ^9,13 पर क्यू पर क्यू SilverSoaker के साथ PainBuster दवाओं को बढ़ाने और घाव exudate बार बार नहीं नमूना बनाया है. हालांकि हम इस तकनीक के साथ कोई घाव में संक्रमण पड़ा है, हम एक सड़न रोकनेवाला तकनीक तनाव जबकि इस प्रणाली से घाव exudate नमूना. हमारे प्रस्तावित संशोधन नमूने की सुविधा अनुसंधान प्रयोजनों के लिए आरक्षित किया जाना चाहिए और नियमित नैदानिक ​​यू के लिएसे. हम यह भी अनुशंसा है कि अवधि कैथेटर में स्वस्थानी रहता 48-72 घंटे तक सीमित किया जा.

इस शल्य साइट bioassay तकनीक पश्चात दर्द में भड़काऊ और nociceptive जैव रासायनिक मध्यस्थों के बीच संबंधों को समझने के लिए एक अच्छा मॉडल प्रदान करता है. हम भविष्य के अध्ययनों में पद्धति का उपयोग करने के लिए स्थानीय स्तर पर प्रशासित गैर स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ दवाओं और नशीले पदार्थों के प्रभाव की जांच करेंगे. तकनीक भी खुद को घाव भरने, अत्यधिक scarring शल्य घाव और संक्रमण की जांच की जांच के लिए उधार दे सकता है.