A Novel Vertebral Stabilisering metode for å produsere Contusive ryggmargsskade

Summary

Ryggvirvel stabilisering er nødvendig for å minimere variasjon, og for å produsere konsekvent eksperimentelle ryggmargsskader. Ved hjelp av en tilpasset stabiliserende apparat i forbindelse med NYU / Mascis støters enhet, har vi vist her riktig utstyr og prosedyre for å generere reproduserbare hemi-contusive livmorhals (C5) ryggmargsskader hos voksne rotter.

Abstract

Klinisk relevante dyre cervical ryggmargsskade (SCI) modeller er avgjørende for å utvikle og teste potensielle behandlinger; Imidlertid produserer pålitelige cervical SCI er vanskelig på grunn av mangel på tilfredsstillende metoder for stabilisering ryggvirvel. Den konvensjonelle metoden for å stabilisere ryggraden er å suspendere rostral og caudal cervicalcolumna via klemmer knyttet til livmorhals spinous prosesser. Imidlertid, denne metode for stabilisering unnlater å forhindre vev givende under -kontusjon som cervikale ryggrads prosesser er for kort til å være effektivt festet ved klemmene (figur 1). Her har vi introdusere en ny metode for fullstendig å stabilisere halsvirvelen på samme nivå av slagskader. Denne metoden effektivt minimerer bevegelse av ryggsøylen på stedet av påvirkning, som i stor grad forbedrer produksjonen av konsistente SCIS. Vi gir visuell beskrivelse av utstyret (Figur 2-4), metodes, og en trinn-for-trinn-protokoll for stabilisering av cervical 5 vertebra (C5) i voksne rotter, for å utføre laminektomi (figur 5), og produsere et contusive SCI etterpå. Selv om vi bare demonstrere en cervical hemi-kontusjon med NYU / Mascis støters enhet, kan dette ryggvirvel stabilisering teknikken brukes på andre områder av ryggmargen, eller tilpasses andre SCI-enheter. Forbedre ryggmarg eksponering og fiksering gjennom vertebral stabilisering kan være verdifulle for å produsere konsekvente og pålitelige skader på ryggmargen. Denne virvelstabiliseringsmetode kan også brukes for stereotaktisk injeksjon av celler og tracere, og for avbilding ved hjelp av to-fotonmikroskopi på forskjellige nevrobiologiske undersøkelser.

Introduction

Konsekvent og replikerbart mekanisk kraft på målet spinal vev er avgjørende for å minimere funksjonell og histologisk variasjon og for å etablere vellykkede contusive ryggmargsskade (SCI) modeller ^1-7. Mengden av kraft som påføres et målområde av ryggmargen er avhengig av de metoder som benyttes for rygg stabilisering. Posisjonsforskyvning av target-ryggraden under kontakt mellom slagstemplet og ryggmargen endrer den resulterende skade kraft. Cervical contusive SCI-modellen er en mer klinisk relevant modell enn andre former for SCI, som omtrent 50% av menneskelige SCI tilfellene oppstår på dette nivået ^8, og flere SCI studier har blitt utført ved hjelp av dyrelivmorhalsskademodeller ^9-14. Selv kontusive SCI modeller ofte bruke noen form for stabilisering ved å klemme den spinal prosesser anterior og posterior til skade området, er dette preparatet vanskelig for å produsere cervical SCI. &# 160; Som vist i denne demonstrasjonen, stabiliseringsmetode utviklet vi er fordelaktig i sin evne til å øke både kvaliteten og reproduserbarheten av -kontusjon skade. Spesielt, ble denne metoden for virvel stabilisering etablert i et forsøk på å endre de mangler og utfordringer med andre modeller: 1) variasjon i virvelgivende under slagkraft kan skje ved fastklemming tilstøtende rygg spinous prosesser rostralt og kaudalt for laminektomi. Graden av vertebral skiftende er avhengig av antallet av vertebrale skjøter mellom virkningen og ryggsøylen blir stabilisert (figur 1). Derfor er flere ledd som er involvert i mindre stabil ryggraden blir; 2) dorsal spinous prosesser er skjøre og forårsake klem svikt som følge av spinous prosessen brudd eller klemmen glir ut av prosessen; og 3) spinous prosesser på disse ryggvirvler er ekstremt kort mellom C3 til T1 ryggvirvlene i forhold til de av thorax vertebrae, noe som gjør det vanskelig å bruke tradisjonelle klemmer å forstå spinous prosesser for å stabilisere nakkesøylen.

Her beskriver vi en ny fremgangsmåte for å stabilisere ryggraden til fremstilling av C5 contusive SCI i voksen Sprague-Dawley-rotter. Denne metoden kan brukes til stabilisering av andre nivåer av virvelsøylen og ryggmargen, og bøyninger godt med andre kontusive SCI-enheter, inkludert New York University / Multisenteret Animal Spinal Cord Injury Study (NYU / Mascis) anslags ¹⁵ (figur 2) , Precision Systems og instrumentering, LLC Infinite Horizon (IH) enhet ^16, Ohio State University / Elektroryggmargsskade Enhet ¹ og Louisville Injury System Apparatus (LISA) ^17, noe som åpner for utstrakt bruk i SCI forskning.

Protocol

1. Eksponering av Cervical Spinal laminae

1. Rengjør kirurgisk overflaten med 70% etanol, forvarmet med en varmepute. Dekk overflaten med en steril kirurgisk drapere før du legger steril kompress, bomullspinner, og autoklaveres kirurgiske verktøy i kirurgi området. Bruk en mikro sterilisator for inter-kirurgi sterilisering av kirurgiske verktøy.
2. Bedøve rotten med ketamin (87,7 mg / kg) / xylazin (12,3 mg / kg) intraperitonealt (IP). Riktig planet av anestesi er nådd når dyret slutter å svare på en tå klype stimulans. Subkutant injisere 0,01 til 0,05 mg / kg Buprenorfin og 5 mg / kg Carprofen før kirurgisk prosedyre. Buprenorfin bør da gis hver 8-12 timer og Carprofen gang daglig, for de første 4-7 dager etter operasjonen.
3. Påfør beskyttende salve til øynene til dyret for å hindre at hornhinnen tørking under operasjonen.
4. Barbere kirurgiske området på ryggoverflaten av rotte fra midten av thorax-regionen til baksiden av hodet med klippere. Fjern barbert pels ved hjelp av en støvsuger utstyrt med et HEPA filter.
5. Påfør Betadine løsning på det barberte området som et kirurgisk skrubb deretter rengjøre området med 70% isopropyl alkohol våtservietter.
6. Bruke et skalpellblad for å utføre en 3-4 cm midtlinje innsnitt i huden fra undersiden av hodet caudally til midten av thorax.
7. Identifisere midtlinjen av fascia og subkutane muskler anterior til i vinter kjertel i nedre hals; skjære gjennom trapezius og andre musklene langs midtlinjen for å redusere blødning.
8. Finne midtlinjen av to regioner av fettvev underliggende muskler; kutte paraspinous muskler caudally strengt langs midtlinjen, og atskilte muskellagene ved hjelp av et lite vev retraktor inntil nivået av thorax T2 spinous prosessen er nådd.
9. Identifisere og kuttet bort muskelen koplet til T2 spinous fremgangsmåte for å utnytte this struktur som en anatomisk landemerke.
10. Fjerne brusk tuppen av T2 spinous prosess for å forbedre synligheten av nakkevirvler.
11. Skill de paraspinal musklene lateralt fra spinous prosesser og lameller av C4-T1; imidlertid spare muskel dekker på C3 lamina å hindre blødninger.
12. Skjær musklene over lameller fra C4-T1 sideveis mot fasetter på begge sider av ryggsøylen.
13. Etter at rygg lameller er eksponert, plasserer dyret på sin ventrale overflate i den U-formede kanal av stabilisatoren.
14. Identifisere C5 vertebra ved å telle spinous prosesser rostrally fra T2 landemerke til T1, C7, C6, og endelig C5.

2. Stabiliserende Vertebrae og Utføre Impact Injury

1. Plasser de to rustfritt stål armer av stabilisator for å suspendere dyret ved å plassere de taggete kantene på armene under Lateral fasetter av C5-6 virvler (figur 1C). Etter å ha sikret armene med ryggvirvler på plass (figur 2B), juster stabiliserende apparat for å sikre virvelsøylen er nivå og sentrert. Til slutt låse armene ved å stramme tommeskruene av stabilisatoren.
2. Skjær leddbånd mellom spinal prosesser og lameller på C4-5 og C5-6 å identifisere margen på C5 lamina.
3. Ved hjelp av en mikro-rongeur, klippet bort halvparten av arket til høyre på C5 som er beregnet for SCI (Figur 5C-E). Etter laminektomi, transportere dyr med stabilisator under skade enheten. Sikre dyret sammen med stabilisator på en mount (figur 3A-C) for å presist justere stempelet på ryggmargen målet ved hjelp av en lateral mikro-manipulator (figur 3).
4. Under høy forstørrelse, finn C5 og C6 dorsal root oppføring soner (DREZs) på den eksponerte dorsal ryggmargen overflate uten durotomy. Sikt stempelet i midten av de to identifiserte DREZs og halvveis mellom midtlinjen og sidekanten av ryggmargen (figur 5B).
5. Ved hjelp av en NYU / Mascis støters enhet med en 2,5 mm diameter (figur 3A & B), produsere en C5 hemi-kontusjon (Figur 5B & E) av en 10 g stang x 12,5 mm høyde dråpe (Figur 2A).
6. Kontroller skaden visuelt ved blåmerker på ryggmargen (figur. 5E, pil) og sjekk skade parametere gitt av NYU programvare ^12,17 (figur 6).
7. Sutur muskler og bløtvev med sterilt 4-0 Vicryl sutur, lukk deretter huden snittet med kirurgiske stifter (EZ Klipp).
8. Påfør antibakteriell sårsalve til operasjonsstedet.
9. Administrere 5,0 ml steril 0,9% saltoppløsning subkutant til dyret for hydrering.
10. Plasserer dyret i en varme-kontrollert miljø (resirkulere varmt vann padcage på en varmepute)) med fuktig mat levert på sengetøy (skiftes daglig), og en vannflaske med en lang tut for enkel tilgang plassert på gulvet av buret. Gi omsorg for å sikre tilstrekkelig bedring før retur dyret til hjemmet buret.
11. Ettersom dette er en ensidig cervical contusive skade, vil dyret trolig miste funksjon av ipsilaterale forbena, forbigående, noe som begynner å komme i løpet av de første ukene etter skade. Imidlertid bør kontralateral funksjon forbli intakt, og dermed dyret skal kunne spise og drikke uten verdifall, og har bare mindre verdifall i bevegelse og grooming.

Representative Results

Ved å følge denne protokollen, er konsekvent og reproduserbar cervical hemi-contusive SCI produsert (figur 5 og 6). Bruken av en ryggvirvel stabilisator for å stabilisere de laterale prosesser av samme vertebra ved nivået beregnet for SCI tillater slike tilfredsstillende resultater. Ved hjelp av denne metoden, er ikke bare målet C5 vertebra, men også tilstøtende C4 og C6 strengt fast.

NYU / Mascis programvare inneholder en skrive ut med en graf satt på en x og y-aksen, og støtter bruk av vår ryggvirvel stabiliseringsmetode, og utstyr (figur 6). Denne fremgangsmåte for stabilisering reduserer skade variasjon som kan følge av den nedadgående forskyvning av målvevet og ryggsøylen (figur 1). Etter skade, et klart ensidig blålig hematom sentrert mellom C5 og C6 DREZs er synlig (figur 5E). Disse skade parametrene er konsistente fra dyr til animal i henhold til avlesning levert av NYU / Mascis programvare (Figur 6).

Som livmorhals hemi-kontusjon gir klare forbena underskudd, er denne modellen ideell for vurdering forbena funksjonsevne som nå, grooming ^13, og objektmanipulasjon ^18-19. Som bakben motoriske mangler er mindre fremtredende, Basso, er Beattie og Bresnahan (BBB) ​​bevegelses scoring skala ⁴ ikke egnet for bruk i denne modellen. Den funksjonelle resultatet etter skade er mest merkbar i ipsilaterale forepaw extensor underskudd, hvor rotta viser en "skamslått" knyttneve med alle sifrene bøyd ^18. Alle dyr som utsettes for den samme skadegrads og nivå i ryggmargen skal fremvise tilsvarende underskudd til ipsilaterale forbena illustrert i denne protokoll, på riktig skade. Dyr feil skadet kan presentere seg med svært forskjellig manifestasjon og varigheten av underskudd ^13,18.

Histologisk produserer denne modellen omfattende grå og hvit substans skade på skade episenteret og rostralt og hale til skadestedet, som fører til betydelig lesjon og hulrom formasjon inneholdt nesten utelukkende innenfor den skadde siden av ryggmargen. En stor, primært astrocyttkulturer baserte glial arr skjemaer ved lesjonskanter med massiv neuronal død ^18.

Figur 1: Illustrasjon av ryggraden fleksibilitet under contusive SCI med forskjellige klemmemetoder. Tallene A og B viser fleksibilitet eller "utbytte" av ryggraden når spinous prosesser klemmes dorsally, noe som åpner for urettmessige virkninger og inkonsistente data. Illustrasjonen vist i A viser mye mer fleksibilitet ved støt (rød stiplet linjeog store buede piler) i forhold til det som er vist i B (mindre buede piler), som klemmene er fjernere fra stedet til laminektomi og skade. Figur C viser lateral stabilisering med vår beskrevet enhet med stabiliseringsarmen ordentlig strammet under tverrgående prosessen med vertebra hvor området av virkningen vil bli utført. Det er ingen fleksibilitet i ryggraden i løpet av denne fremgangsmåten, som vertebra av interesse er fullstendig stabilisert.

Figur 2: NYU / Mascis nedslaget og tilpassede stabilisering container. Figur A viser deler og funksjoner i NYU / Mascis ryggmargsskade enhet, med flere stang høydeinnstillinger for skadegrads (innfelt). Tall B og C illustrerer den U-formede beholder som holderrotte, og de taggete stabiliseringsarmer som sikkert stabilisere ryggsøylen under operasjonen og skade (designet og produsert av YP Zhang).

Figur 3: Custom monteringssystem og lateral microadjuster på NYU / Mascis nedslaget Figur A detaljer de ulike komponentene i tilpassede monteringssystem for U-formet rotte stabilisator for ryggmargsskade.. Legg merke til den laterale microadjuster i figur A, avgjørende for nøyaktig innretting av rotte-ryggmargs for skade. Figurene B og C gir ytterligere avbildning av stabilisatoren uten (B) og med den U-formede rat beholder (C) med hensyn til andre viktige komponenter av skaden anordningen (monteringssystem konstruert og produsert av YP Zhenger).

Fig. 4: Målinger av de enkelte komponenter av den kirurgiske stabiliseringsanordning og vedlegg Hver komponent av den tilpassede stabiliseringssystem er markert for å vise dimensjonene og skala (A, C og D). Thorax stabiliseringsarmer (B) er vist for å vise den potensielle anvendelsen av denne anordning for bruk i forskjellige ryggrads kirurgiske modeller.

Figur 5: Kirurgiske landemerker og forberedelse for livmorhals hemi-kontusjon ryggmargsskade. Tallene A og B skildre de riktige landemerker for riktig IMPAct justering på den eksponerte rotteryggmargen. Den riktige treffpunktet ligger direkte mellom C5 og C6 dorsal nerverøttene (rostrokaudale) og midtlinjen og sidekantene av ryggmargen (B). Figurene CE viser, i større forstørrelse, prosessen med å eksponere den ønskede halve cervical ryggmargen for skade, gjennom forsiktig ensidig laminektomi. Også tall D og E demonstrere ledningen umiddelbart før og etter ryggmargs kontusjon skade. Legg merke til den synlig blødning (E) forårsaket av effekten (svart pil).

Figur 6 :. Eksempler på akseptabel versus uakseptable dataavlesning følgende sammenstøt med NYU / Mascis nedslaget. Den øverste grafen (A) og topp datasett (C) (B) og feiling bunnfeltet under "nullstilling" av støterstangen og spissen inn i ryggmargen overflaten, før innstilling av høyden av støterstangen (C). Oppmerksom på den betydelige feil indisert til initiell høyde og starttid av støters dråpe, som indikert av den røde pilen og understreke. Programvaren gir også en advarsel har blitt oppdaget at feil for disse parametrene (nederst av panel C).

Discussion

Her har vi demonstrert en cervical spine stabilisering metode for å produsere ensidig contusive SCI på C5. Denne stabilisering metoden øker presisjonen av traumer anatomisk og produserer konsistent funksjonelle underskudd ^13,18. I andre modeller som er avhengige av rygg klemming av spinous prosesser, er risikoen for spinous prosessen skader eller avløsning for brak fra vertebra ganske høy. Disse modellene kan også tillate betydelig ryggrad skiftende og man oppnådde fra -kontusjon kraften og den fleksible natur av ryggraden og vertebrale kolonner (figur 1A og B). Vevet givende endrer stempelet-vev kontakttid og resulterer i uforutsigbare skade kraft (figur 1A-B & 6B). Vår beskrevet ryggvirvel stabilisering gir også andre fordeler til det kirurgiske preparatet: 1) denne metoden fullt stabiliserer ryggvirvler sentrert på C5 underkirurgisk mikroskop som øker nøyaktigheten av laminectomies (figur 1C); 2) dyret montert i den U-formede stabiliseringsmiddel kan tas direkte fra det kirurgiske sted til den tilpassede festedelen, som unngår fremgangsmåten for å remontere dyret på SCI-enheter og sparer tid; og 3) å stabilisere ryggsøylen på skadenivå og direkte dorsal og kaudalt for det tilsiktede stedet for skader i stor grad kan redusere kroppens bevegelser forårsaket av respirasjon, et annet tiltak for å redusere variabilitet.

Den primære fordel ved å benytte denne stabiliseringsmetode er den reduserte mengden av ettergivende, eller ventrale bevegelse av ryggmargen og kolonnen ved anslag. Basert på enkel fysikk av en kontusjon skade, vil kraften og energien i sammenstøtet overføre fra stangen til ryggmargen, gjerne med ledningen absorbere denne energien på stedet av virkningen. Men hvis ryggraden gir under ledningen, er mulig somi det dorsale spinous klem metoden (figur 1 A & B), den virkelige kraften påført ledningen er redusert og variabel, avhengig av graden av utbyttet.

Selv om denne videoen illustrerer hele prosedyren av en cervical contusive SCI-modell, er essensen av denne artikkelen innføringen av spinal stabilisering metoden vi bruker i ulike applikasjoner i vår lab, spesielt for SCI studier. En modifisert versjon av denne stabiliseringsanordning og fremgangsmåten har blitt brukt på mus SCI ^23. Denne enkle metode for stabilisering ryggraden er meget nyttig for SCI forskning, og vi har tidligere brukte denne fremgangsmåten og utstyr for å utføre thorax -kontusjon samt laserasjon SCI modeller. En annen lab har nylig beskrevet en variant av denne form for stabilisering for cervical skade i dette tidsskriftet ^22. I sammendraget, introduserer vi denne romanen ryggvirvel stabiliseringsmetode til flere surgical prosedyrer for å generere reproduserbar eksperimentell SCI alt fra laminectomy til produksjon skade. Fordelene ved dette stabiliseringsenheten er ikke begrenset til cervical ryggmargs kontusjon, da dette stabilisering metoden har blitt tilpasset for en rekke eksperimenter som intra-spinal injeksjoner, cellular transplantasjon, CSF samling fra cisterna Magna, hemisection og tran skader, thorax kontusjon skader, in vivo avbildning ansette to-foton mikroskopi, og ryggelektrofysiologisk registrering. Øke kvaliteten på spinal kirurgiske og skade prosedyrer og redusere den eksperimentelle variabilitet vil bidra til å gi innsikt i ekte skademekanismer og utvinning, og undersøke om effekten av ulike behandlingsformer på den ødeleggende lidelse av SCI.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Purdue Products Betadine Surgical Scrub	Fisher Scientific	19-027132
Dukal Gauze Sponges	Fisher Scientific	22-415-490
Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg)	Webster Veterinary	07-881-9413, 07-890-5745
Decon Ethanol 200 Proof	Fisher Scientific	04-355-450
Artificial Tears Eye Ointment	Webster Veterinary	07-870-5261
Antiobiotic Ointment	Webster Veterinary	07-877-0876
Cotton Tipped Applicators	Fisher Scientific	1006015
Rongeur	Fine Science Tools	16000-14
Surigical Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Scissors (blunt dissection)	Fine Science Tools	14040-10
Surgical Retractor	Fine Science Tools	17005-04
Large Forceps	Fine Science Tools	11024-18
Fine Forceps	Fine Science Tools	11223-20
Hemostat	Fine Science Tools	13004-14
Scalpel	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel Blade #15	Fisher Scientific	10015-00
EZ Clips	Fisher Scientific	59027
Sterile sutures	Fine Science Tools	12051-10
Instrument Sterilizer	Fine Science Tools	14040-10
Surgical Stabilizer	Custom Manufactured	N/A	Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com)
Vertebral Stabilization Bars (clawed endfeet)	Custom Manufactured	N/A	Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com)
NYU/MASCIS Impactor Device	Custom Manufactured	W. M. Keck Center for Collaborative Neuroscience Rutgers, The State University of New Jersey e-mail: impactor@biology.rutgers.edu