Summary
الليمونية rodentium العدوى يوفر نموذجا قيما لدراسة الالتهابات البكتيرية المعوية وكذلك استضافة الاستجابات المناعية والتهاب القولون في الفئران. هذا البروتوكول يحدد قياس سلامة الحاجز، تحميل الممرض والأضرار النسيجية السماح للتوصيف دقيق للمساهمات الممرض والمضيف لالتهاب القولون المعدية الفئران.
Abstract
هذا البروتوكول يحدد الخطوات المطلوبة لإنتاج نموذج قوي من الأمراض المعدية والتهاب القولون، وكذلك الطرق المستخدمة لوصف الليمونية العدوى rodentium في الفئران. C. rodentium هو، سلبية الغرام الفئران محددة الممرض البكتيرية التي ترتبط ارتباطا وثيقا الهامة سريريا الإنسان E. ممرض للأمعاء مسببات الأمراض كولاي E. وenterohemorrhagic القولونية. على الإصابة بفيروس C. rodentium والفئران مناعيا يعانون من فقدان الوزن متواضعة وعابرة والإسهال. تشريحيا، ويلاحظ المعوية سرداب استطالة، تسلل خلية المناعة، والقدح استنفاد الخلايا. ويتحقق إزالة العدوى بعد 3 إلى 4 أسابيع. قياس الأمعاء الظهارية سلامة الحاجز، الحمل البكتيري، والأضرار النسيجية في نقاط زمنية مختلفة بعد الإصابة، والسماح للتوصيف سلالات الفئران عرضة للإصابة.
ضراوة آليةS من مسببات الأمراض البكتيرية التي تستعمر الأمعاء من مضيفيهم، وكذلك الردود التي تدافع عن المضيف محددة ضد الالتهابات مثل هذه غير مفهومة تماما. لذا C. نموذج rodentium من العدوى البكتيرية المعوية بمثابة أداة قيمة للمساعدة في فهمنا لهذه العمليات. كما تم البكتيريا المعوية المرتبطة أمراض التهاب الأمعاء (IBDs). فقد تم الافتراض أن الاستجابات الالتهابية المزمنة غير القادرة على التأقلم ينظر في المرضى الذين يعانون IBD تطوير الأفراد عرضة وراثيا في أعقاب التعرض غير طبيعي في نظام المناعة المخاطية المعوية للبكتيريا المعوية. ولذلك، فإن دراسة نماذج من التهاب القولون المعدية يتيح إمكانات كبيرة لتحديد الاستجابات المحتملة المسببة للأمراض المضيفة للبكتيريا المعوية. C. rodentium الناجم عن التهاب القولون هو نموذج واحد نادرة بحيث يسمح لتحليل استجابات المضيف للبكتيريا المعوية، وتعزيز فهمنا للآليات المرضية المحتملة لIBD؛أساسيا في تطوير علاجات وقائية من الرواية والعلاجية.
Introduction
العدوى عن طريق مسببات الأمراض البكتيرية المعوية المعدية المعوية يتسبب (GI) التهاب، وكذلك الأمراض المعوية والفيزيولوجيا المرضية، بما في ذلك الإسهال والأمعاء الظهارية ضعف الجدار. ولا يزال الغموض يكتنف آليات الفوعة من مسببات الأمراض البكتيرية التي استعمار الجهاز الهضمي من مضيفيهم، وكذلك الردود التي تدافع عن المضيف محددة ضد الالتهابات مثل هذه، بدأت التطورات الحديثة في النمذجة ومع ذلك من الالتهابات البكتيرية المعوية لمساعدتنا على فهم هذه العمليات. كما تم البكتيريا المعوية المرتبطة أمراض التهاب الأمعاء (IBDs). مرض كرون في IBDs (CD) وUC هي أمراض معقدة من مرض غير معروف، يتميز التهاب الأمعاء المزمن وتلف الأنسجة. نماذج الماوس العديد من الالتهابات المعوية موجودة، من التهاب عفوية في سلالات معدلة وراثيا، مثل IL10 - / - الفئران، لمواجهة التحديات مع المركبات الكيميائية، مثل كبريتات الصوديوم ديكستران (DSS) ودinitrobenzene حمض السلفونيك (DNBS) 1. فقد تم الافتراض أن الاستجابات الالتهابية المزمنة غير القادرة على التأقلم موجودة في المرضى IBD تطوير الأفراد في وراثيا عرضة عند التعرض غير طبيعي في نظام المناعة المخاطية المعوية للبكتيريا المعوية 2، ولذلك دراسة نماذج من التهاب القولون المعدية كما يقدم إمكانية كبيرة لتحديد المضيف المحتمل المسببة للأمراض . الردود على البكتيريا المعوية التي يسببها التهاب القولون rodentium الليمونية هي واحدة من النماذج النادرة من التهاب القولون المعدية التي تميزت جيدا 1،3، مما يسمح لتحليل استجابات المضيف للبكتيريا المعوية وزيادة فهم الآليات المحتملة من IBD المرضية؛ خطوة أساسية في تطوير علاجات وقائية الرواية والعلاجية.
C. rodentium هو، سلبية الغرام إرفاق الفئران والأضواء (A / E) الممرض محددة البكتيرية التي ترتبط ارتباطا وثيقا البشرية الهامةممرض للأمعاء مسببات الأمراض E. القولونية (EPEC) E. والمعوى كولاي (EHEC) 3-8. عائلة A مسببات الأمراض / E إرفاق ارتباطا وثيقا غشاء الخلية المضيفة القمي من ظهارة الأعور والقولون، وتشكيل غير الغازية مثل هيكل التمثال على الخلية المضيفة. عن طريق الفم مع التحدي C. rodentium من الكائنات الحية 8 9 10 -10 تنتج نموذجا قويا من التهاب القولون المعدية التي تتميز تضخم القولون أو استطالة للالخبايا، وحيدات النوى تسلل خلية المناعة، والقدح استنفاد الخلايا 3،4. الموقع الأولي للاستعمار، بعد ساعات قليلة من التحدي، هو في التصحيح الأعور، يليه التقدم إلى القولون البعيدة 2 إلى 3 أيام بعد الإصابة 3. في سلالات الفئران مناعيا، ويتحقق إزالة مسببات المرض 3 إلى 4 أسابيع بعد الإصابة 1،3،4. ومع ذلك، العديد من سلالات معدلة وراثيا، أي الجينات ناقصة أو خروج المغلوب وقد وجد الفئران، لعرض increa (- / -)الحوار الاقتصادي الاستراتيجي أكثر عرضة للإصابة مما أدى إلى أضرار مبالغ فيها و / أو عدوى مزمنة والتهاب 9-14. استخدام هذا النموذج التهاب القولون المعدية في هذه السلالات خروج المغلوب، وكثير تفتقر الفطرية البروتينات مما يشير، وقد تم الكشف عن البروتينات لا غنى عنها في عدة المضيف جزءا لا يتجزأ من القرار العدوى المعوية والالتهابات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد اللقاح والليمونية rodentium بالتزقيم عن طريق الفم للفئران
- إعداد والأوتوكلاف لوريا Bertani مرق (LB).
- الحصول C. قابلة للحياة rodentium من الأسهم المجمدة والجلسرين متتالية على لوحة LB أجار باستخدام حلقة عقيمة أو تلميح ماصة بتلقيح. احتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل. تطعيم 3 مل من مرق LB العقيمة في أنبوب الصقر مع ثقافة المستعمرات من لوحة LB باستخدام حلقة بتلقيح أو تلميح ماصة. وينبغي أن يتم إعداد اللقاح باستخدام تقنيات العقيم.
- احتضان C. ثقافة rodentium هوائيا في 37 درجة مئوية خلال الليل في الحضانة الفوق شاكر في 200 دورة في الدقيقة. ينبغي للمرق LB تلقيح تظهر بعد غائم الثقافة بين عشية وضحاها.
- يميل استخدام لمبة إبرة بالتزقيم المعدة تعلق على حقنة 1 مل لتسمين كل الماوس مع 100 ميكرولتر من C. بين عشية وضحاها rodentium الثقافة. القفا بلطف الماوس، من خلال استيعاب بشدة الجلد المترهل حول الرقبة والظهرمع الإبهام والأصابع. سحب رأس الحيوان مع السبابة لشل الرأس وتصويب المريء لإدخال الإبرة تسمين.
- الحفاظ على الماوس في وضع رأسي وتوجيه نصيحة لمبة من الإبرة بالتزقيم على طول الجانب من فمه وأكثر من لغتها. تمرير الإبرة بلطف على طول سقف الفم ودفعها إلى أسفل المريء. إذا كان هناك أي مقاومة شعرت خلال هذا الإجراء، وإزالة الإبرة بالتزقيم وإعادة إدراجها.
- حقن ببطء 100 ميكرولتر من اللقاح البكتيري وإزالة الإبرة بلطف تسمين. رصد معدل التنفس وسلوك الماوس بعد إعادته إلى قفصه.
ملاحظات:
- في الخطوات 2 و 3، وإعداد أيضا أنبوب الثقافة الصقر باستخدام تقنيات العقيم مع 3 مل من مرق LB العقيمة بين عشية وضحاها ليكون مثقف لضمان عدم وجود التلوث الجرثومي من مرق نفسه. يجب أن تظهر واضحة مرق LB بعد الثقافة بين عشية وضحاها.
- يجب التخلص من ثقافة بين عشية وضحاها إذا تم تلقيح أكثر من 24 لأنها ساعة.
- جميع C. وينبغي إجراء العدوى rodentium والإسكان في الحيوانات المصابة في منشأة السلامة الأحيائية المستوى 2.
2. قياس نفاذية الجدار القولون الظهارية في C. rodentium الفئران المصابة
- قياس سلامة الحاجز في نقطة الوقت المطلوب بعد العدوى.
- في يوم الفحص، وإعداد ما يكفي من ثيوسيانات فلوريسئين 4 كيلو دالتون (FITC)-ديكستران الذائبة في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى تركيز 80 مل -1 ملغ إلى تسمين كل الماوس مع 150 ميكرولتر وإعداد منحنى القياسية.
- القفا الماوس وبالتزقيم مع 150 ميكرولتر من FITC-ديكستران. سحب الطعام من القفص في هذا الوقت.
- تخدير الفئران بعد 4 ساعاتgavaging وجمع أكبر قدر ممكن من الدم (~ 450 ميكرولتر) من خلال ثقب في القلب. إضافة الدم إلى تركيز النهائي من سكر العنب حامض سيترات 3٪ في أنبوب microcentrifuge لردع التخثر. الموت ببطء الفئران وجمع أنسجة القولون في برنامج تلفزيوني لتحديد أعداد البكتيريا (الخطوات 3،1 حتي 3،5) والفورمالين 10٪ في لتثبيت الأنسجة وتلطيخ في نهاية المطاف المناعي (الخطوات 4،1 حتي 4،8).
- تدور عينات الدم في 1،000 x ج لمدة 12 دقيقة في جهاز للطرد المركزي في C. ° 4 جمع المصل ويخفف إلى 10/1 و 1 100 / في برنامج تلفزيوني. إضافة 100 ميكرولتر من كل عينة في هذه التخفيفات سنتين إلى لوحة 96 بشكل جيد في مكررات.
- لإعداد منحنى القياسية، تخفيف الأصلي 80 ملغ مل -1 FITC-ديكستران تستخدم لتسمين الفئران في برنامج تلفزيوني على التركيزات التالية: 800، 400، 200، 100، 50، 25، 12.5، 6.25، و 0 ميكروغرام / مل . إضافة 100 ميكرولتر من كل تركيز لوحة 96 أيضا في ثلاث نسخ.
- قياس مضان من كل عينة باستخدام مقياس التألق في لWAV الإثارةelength من 485 نانومتر و 535 نانومتر الطول الموجي الانبعاثات.
- تحليل البيانات الخام عن طريق التآمر منحنى القياسية. إدخال البيانات الخام لكل عينة في المعادلة من خط إنشاؤها بواسطة منحنى القياسية لتحديد تركيز FITC-ديكستران في كل عينة.
ملاحظات:
- من فصاعدا 4 الخطوة، والحفاظ على عينات الدم على الجليد وتقليل التعرض للضوء.
- عند قياس سلامة طلائي الحاجز نقطة في الوقت، أو قبل، 7 أيام بعد الإصابة هو الأمثل، وشديدة تلف الأنسجة يحدث بعد هذه المرحلة. قياس سلامة الحاجز قبل قوع أضرار جسيمة يسمح لك لتحديد الاختلافات القصوى في النفاذية خلال C. عدوى rodentium بين سلالات الفئران.
- ضمان أن يتم اختبار السيطرة على الفئران غير المصابة أيضا لسلامة حاجز الظهارية.
3. قياس الحمل البكتيري في أنسجة C. rodentium الفئران المصابة
- إضافة 1 مل العقيمة PBS علىالثانية أدنى من المعادن تعقيمها حبة إلى الدور 2 مل أنبوب الطرد المركزي باستخدام تقنية العقيم. سيتم وضع الأنسجة الفردية التي تم جمعها من كل حيوان في أنابيب PBS منفصلة. وزن الأنابيب قبل إضافة الأنسجة.
- إزالة الأعور والقولون من الماوس. فصل من الأعور والقولون وطرد محتويات اللمعية باستخدام ملقط. إضافة إلى محتويات أنبوب PBS. بعد فصل الأقسام 0.5 سم من القولون الأعور عن القاصي وتثبيت الفورمالين 10٪، وخفض فتح القولون الأعور المتبقية وطوليا ويغسل مع PBS معقمة قبل وضعها في أنابيب الأنسجة.
- وزن الأنابيب PBS مع الأنسجة ومن ثم التجانس العينات باستخدام الخافق حبة لمدة 6 دقائق عند 30 هرتز.
- باستخدام تقنيات العقيم، اضافة 180 ميكرولتر PBS معقمة لكل بئر لوحة 96 أيضا. إضافة 20 ميكرولتر من كل عينة متجانسة إلى البئر الأولى في كل صف. تخلط جيدا وتخفيف متسلسل، مضيفا 20 ميكرولتر من كل جانب السابقة للحصول على التخفيفات من 10 -1 (أولا نحنليرة لبنانية) ل10 -6. لوحة 10 ميكرولتر من كل عينة من كل تخفيف من ثلاث نسخ على لوحة أسفل LB مربع مع شبكة. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- عد الوحدات مستعمرة تشكيل (CFU)، ثم التهم متوسط 3، وسجل في التخفيف الذي كان يحسب كل عينة. مضاعفة متوسط CFU بنسبة 50، كما تم استخدام 20 ميكرولتر من العينة الأصلية 1 مل، وعامل التخفيف الذي كان يحسب العينة مما أدى إلى CFU / مل. وأخيرا، القسمة على وزن الأنسجة لتحديد CFU / ز.
4. تقييم النسيجية وتلوين المناعي للأنسجة المصابة القولون
- جمع الأنسجة كما في الخطوة 3.2. بين عشية وضحاها في الأنسجة متجر الفورمالين، ثم تغسل مع الايثانول 70٪. تضمين الأنسجة في البارافين وقطع 5 أقسام ميكرومتر لتلطيخ. وصمة عار مع الهيماتوكسيلين ويوزين لتقييم النسيجية، والشروع في الخطوات التالية لتلطيخ المناعي.
- لdeparaffinize الأنسجة قبل تلطيخ، مكان الشرائح فيجرة تلطيخ coplin وضعها في حمام مائي 65 ° C لمدة 10 دقيقة. المقبل، والشرائح مكان في الزيلين لمدة أربعة يغسل من 2 دقيقة لكل منهما. وينبغي بعد ذلك أن الشرائح ميهت مع يغسل 5 دقائق بالسيارة اثنين في الإيثانول بنسبة 100٪، تليها واحدة 5 دقائق يغسل في كل مما يلي: الإيثانول 95٪، والإيثانول 75٪ و2 0 درهم. وينبغي أن يتم في هذه يغسل غطاء الدخان لتجنب التعرض لأبخرة ضارة.
- الشرائح مكان في جرة مع coplin قبل تحسنت الصوديوم سترات عازلة ومن ثم إلى مكان باخرة لمدة 30 دقيقة، ثم ترك الجلوس لمدة 30 دقيقة. هذه العملية يكسر البروتين عبر وصلات التثبيت الفورمالين التي شكلتها استرداد مواقع مستضدي المحتملة.
- يغسل مع أزيد PBS لمدة 5 دقائق، ثلاث مرات. الشرائح الجافة ومنطقة في جميع أنحاء الأنسجة علامة بالقلم PAP لخلق حاجز مسعور، والحفاظ على الكواشف تلطيخ مترجمة على الأنسجة.
- كتلة الأنسجة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع العازلة حظر (مثل α-الماعز المصل) في غرفة الرطوبة المناعية.
- تمييع متزمتARY الأجسام المضادة لتركيز المطلوب باستخدام الأجسام المضادة العازلة التخفيف. صب قبالة حجب العازلة وإضافة 50-100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية إلى الأنسجة. احتضان عند 4 ° C أو بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
- يغسل مع أزيد PBS لمدة 5 دقائق، ثلاث مرات. إضافة 50-100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية مخففة في التخفيف العازلة الأجسام المضادة إلى الأنسجة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في الظلام. يغسل مع DH 2 O لمدة 5 دقائق، ثلاث مرات.
- يذوى الشرائح، إضافة دابي إطالة المتوسطة الذهب المتزايدة وتطبيق ساترة. عرض الشرائح تحت المجهر مضان.
ملاحظات:
- يمكن أن تكون بديلا PBS أزيد مع PBS الطازجة كبديل لتجنب نمو البكتيريا في غسل المتوسطة من 4 الخطوة فصاعدا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
خلال التجربة العدوى القياسية، يصاب ما يقرب من الفئران مع 2.5 × 8 10 CFU من خلال أنبوب تغذية في C. 100 ميكرولتر بين عشية وضحاها rodentium الثقافة. إصابة الفئران C57BL / 6 مع C. النتائج rodentium في فقدان الوزن متواضعة وعابرة والإسهال. على الرغم من أن نادر الحدوث مع C57BL / الفئران 6، قد تصبح الحيوانات السيئة وتتطلب euthanization. ولذلك، ينبغي مراقبة الفئران لدرجة فقدان الوزن وأعراض الشدة مثل الفراء piloerect والتقوس في الجلوس، لتحديد إلى أي مدى تتأثر سلالات مختلفة من العدوى.
النتائج المقدمة في أرقام من 1 إلى 4 من ممثل عدوى يتم ذلك باستخدام ثقافة بين عشية وضحاها أعدت من الأسهم المجمدة الجلسرين. في 7 أيام بعد الإصابة، وكانت الفئران تخدير وجمعت الدم من خلال ثقب في القلب. ويظهر الشكل 1-FITC ديكستران قياس في المصلمن C57BL / 6 الفئران، وكذلك من حصيلة مثل مستقبلات الفئران خروج المغلوب 2 (TLR2)، والتي سبق لها أن وجدت لعرض ضعاف سلامة حاجز الظهارية خلال العدوى 9. في وجود حاجز الظهارية في الأمعاء سليمة، 4 كيلو دالتون FITC-ديكستران هو نفاذية سيئة من خلال هذه الطبقة. لذلك، زيادة مستويات FITC-ديكستران في مصل الدم تشير إلى انخفاض قيمة الأمعاء الظهارية سلامة الحاجز خلال العدوى السماح لتسرب هذا الجزيء عبر. كعنصر تحكم، وتعرض أيضا مستويات مصل الفئران غير المصابة في gavaged مع FITC-ديكستران.
من أسبوع واحد بعد الإصابة، تم العثور على كميات البكتيريا في القولون الى ذروتها حوالي 10 CFU 3،4 / ز 9. ويمكن قياس الأحمال البكتيرية في الوقت المطلوب نقاط العدوى عدوى آخر لتأكيد، وكذلك لتقييم ما إذا الفئران خروج المغلوب مختلفة تعاني من أعباء البكتيرية زيادة أو نقصان. كما C. rodentium هو الممرض اللمعية التي يمكن ADH وثيقاويمكن قياس يحرث إلى الخلايا الظهارية في الأمعاء، والأحمال البكتيرية في محتويات اللمعية، الأعور، والأنسجة القولون. ويبين الشكل 2 الأحمال البكتيرية نموذجي في قياس يوم 7 بعد الإصابة الأنسجة الأعور والقولون وكذلك داخل تجويف الأمعاء من C57BL / 6 الفئران.
لاحظ معظم الأمراض أثناء C. العدوى في الفئران C57BL rodentium / 6 يحدث في سم 2 القاصي من colon11. Macroscopically بنسبة 7 يوم العدوى آخر، لوحظ سماكة الغشاء المخاطي للقولون وكذلك تقصير في طول القولون، مع القليل من الضرر العلني ينظر في C57BL / الفئران 6. عادة خلال العدوى، C57BL / 6 الفئران تعاني التهاب فقط المعتدل وعلم الأمراض تتميز تشريحيا من تسلل خلية المناعة، واستطالة من الخبايا القولون والقدح نضوب الخلية (الشكل 3).
كما رأينا في المقاطع H & E في الشكل 3، هي التي شنت العديد من ردود المضيف الدرجي الإصابة بفيروس C. rodentium. لمزيد من تميز هذه التغييرات، يمكن أن تستخدم تلطيخ المناعي لدراسة التغيرات في البروتينات ذات الاهتمام، مثل علامات الانتشار، موت الخلايا، أو الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية. تلطيخ المناعي هو أيضا قيمة في دراسة جوانب الاستجابة البكتيرية، مثل التوطين داخل الأنسجة المصابة. مثال على هذه التقنية تلطيخ، ودراسة مجموعة ki67 البروتين (الحمراء)، وعلامة للحصول على تكاثر الخلايا وعلى C. rodentium البروتين النقل البري الدولي، أخضر، لدراسة توطين البكتيرية في اليوم 12 ويرد ما بعد الإصابة في الشكل 4.
الشكل 1. وقياس مصل FITC-ديكستران لتقييم سلامة طلائي الحاجز. الفئرانgavaged مع 4 كيلو دالتون FITC-ديكستران في ظل ظروف غير مصاب وآخر 7 أيام في العدوى، وبعد ذلك تم تحديد المصل FITC-ديكستران المستويات. C57BL / 6 (WT) الفئران تبدي زيادة ضئيلة في مستويات مصل FITC-ديكستران في 7 أيام بعد الإصابة مقارنة مع الظروف غير مصاب. في المقابل، TLR2 - زادت بشكل ملحوظ الفئران مستويات FTIC-ديكستران في مصل الدم بالمقارنة مع خط الأساس مما يشير سلامة حاجز ضعف شديد في هذه السلالة خلال C. - / عدوى rodentium، كما سبق هو مبين.
الشكل 2. C. تم جمع حمولة rodentium في التجويف، الأعور، والقولون من C57BL المصابة / 6 الفئران في 7 أيام بعد الإصابة. التجويف، الأعور، والأنسجة القولون، المتجانس، ومطلي في التخفيف-المسلسل علي أجار LB. كل جircle تمثل عينة واحدة جمعها من الحيوانات الفردية. خطوط الصلبة تشير إلى المتوسط الهندسي في حين تشير أشرطة الخطأ الرأسي SEM.
الشكل 3. تحليل النسيجي الأضرار الناجمة عن C. ويلاحظ مقارنة العدوى rodentium. بواسطة 7 أيام بعد الإصابة معتدلة تسلل الخلايا المناعية، وكذلك استطالة الخبايا، والقدح استنفاد الخلايا ذمة خفيفة للسيطرة على الأنسجة غير المصابة. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 4. المناعي على تلطيخ غير مصاب والعدوى يوم 12 بعداتسخت الأنسجة نشوئها من الفئران C57BL / 6. الأنسجة القولون البعيدة للبروتين المضيف ki67 (الحمراء) وعلى C. rodentium البروتين النقل البري الدولي (الخضراء).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الليمونية rodentium العدوى يوفر نموذجا قيما لدراسة كل الأمراض المعدية والتهاب القولون في الفئران. هذا النموذج الفريد يسمح لتوصيف كل من الاستجابات المضيفة، فضلا عن الخصائص المسببة للأمراض من البكتيريا. حدد الخطوات في هذا التفصيل بروتوكول نجاح استخدام هذا النموذج.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول أن نأخذ في الاعتبار عند حمل التهاب القولون وتحليل الاستجابات. أولا، إعداد C. بين عشية وضحاها جديدة مطلوب rodentium اللقاح في مرق LB للعدوى النجاح في الفئران. كما هو مطلوب جرعة من 10 -10 9 8 الحية لتصيب معظم سلالات من الفئران، إذا تم ترك اللقاح في شاكر أو على رأس مقعد في درجة حرارة الغرفة لفترات طويلة، لن يكون هناك ما يكفي من الكائنات قابلة للحياة الباقية في الثقافة للحث على التهاب القولون على العدوى. من المهم أيضا أن يثير انزعاج اللقاح البكتيري قبلتحميل حقنة للعدوى، لضمان أن كل يتلقى جرعة الماوس على قدم المساواة من البكتيريا. عند جمع الأنسجة عند محطة للعدوى، واستكمال غمر للأنسجة القولون في وحدة تخزين وافرة من 10٪ الفورمالين المطلوبة لتثبيت الأنسجة المناسبة لتحدث. يقترح أن تضاف إلى أنسجة الفورمالين في قارورة 5 مل، بدلا من أنابيب microcentrifuge في كنسبة من المستحسن 10:01 مثبت للأنسجة. تثبيت السليمة أساسية لتحليل النسيجي في وقت لاحق، فضلا عن تلطيخ المناعي من هذه الأنسجة. من المهم أيضا أن نأخذ في الاعتبار أن سلالات مختلفة خروج المغلوب سوف متفاوتة ردود على تحريض C. rodentium التهاب القولون. عندما تصيب سلالة جديدة لأول مرة، ينبغي مراقبتها عن كثب الفئران لتحديد نقطة النهاية إنسانية للتجربة، إذا لزم الأمر. ويمكن تعريف نقطة الوقت لتحليل سلامة حاجز الظهارية، والأحمال البكتيرية، والأنسجة يعتمد على استجابة الماوسسلالة من الفائدة للعدوى.
كما الطلاء من على لوحات الخليط الأنسجة لتحديد الأحمال LB البكتريا ليست طريقة انتقائية تماما، وأداء PCR لC. ويمكن أن يتم rodentium جين معين على المستعمرات البكتيرية للتمييز C. rodentium من bacterialcolonies أخرى على اللوحة. وثمة خيار آخر هو لوحة الخليط الأنسجة على أجار ماكونكي، وهذه الوسيلة هي أكثر انتقائية لC. rodentium من أجار LB. نهج بديل هو استخدام الستربتومايسين مقاومة من النوع البري C. سوف rodentium instead.Substitution سلالة مع الستربتوميسين سلالة مقاومة يؤدي إلى تحريض نفس النموذج التهاب القولون المبينة في هذا البروتوكول. الفائدة من استخدام سلالة مقاومة الستربتوميسين هو لتسهيل تحليل الأحمال البكتيرية، كما يمكن مطلي الخليط الأنسجة من هذه العدوى على أجار LB تستكمل مع الستربتوميسين بدلا من أجار LB وحدها. هذا يتجنب النمو المحتمل للبالاتصالاتensal الميكروبات على لوحة، مما يجعل عملية العد CFU أسهل وأكثر دقة. وثمة بديل آخر في حين قياس الأحمال البكتيرية، هو احتضان لوحات تصفيح بعد التخفيفات من الخليط على الأنسجة أجار في LB إما 37 ° C أو بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 أيام، مما أدى إلى تباطؤ النمو البكتيري، قبل الفرز.
هذا البروتوكول يحدد الخطوات المطلوبة لإنتاج نموذج قوي من التهاب القولون المعدية، فضلا عن الأساليب المستخدمة لوصف C. عدوى rodentium في الفئران. وبصرف النظر عن استخدام هذا النموذج لدراسة العوامل المسببة للأمراض في استضافة التفاعلات والاستجابات المناعية، فإنه يمكن أيضا أن تستخدم لدراسة كيفية عدوى بكتيرية يمكن أن تزيد من خطر الإصابة بسرطان القولون. ويمكن أن يتم ذلك عن طريق تعريض C. إصابة الفئران rodentium إلى azoxymethane مسرطنة، أو من خلال دراسة كيفية تأثير الإصابة على تكاثر الخلايا الظهارية، أو على الجينات المسؤولة عن تمايز الخلايا الظهارية أو ورم التنمية 15. لناجي النموذج التهاب القولون المعدية الواردة في هذا البروتوكول، يمكن أيضا أعداد البكتيريا أن يقسم على مواقع خارج المعوية، مثل الغدد الليمفاوية المساريقي والطحال والكبد. قد أعلى الأرقام في هذه الأجهزة تشير إلى أن سلالة الفأر يجري اختبارها هي عرضة للعدوى. باستخدام تقنية تلوين المناعي وصف، يمكن استكشاف عدد لا نهاية لها تقريبا من آليات استجابة للعدوى. مرة واحدة مألوفة مع تقنيات بالتفصيل هنا، يمكن تعديل البروتوكول لجمع الأنسجة لقياس نقاط النهاية الأخرى، مثل لاستخراج الحمض النووي الريبي وتقييم مستويات التعبير الجيني، لأكثر شمولا تميز الردود على C. rodentium العدوى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة التشغيل لBAV من كرون والتهاب القولون مؤسسة كندا (CCFC) والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR). وقد تم تمويل GB من قبل منحة دراسية عليا من CIHR. BAV هو الأطفال الذين يعانون من الاضطرابات المعوية والكبد (الطفل) رئيس مؤسسة البحوث IBD الأطفال وكرسي أبحاث أمراض الجهاز الهضمي للأطفال في كندا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | ABM | G247 | Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using. |
| Square bottom plate with grid | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon culture tube | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Bulb tipped gastric gavage needle | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | FD-4 | |
| Citric acid | Sigma | C7129 | |
| Sodium citrate | Fisher | S279-500 | |
| Dextrose | Fisher | D16.1 | |
| Acid citrate dextrose | 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose | ||
| Black 96-well plate | Fisher | 07-200-762 | |
| Metal beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 10% formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml vial | DiaMed | STK3205 | |
| Hematoxylin | Fisher | H345-23 | |
| Eosin | Fisher | E511-100 | |
| Xylene | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin staining jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodium citrate buffer | 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0 | ||
| Pap pen | Cedarlane | Mu22 | |
| Goat serum | Sigma | G902-3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodium azide | Sigma | SZ002 | |
| Blocking buffer | 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C. | ||
| Antibody dilution buffer | 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA | ||
| Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir | Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20) | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Coverslips | Fisher | 12.54SE | |
| Benchtop incubation shaker | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorometer | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Steamer | Black Decker | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 |
References
- Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).
- Cario, E. Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later. Inflammatory Bowel Diseases. 16 (9), 1583-1597 (2010).
- Eckmann, L. Animal Models of Inflammatory Bowel Disease. Annals New York Academy of Sciences. , 1027-38 (2006).
- Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).
- Luperchio, S., Schauer, D. Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia. Microbes and Infection. 3 (4), 333-340 (2001).
- Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance. Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).
- MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. Host defences to Citrobacter rodentium. International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).
- Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice. Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).
- Dennis, A., Kudo, T., et al. The p50 subunit of NF-κB is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 76 (11), 4978-4988 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).
- Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium. Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).
- Bry, L., Brenner, M. B. Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen. Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).
- Simmons, C. P., Clare, S., et al. Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).
- Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection. Infection & Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).
