Sammeln und Messen Wundexsudat Biochemische Mediatoren In chirurgische Wunden

Summary

Dieser Artikel enthält eine detaillierte und visuelle Beschreibung einer Methode zur Sammlung und Messung biochemischer entzündlichen und nozizeptiven Mediatoren an der chirurgischen Wunde nach Kaiserschnitt. Diese menschliche Bioassay wurde verwendet, um Korrelationen zwischen Wunde und Serum Cytokinkonzentrationen und Drug-vermittelten Änderungen Wunde Zytokinen, Chemokinen und neuropetides bestimmen.

Abstract

Wir beschreiben eine Methode, mit der wir in der Lage zu erfassen und zu messen biochemischen entzündlichen und nozizeptiven Mediatoren an der chirurgischen Wunde. Sammeln site-spezifische biochemische Marker ist wichtig, die Beziehung zwischen den Ebenen in Serum und Operationswunde zu verstehen, ermitteln die Assoziationen zwischen Mediatorfreisetzung, Schmerz, Analgesie und andere Ergebnisse von Interesse, und bewerten die Wirkung der systemischen und periphere Verabreichung des Arzneimittels auf Operationswunde Biochemie. Diese Methode wurde bei gesunden Frauen nach elektiven Kaiserschnitt mit Spinalanästhesie angewendet worden. Wir haben Wundexsudat und Serum Mediatoren in den gleichen Zeitintervallen wie Patienten Schmerz-Scores und Analgetika Verbrauch für bis zu 48 Stunden nach der Kaiserschnitt gemessen. Mit dieser Methode ist es uns gelungen, verschiedene biochemische Mediatoren einschließlich Nervenwachstumsfaktor (NGF), Prostaglandin E2 (PG-E2) Substanz P, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7 zu detektieren, IL-8,IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNF, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 und MIP-1β. Studien, die diese humanen Operationswunde Bioassay haben keine Korrelationen zwischen Wunde und Serum Cytokinkonzentrationen oder deren zeitliche Freisetzungsprofil gefunden (J Pain 2008;. 9 (7) :650-7) ¹ Wir haben auch die Nützlichkeit der Technik dokumentiert, um zu identifizieren. Drogen-vermittelte Veränderungen in der Wunde Zytokin-Gehalt (Anesth Analg 2010; 111:1452-9). ²

Introduction

Nach einem chirurgischen Eingriff, wohnhaft und Migration entzündlichen Zellen freizusetzen pro-und anti-inflammatorischen Zytokinen, Prostanoide, Neuropeptide und Chemokine, die wichtig für die Einleitung und Aufrechterhaltung Schmerzen. ^3,4 Die Möglichkeit, Site-spezifische biochemische Marker zu sammeln, ist entscheidend für die Bestimmung Beziehung zwischen den Ebenen im Serum und Operationswunde, verstehen die komplexen Beziehungen zwischen Mediatorfreisetzung und chirurgische Schmerzen, und in der Lage sein, um die Wirkung von sowohl systemischer und peripheren Arzneimittelverabreichung auf Operationswunde Biochemie auszuwerten. Studien haben sich auf Messungen von systemischen biochemische Mediatoren konzentriert und nicht als ortsspezifische Freisetzung. ^5,6 Serum Messungen von Cytokinen und Chemokinen eventuell nicht reflektierenden lokaler Operationswunde biochemischen Ereignisse und zeigen nur eine globale systemischen Reaktion auf chirurgische Verletzung. Dieser Artikel bietet eine detaillierte und einzigartige visuelle Beschreibung der Methodik, die Tannen warst 2008 im Journal of Pain verwiesen. ¹ Das Ziel dieser JoVE Artikels ist es, eine einzigartige und optisch verbesserte Beschreibung der Methoden liefern.

Protocol

Ein. Study Protocol

• Erhalten Institutional Review Board Genehmigung und schriftlicher Einwilligung.
• Wählen Sie eine geeignete chirurgische Bevölkerung Studiendurchführung. Diese Methode wurde nur Kaiserschnitt Wunden angewendet worden, aber die meisten chirurgischen Wunden angemessen wäre.
• Betrachten Einschluss-und Ausschlusskriterien für Ihre Teilnahme an der Studie. Patienten und Verfahren mit hohen chirurgischen Wundinfektionen möglicherweise nicht geeignet.
• Standardisieren Anästhesie und postoperative Behandlung für alle Patienten, um mögliche Störfaktoren zu vermeiden.

2. Nozizeptiven und Inflammatory Biochemical Mediator Sammlung

• Legen Sie die ON-Q PainBuster mit ON-Q SilverSoaker (I-Flow, Lake Forest, CA) in die subkutane Schicht kurz vor der Schließung (andere Gewebeschichten können berücksichtigt werden) gewickelt. Die ON-Q PainBuster Pain Relief-System liefert kontinuierlich physiologische Kochsalzlösung mit einer Rate von 2 ml / h. Der Träger kann KammsINED mit oder im Vergleich zu Drogen von Interesse, wie ein Lokalanästhetikum und nicht-steroidale Entzündungshemmer.
• Integrieren Sie eine Standard-Drei-Wege-Hahn in dieses System, um eine Aspiration von Wundexsudat zu festgelegten Zeitpunkten zu ermöglichen. Die kontinuierliche Infusion verhindert den Katheter von Gerinnungszeit und verbessert die Zuverlässigkeit des Systems, um Exsudat Proben zu erzeugen. Falls Aspiration von Exsudat ist schwer (ca. 5% der Fälle), sollten Sie sanft über der Wunde, das Thema zu wechseln die Position (z. B. sitzt der Patient oder liegend sie flach) mit einem 0,5-1 ml normaler Kochsalzlösung oder Aberkennung der Katheters 1-2 cm.
• Zeitpunkten durch die Protokoll (z. B. 1, 4, 6, 24 und 48 h nach Kaiserschnitt) angegeben, ansaugen und abheben 1 ml Wundexsudat. Übertragen Sie das Exsudat in einer Polyethylen-Becher mit 30 ul Proteinase-Inhibitor. Wir haben komplette Proteinase-Inhibitor (Roche Bioscience, Palo Alto, CA) für unsere Zwecke verwendet.
• Innerhalb von 1 h-Sammlung, legte Proben auf Eis und Zentrifuge bei 3.000 rpm für 10 min.
• Entfernen Serum und Wunde Überstand und in einem Standard-Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C.

3. Assay-Analyse

• Sobald die gesamte Studie Exsudat und Serumproben gesammelt und gespeichert werden, auftauen und Analyse der Proben zur gleichen Zeit.
• Wir haben die Cytokine und Chemokine unter Verwendung eines Multiplex-Immunoassay gemessen wird. Das Multiplex-Immuno-Assay-Technik ermöglicht es uns, Assay zahlreichen Analyten aus kleinen (50 ul) Probenvolumina. Die Multiplex produzieren Ergebnisse vergleichbar zu denen mit ELISA erzielt. Wir haben die 17-plex Bio-PlexTM System (BioRad, Herc verwendetModule, CA) für unsere Analyse. Dieser Assay ist für die Messung von Tumornekrosefaktor α (TNF), Interferon α (INFα), Interleukin 1β (IL-1β), Interleukin 2 (IL-2), Interleukin 4 (IL-4), Interleukin-5 (IL-5 ), Interleukin 6 (IL-6), Interleukin 7 (IL-7), Interleukin 8 (IL-8), Interleukin (IL-10), Interleukin 12 (IL-12), Interleukin 13 (IL-13), Interleukin 17 (IL-17), Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor (G-CSF), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1) und Makrophagen inflammatorisches Protein 1 (MIP-1β). Nerve growth factor wurde mit NGF DY256 Antikörper, indem Sie es an die 17-plex Platte mit dem Bio-Plex Amin Kupplung Kit gemessen.
• Um eine gute Qualität Analyse zu gewährleisten, sollte jede Messung doppelt gemacht werden. Standardkurven für jeden Analyten unter Verwendung Bezugnahme Analyten durch den Hersteller (bei Konzentrationen von 0,20, 0,78, 3,13, 12,5, 50, 200, 800, 3200 pg / ml plus erzeugteneine Null-Standard für die normale Kochsalzlösung). Standardkurven werden in jedem Durchlauf und Probenkonzentrationen sind mit Bio-Plex Manager-Software berechnet.
• Substanz P und Prostaglandin E2 wurden mit hoch Sensibilität ELISA Kits. Wir haben Assay Designs, Inc. (Ann Arbor, Michigan) für diese Analyse verwendet. Führen Sie die Analyse in zweifacher Ausfertigung nach den Angaben des Herstellers.

Representative Results

Mit dieser Methode ist es uns gelungen, alle biochemischen Mediatoren oben mit Ausnahme von IL-5 in Wundexsudat und Plasma umrissen detektieren. ^1,2 Einige zusätzliche Cytokine wurden im Plasma nicht erkannt (IL-4, IL-17, TNF, INFγ , GM-CSF). ^1. Der zeitliche Verlauf der gemessenen Zytokine und Chemokine in berichteten Studien waren konsistent und erreichte ein Plateau innerhalb der ersten Stunden, die für das 24-Stunden Beobachtungszeitraum aufrechterhalten wurde .. ^1,2 Jedoch erhöhte NGF stetig über die 24-Stunden Erfassungszeitraum, während PGE2 innerhalb von 1 Stunde erreichte und dann stetig gesunken. ¹ Besonders bemerkenswerte Ergebnisse sind deutlich Spiegel von IL-10 verringert und ein höheres Maß an Substanz P in Wunden mit dem Lokalanästhetikum Bupivacain, kompatibel mit eingeflößt eine umfassende Pro- inflammatorische Wirkung des Medikaments (Abbildung 1). ² In einer anderen Studie haben wir gezeigt, dass die analgetische Verbrauch nach Kaiserschnitt deLackierung Operation wurde negativ mit Wundexsudat IL-6, IL-1 β und G-CSF-Konzentrationen (Abbildung 2) korreliert. ¹

Abbildung 1. Interleukin-10 (IL-10) und Substanz P gewickelt Exsudatmengen Ebenen (pg / ml) in 1 gemessen, 3, 5, 7 und 24 Stunden nach Kaiserschnitt. Die physiologische Kochsalzlösung Gruppe ist grau Diamanten angegeben, und die Gruppe wird Bupivacain mit schwarzen Quadraten gezeigt. * = Signifikant verschieden zwischen den Gruppen (P <0,005).

Abbildung 2. Korrelation zwischen Interleukin-6 (pg / ml) und Morphin Verbrauch in den ersten 24 Stunden nach Kaiserschnitt.

Discussion

Diese Methodik skizzierten hat sich als sensitiv genug, um entzündliche und biochemische Mediatoren in nociceptiven Wundexsudat detektieren. Probenahme an verschiedenen Zeitpunkten hat uns auch die Möglichkeit, Änderungen dieser Mediatoren im Laufe der Zeit. ^1,2 Wir sind keine Kenntnis von einem anderen menschlichen Operationswunde Assay, seriell messen kann das Freisetzungsprofil von entzündlichen und nozizeptiven Mediatoren in der chirurgischen Wundexsudat beobachten. Ergebnisse unserer Methode von Wundexsudat Sammlung von dem chirurgischen Inzisionsstelle unterscheidet sich von Untersuchungen unter Verwendung fließt aus dem Hüftgelenk, wonach ^7,8 subkutane Wunde Mediatorfreisetzung kann sich von intraartikulären oder andere Körperhöhlen biochemischen Mediatorfreisetzung schlägt. Darüber hinaus können die Ergebnisse in die Kanalisation erhalten durch den Blutverlust in die Wunde verwechselt werden, und deshalb können sie nicht genau widerspiegeln lokalen biochemischen Mediatorfreisetzung.

Die schwache Korrelation zwischenWund-und Serumspiegel zeigt die Bedeutung der Bestimmung ortsspezifische Freisetzung beim Studium Operationswunden. Lokale Änderungen können nicht systemisch, wegen der vielen Faktoren, einschließlich Differential systemische und lokale Produktion als Reaktion auf chirurgische Trauma und Stress reflektiert werden. Obwohl wir haben sich für eine bestimmte Auswahl von Pro-und Anti-inflammatorische Zytokine und Chemokine sowie NGF, SP und PG-E2 aus Kaiserschnitt Wundexsudat, ^1,2 Diese Methodik kann auf andere chirurgische Modelle angewendet werden und viele andere messen biochemischen Mediatoren.

Operationswunde Lokalanästhetikum Instillation ist eine häufig verwendete Technik zur Verbesserung der postoperativen Schmerzen. ⁹ Anwendung der Methodik konnten wir, dass Lokalanästhetika Instillation in Operationswunden zu demonstrieren hat Wunde Biochemie beeinflussen. ² Eine Abnahme der IL-10 und der Erhöhung der Substanz P in Wundflüssigkeit mit Bupivacain Instillation schlägt eine Störung of entzündungshemmende Modulation. Peripher verabreicht Lokalanästhetika kann dadurch Einfluss auf die entzündlichen Prozesse, ^10,11, die teilweise für die lokale Anästhesie-induzierten Knorpelschwund in den Gelenken verantwortlich nach der Operation kann. ¹²

ON-Q PainBuster Pain Relief System ist eine US-amerikanische Food and Drug Administration (FDA) zugelassen Gerät seit 1998, die für die Lieferung von Lokalanästhetika auf die chirurgische Wunde verwendet wird, um Schmerzen nach der Operation zu reduzieren. Kontinuierliche Wunde Instillation nutzen diese und andere Katheter wurde nicht mit einem erhöhten Wundinfektionen in Verbindung gebracht. ^9,13 ON-Q PainBuster mit ON-Q SilverSoaker wurde entwickelt, um Medikamente einzuflößen und nicht wiederholt probieren Wundexsudat. Wir hatten zwar keine Wundinfektionen mit dieser Technik haben, betonen wir eine aseptische beim Abtasten Wundexsudat aus diesem System. Unsere vorgeschlagene Änderung der Probenahme zu erleichtern, sollte für wissenschaftliche Zwecke reserviert und nicht für die routinemäßige klinische use. Wir empfehlen auch, dass die Dauer der Katheter bleibt in-situ zu 48-72 Stunden begrenzt werden.

Dieses chirurgische Website Bioassay-Technik bietet ein gutes Modell, um die Beziehung zwischen entzündlichen und nozizeptiven biochemischen Mediatoren in der postoperativen Schmerztherapie zu verstehen. Wir werden die Methodik in zukünftigen Studien verwenden, um Effekte von lokal verabreicht nicht-steroidalen Antirheumatika und Opioide untersuchen. Die Technik kann auch auf Untersuchungen eignet sich die Prüfung Wundheilung, übermäßiger Narbenbildung und chirurgischen Wundinfektionen.