Summary
Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata e visiva di una metodologia per la raccolta e la misurazione biochimici mediatori infiammatori e nocicettivi nel sito della ferita chirurgica dopo il parto cesareo. Questo saggio biologico umano è stato utilizzato per determinare le correlazioni tra ferita e concentrazioni sieriche di citochine e farmaco-mediata cambiamenti ferita citochine, chemochine e neuropetides.
Abstract
Descriviamo un metodo mediante il quale siamo in grado di raccogliere e misurare biochimici mediatori infiammatori e nocicettivi nel sito della ferita chirurgica. Raccolta di marcatori biochimici specifici del sito è importante per capire la relazione tra i livelli di siero e ferita chirurgica, determinare eventuali associazioni tra rilascio di mediatori, il dolore, l'uso di analgesici e altri esiti di interesse, e di valutare l'effetto della somministrazione per via sistemica e periferica sulla ferita chirurgica biochimica. Questa metodologia è stata applicata a donne sane sottoposte a parto cesareo elettivo con anestesia spinale. Abbiamo misurato l'essudato e mediatori di siero a intervalli di tempo stessi punteggi del dolore del paziente e il consumo di analgesici per fino a 48 ore dopo parto cesareo. Usando questa metodologia siamo stati in grado di rilevare vari mediatori biochimici compreso il fattore di crescita nervoso (NGF), prostaglandina E2 (PG-E2) sostanza P, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8,IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFa, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 e MIP-1β. Gli studi che applicano il presente saggio biologico umano ferita chirurgica non hanno trovato correlazioni tra ferita e le concentrazioni sieriche di citochine o il loro tempo a rilascio profilo (J Pain 2008;. 9 (7): 650-7) 1 Abbiamo anche documentato l'utilità della tecnica da identificare. farmaco-mediata cambiamenti nel contenuto della ferita (citochine Anesth Analg 2010; 111:1452-9). 2
Introduction
Dopo una incisione chirurgica, residenti e la migrazione di cellule infiammatorie rilasciano citochine pro-e anti-infiammatori, prostanoidi, neuropeptidi e chemochine che sono importanti per l'avvio e il mantenimento del dolore. 3,4 La capacità di raccogliere marcatori biochimici specifici del sito è fondamentale per determinare il rapporto tra i livelli di siero e della ferita chirurgica, comprendere il complesso rapporto tra rilascio di mediatori e dolore chirurgico, e di essere in grado di valutare l'effetto di entrambi sistemico e somministrazione del farmaco periferica sulla biochimica ferita chirurgica. Gli studi si sono concentrati su misure sistemiche di mediatori biochimici e non sono considerate specifiche del sito di rilascio. 5,6 misurazioni sierici di citochine e chemochine potrebbero non essere riflettente di eventi locali della ferita chirurgica biochimici e solo indicare una risposta globale sistemica al danno chirurgico. Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata e visivo unico di questa metodologia che è stata abetest fa riferimento nel 2008 nel Journal of Pain. 1 L'obiettivo di questo articolo JoVE è di fornire una descrizione univoca e visivamente migliore dei metodi.
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Protocol
1. Protocollo di studio
- Ottenere l'approvazione istituzionale Comitato Etico e il consenso informato scritto.
- Selezionare una popolazione chirurgica appropriata per il comportamento di studio. Questa metodologia è stata applicata solo alle ferite parto cesareo, ma la maggior parte delle ferite chirurgiche sarebbe opportuno.
- Considerare i criteri di inclusione ed esclusione per la partecipazione allo studio. I pazienti e le procedure con alti tassi di infezione della ferita chirurgica non può essere appropriato.
- Standardizzare l'anestesia e la gestione post-operatoria per tutti i pazienti per evitare potenziali fattori confondenti.
2. Nocicettivo e infiammatorie Collezione mediatore biochimico
- Inserire l'interruttore ON-Q PainBuster con ON-Q SilverSoaker (I-Flow, Lake Forest, CA) nello strato sottocutaneo appena prima di ferire la chiusura (strati di tessuto di altri può essere considerato). L'ON-Q Sistema Pain Relief PainBuster eroga in continuo soluzione fisiologica ad una velocità di 2 ml / h. Il vettore può essere pettineinato con o rispetto ai farmaci di interesse come un anestetico locale e non-steroidei anti-infiammatori.
- Incorporano uno standard valvola a tre vie in questo sistema per permettere l'aspirazione di essudato in punti temporali specifici. L'infusione continua impedisce al catetere di coagulazione e migliora l'affidabilità del sistema di produrre campioni di essudato. Se l'aspirazione di essudato è difficile (circa il 5% dei casi), si consideri spingendo delicatamente sopra la ferita, cambiando la posizione del soggetto (ad esempio, il paziente seduto o sdraiato su di loro piatto), usando un normale filo 0,5-1 ml di soluzione fisiologica o di ritiro del catetere 1-2 cm.
- A tempi previsti dal protocollo (ad esempio, 1, 4, 6, 24, e 48 ore dopo il parto cesareo), aspirare e prelevare 1 ml di essudato. Trasferire l'essudato in una tazza di polietilene contenente 30 ml di inibitore di proteinasi. Abbiamo usato Inhibitor Complete proteinasi (Bioscience Roche, Palo Alto, CA) per i nostri scopi.
- Entro 1 ora di collezione, mettere i campioni in ghiaccio e centrifugare a 3000 rpm per 10 min.
- Rimuovere sopranatante siero e ferita e posto in una provetta da microcentrifuga standard e conservare a -20 ° C.
3. Saggio di analisi
- Una volta che tutto l'essudato studio e campioni di siero sono raccolti e memorizzati, scongelare e analizzare i campioni nello stesso momento.
- Abbiamo misurato le citochine e chemochine utilizzando un immunodosaggio multiplex. L'immuno-analisi tecnica di multiplex ci permette di dosaggio numerosi analiti da piccoli (50 pl) campioni di volume. Il multiplex producono risultati comparabili con quelli ottenuti con ELISA. Abbiamo usato il 17-plex Bio-PlexTM sistema (BioRad, Hercduli, CA) per la nostra analisi. Questo test è in grado di misurare il fattore di necrosi tumorale α (TNFa), interferone α (INFα), interleuchina 1β (IL-1β), interleuchina 2 (IL-2), interleuchina 4 (IL-4), interleuchina 5 (IL-5 ), interleuchina 6 (IL-6), interleuchina 7 (IL-7), interleuchina 8 (IL-8), interleuchina (IL-10), interleuchina 12 (IL-12), interleuchina 13 (IL-13), interleuchina 17 (IL-17), fattore stimolante colonie di granulociti (G-CSF), granulociti-macrofagi fattore stimolante le colonie (GM-CSF), monocyte chemoattractant proteina 1 (MCP-1) e proteina macrofagica infiammatoria 1 (MIP-1β). Fattore di crescita dei nervi è stata misurata con NGF DY256 anticorpo aggiungendolo al 17-plex piastra con il Bio-Plex kit ammina accoppiamento.
- Per garantire una buona analisi di qualità, ogni misurazione deve essere effettuata in duplicato. Curve standard per ciascun analita sono generati utilizzando analiti di riferimento forniti dal produttore (a concentrazioni di 0,20, 0,78, 3,13, 12,5, 50, 200, 800, 3200 pg / ml, piùuno standard zero per la soluzione fisiologica). Le curve standard sono inclusi in ogni seduta e concentrazione del campione sono calcolati con Bio-Plex software di gestione.
- La sostanza P e prostaglandina E2 sono stati misurati utilizzando altamente sensibilità kit ELISA. Abbiamo usato Assay Designs, Inc. (Ann Arbor, Michigan) per questa analisi. Effettuare l'analisi in duplicato in base alle specifiche del costruttore.
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Representative Results
Usando questa metodologia siamo stati in grado di rilevare tutti i mediatori biochimici sopra delineati con l'eccezione di IL-5 in essudato e plasma. 1,2 Alcune citochine addizionali non sono stati rilevati nel plasma (IL-4, IL-17, TNFa, INFγ , GM-CSF). 1 L'andamento nel tempo di citochine e chemochine misurati in studi riportati sono stati coerenti, raggiungendo un plateau entro le prime ore che è stato sostenuto per il periodo di osservazione 24 ore .. 1,2 Tuttavia, NGF aumento costante delle 24 ore periodo di raccolta, mentre PGE2 raggiungeva il picco entro 1 ora e quindi in costante calo. 1 risultati particolarmente degni di nota sono notevolmente diminuiti i livelli di IL-10 e di un aumento dei livelli di sostanza P nelle ferite instillato con l'anestetico locale bupivacaina, compatibile con un complessivo pro- infiammatorio del farmaco (Figura 1). 2 In un altro studio abbiamo dimostrato che il consumo di analgesici dopo cesareo dechirurgia livrea era correlata negativamente con l'essudato della ferita IL-6, IL-1 β, e G-CSF concentrazioni (Figura 2) 1.
P Figura 1. L'interleuchina-10 (IL-10) e la sostanza avvolto livelli di essudato livelli (pg / ml) misurati a 1, 3, 5, 7, e 24 ore dopo il parto cesareo. Il gruppo salina normale è indicata in diamanti grigi, e il gruppo bupivacaina è mostrato con quadrati neri. * = Significativamente diversi tra i due gruppi (P <0,005).
Figura 2. Correlazione tra l'interleuchina-6 (pg / ml) e il consumo di morfina nelle prime 24 ore dopo il parto cesareo.
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Discussion
Questo metodo di cui sopra è stato trovato per essere abbastanza sensibile da rilevare biochimici mediatori infiammatori e nocicettivo in essudato. Campionamento a diversi punti temporali ci ha anche permesso di osservare i cambiamenti di questi mediatori nel corso del tempo. 1,2 Non sono a conoscenza di qualsiasi altro test umana ferita chirurgica in grado di misurare il profilo seriale rilascio di mediatori infiammatori e nocicettivi in essudato della ferita chirurgica. Risultati del nostro metodo di raccolta essudato della ferita dal sito di incisione chirurgica è diverso da studi che utilizzano scarichi dall'articolazione dell'anca, 7,8 che suggerisce che il rilascio ferita sottocutanea mediatore può essere diverso da cavità intrarticolari o altro rilascio mediatore biochimico. Inoltre, i risultati ottenuti nelle acque di scarico possono essere confusi da perdita di sangue nella ferita, e pertanto non possono essere diverse da locale rilascio biochimico mediatore.
La scarsa correlazione traferita e livelli sierici dimostra l'importanza di determinare site-specific di rilascio quando si studia ferite chirurgiche. Modifiche locali non può essere riflessa sistemica a causa di molti fattori, tra cui la produzione differenziale sistemica e locale in risposta al trauma chirurgico e lo stress. Anche se abbiamo scelto di misurare una particolare selezione di citochine pro e anti-infiammatorie e chemochine come NGF, SP e PG-E2 essudato dalla ferita cesareo, 1,2 questa metodologia può essere applicata ad altri modelli chirurgici e molti altri mediatori biochimici.
Instillazione ferita chirurgica in anestesia locale è una tecnica comunemente utilizzata per migliorare il dolore post-operatorio. 9 Applicando la metodologia, siamo stati in grado di dimostrare che l'instillazione di anestetico locale in ferite chirurgiche influisce biochimica ferita. 2 Una diminuzione della IL-10 e l'aumento della sostanza P negli essudati della ferita con bupivacaina instillazione suggerisce una interruzione of antinfiammatorio modulazione. Perifericamente somministrati anestetici locali possono quindi influenzare i processi infiammatori, 10,11 che può parzialmente rappresentano anestesia locale indotta condrolisi nei giunti dopo l'intervento 12.
ON-Q Sistema PainBuster Pain Relief è un US Food and Drug Administration (FDA) ha approvato dispositivo dal 1998 che viene utilizzato per la somministrazione di anestetici locali per il sito della ferita chirurgica per ridurre il dolore dopo l'intervento. Instillazione ferita continua utilizzando cateteri questo ed altri non è stata associata con infezione maggiore. 9,13 ON-Q PainBuster con ON-Q SilverSoaker è progettato per infondere farmaci e non per campionare ripetutamente essudato. Anche se non abbiamo avuto infezioni della ferita con questa tecnica, sottolineiamo una tecnica asettica, mentre il campionamento essudato da questo sistema. La modifica proposta da facilitare la campionatura dovrebbe essere riservato a scopo di ricerca e non per la routine clinica uSE. Si consiglia inoltre la durata del catetere rimane in situ essere limitata a 48-72 ore.
Questa tecnica chirurgica bioassay sito offre un buon modello per comprendere la relazione tra mediatori biochimici infiammatori e nocicettivo del dolore post-operatorio. Useremo la metodologia in studi futuri per indagare gli effetti di amministrati localmente non-steroidei anti-infiammatori e oppioidi. La tecnica può anche prestarsi alle indagini esaminare la guarigione delle ferite, infezioni chirurgiche eccessive cicatrici e ferite.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Il lavoro del Dr. Carvalho è stato sostenuto da una borsa di studio presso l'Ufficio di Ricerca sulla salute della Donna e il National Institute of Child Health e lo Sviluppo Umano del National Institutes of Health (5K12 HD043452). Angst Dr ricevuto forniture (On-Q PainBuster Post-Op sistema sollievo dal dolore) e fondi (per i saggi biochimici) da I-Flow (Lake Forest, California).
References
- Carvalho, B., Clark, D. J., Angst, M. S. Local and Systemic Release of Cytokines, Nerve Growth Factor, Prostaglandin E2, and Substance P in Incisional Wounds and Serum Following Cesarean Delivery. J. Pain. 9, 650-657 (2008).
- Carvalho, B., Clark, D. J., Yeomans, D. C., Angst, M. S. Continuous subcutaneous instillation of bupivacaine compared to saline reduces interleukin 10 and increases substance P in surgical wounds after cesarean delivery. Anesth. Analg. 111, 1452-1459 (2010).
- Verri, W. A., Cunha, T. M., Parada, C. A., Poole, S., Cunha, F. Q., Ferreira, S. H. Hypernociceptive role of cytokines and chemokines: targets for analgesic drug development. Pharmacol. Ther. 112, 116-138 (2006).
- Watkins, L. R., Maier, S. F. Immune regulation of central nervous system functions: from sickness responses to pathological pain. J. Intern. Med. 257, 139-155 (2005).
- Beilin, B., Bessler, H., Mayburd, E., Smirnov, G., Dekel, A., Yardeni, I., Shavit, Y. Effects of preemptive analgesia on pain and cytokine production in the postoperative period. Anesthesiology. 98, 151-155 (2003).
- Wu, C. T., Jao, S. W., Borel, C. O., Yeh, C. C., Li, C. Y., Lu, C. H., Wong, C. S. The effect of epidural clonidine on perioperative cytokine response, postoperative pain, and bowel function in patients undergoing colorectal surgery. Anesth. Analg. 99, 502-509 (2004).
- Buvanendran, A., Kroin, J. S., Berger, R. A., Hallab, N. J., Saha, C., Negrescu, C., Moric, M., Caicedo, M. S., Tuman, K. J. Upregulation of prostaglandin E2 and interleukins in the central nervous system and peripheral tissue during and after surgery in humans. Anesthesiology. 104, 403-410 (2006).
- Kristiansson, M., Soop, M., Sundqvist, K. G., Soop, A., Suontaka, A. M., Blomback, M. Local vs. systemic immune and haemostatic response to hip arthroplasty. Eur. J. Anaesthesiol. 15, 260-270 (1998).
- Liu, S. S., Richman, J. M., Thirlby, R. C., Wu, C. L. Efficacy of continuous wound catheters delivering local anesthetic for postoperative analgesia: a quantitative and qualitative systematic review of randomized controlled trials. J. Am. Coll. Surg. 203, 914-932 (2006).
- Eriksson, A. S., Sinclair, R., Cassuto, J., Thomsen, P. Influence of lidocaine on leukocyte function in the surgical wound. Anesthesiology. 77, 74-78 (1992).
- Clark, J. D., Shi, X., Li, X., Qiao, Y., Liang, D., Angst, M. S., Yeomans, D. C. Morphine reduces local cytokine expression and neutrophil infiltration after incision. Mol. Pain. 3, 28 (2007).
- Webb, S. T., Ghosh, S.
- Scott, N. B.
