Bedömning av magtömning i icke-feta diabetiska möss Använda en [ Published: March 23, 2013 doi: 10.3791/50301

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Christopher T. Creedon¹, Pieter-Jan Verhulst¹, Kyoung M. Choi¹, Jessica E. Mason¹, David R. Linden¹, Joseph H. Szurszewski¹, Simon J. Gibbons¹, Gianrico Farrugia¹

¹Enteric Neuroscience Program, Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic

Summary

Fastställande av magsäckstömning med en icke-invasiv [

Abstract

Magtömning studier på möss har begränsats av oförmågan att följa magtömning förändringar i samma djur eftersom de vanligaste teknikerna kräver dödande av djur och döden återvinning av måltiden ^1,2. Detta tillvägagångssätt förhindrar longitudinella studier för att bestämma förändringar i gastrisk tömning med ålder och progression av sjukdomen. Den vanligaste ^[13 C]-oktansyra utandningstest för människor ³ har ändrats för att användas i möss ^4-6 och råttor ⁷ och vi tidigare visat att detta test är pålitlig och lyhörd för förändringar i gastrisk tömning som svar på droger och under diabetisk sjukdomsprogression ^8. I denna video presenteras principen och det praktiska genomförandet av denna modifierade test förklaras. Liksom i den tidigare studien är NOD LTJ-möss används en modell av typ 1-diabetes ^9. En del av dessa möss utvecklar symtomen på gastropares, en komplikation av diabetes kännetecknas av fördröjd magsäckstömning utan mekanisk obstruktion av magen ^10.

Detta dokument visar hur man tränar mössen för testning, hur du förbereder testmåltid och få 4 tim magtömning data och hur att analysera erhållna data. Den kolisotop analysatorn som används i föreliggande studie är lämplig för automatisk provtagning av luftprover från upp till 12 möss samtidigt. Denna teknik möjliggör den längsgående uppföljning av gastrisk tömning från större grupper av möss med diabetes eller andra långvariga sjukdomar.

Introduction

Detta manuskript beskriver de tekniska och metodologiska överväganden är inblandade i icke-invasiv mätning av magsäckstömning hos möss. Genom att följa det protokoll som beskrivs här, kan utredarna tillförlitligt och reproducerbart följa förändringar i gastrisk tömning på grund av utvecklingen av sjukdomen, studera effekterna av farmakologiska medel på magtömning och följa svar magsäckstömning för behandling av underliggande sjukdom eller defekter ^{6,8, 11,12.} I tidigare publikationer, oktansyra utandningsprov tillämpningen av ¹³ C visade sig vara ett användbart sätt att mäta magtömning hos människor och djur ^3,8. Detta dokument beskriver i detalj de förfaranden som krävs för att få tillförlitliga data över 6 till 8 månader krävs för en longitudinell studie av gastrisk tömning hos möss med diabetes. Fördelarna med att följa detta protokoll jämfört med tidigare publicerade metoder är att utredaren kan vara säker data obtained kommer att vara pålitlig och reproducerbar. Dessutom, beskrivs det automatiserade systemet för insamling och analys gasproverna här ökar antalet djur som kan följas samtidigt i en studie. Sammantaget är målet för denna uppsats att identifiera de viktigaste faktorerna som upprätthåller tillvänjning av mössen på prov och som minskar variabiliteten i resultaten.

För in vivo mätning av ventrikeltömning, möss fastade över natten och sätta i den genomskinliga plasten testning kammare med konstant luftflöde. Efter att mössen blir vana vid rören, utandad baslinjen ¹³ CO ₂ nivåer bestäms och luftflöde anpassas därefter. Därefter administrera vi en testmåltid bestående av äggula blandades med ¹³ C-märkt oktansyra. Eftersom mössen fastat och utbildade, de äter i allmänhet testmåltid inom 2 minuter. Den administrerade oktansyra absorberas inte i magsäcken, men kommer att tas upp i tolvfingertarmen ettd kommer att få metaboliseras i levern till ¹³ CO _2, som frigörs och utandas, vilket resulterar i en anrikning av ¹³ CO ₂ i den omgivande luften. Luftprover uppsamlas vid bestämda tidsintervall och analyseras av kolisotop analysatorn. Det hastighetsbegränsande steget i hela denna process är magtömning och pulmonell utsöndringen av ¹³ CO ₂ direkt motsvarar gastrisk tömning av märkta måltiden.

Figur 1. Schematisk av magtömning apparat. Efter fasta över natten, möss placerade i genomskinliga kammare ger dem möjlighet att flytta och rotera fritt. Ett inloppsrör ger frisk och konstant luft inflöde och ett utlopp leder till isotop analysatorn för att mäta ^{13 C-till-12}C-förhållande i utandningsluften. Kammaren har också en central öppning för leverans av livsmedel innehållande ^[13 C]-oktansyra.

Protocol

1. Utbildning och Tillvänjning av möss

1. Före analys, lägga alla möss i tester kammare för 2-4 timmar med konstant luftflöde för att vänja dem till testförhållanden. Detta minskar markant stress som annars kan orsaka avvikande detektering av fördröjd magtömning. Behandla mössen på samma sätt som om den magtömning experimentet kördes. Förbered äggula (se vidare) utan tillsats oktansyra och mata 0,2 g till varje mus.
2. Upprepa denna process tills mössen är tillräckligt utbildade (vanligtvis 2-3 gånger). Mössen typiskt lätt vänjer så länge miljöförhållandena hålls lika.

Obs: Icke-tillvänjda möss fortsätter att flytta runt i ca 1 timme efter överföring till kammaren, och bajsa och kissa ofta, medan tillvänjda möss snabbt bosätta sig i sin nya miljö och vila lugnt.

Nejte: Under experimentet: Övervaka djur tecken på förlust av tillvänjning som överskott urinering, defekation, brist på intresse för att äta ägget. Om så är fallet anser åter tillvänjning i en tom kammare 1-2 gånger innan man erhållit magtömning data. Konsekvens är oerhört viktigt när du gör detta experiment. Att göra saker på exakt samma sätt varje gång är det enda sättet att få tillförlitliga och reproducerbara resultat. Detta inkluderar att ge behandling (t.ex. insulin) varje dag vid samma tidpunkt, inte separera mössen från deras bur-kamrater inte är absolut nödvändigt, fasta mössen och starta magtömning testet samtidigt och hantering mössen på samma sätt.

2. Beredning av Isotope innehållande testmåltid

1. Börja med väga upp 5 g äggula i en 50 ml Falcon-rör. Upprepa dessa steg varje experimentell dag att förbereda en ny testmåltid.
2. Tillsätt 10 pl oktansyra med en concentrring av 2 pl / g till 50 ml Falcon-rör innehållande ägget och blanda kraftigt under 1 min med en spatel i Falcon-rör.
3. Ägget överförs sedan till en glasbägare och upphettades över en bunsenbrännare tills det koagulerar och dess konsistens är lämplig för att göra små bollar. Detta tar typiskt ca 30 sek.

Obs: bollar av äggula ska väga 0,2 g per mus. Detta är viktigt att hålla den kumulativa dosen konstant i alla möss.

3. Starta experimentet

1. När utbildade och redo för magtömning, snabb mössen natten (12 timmar) på en metall "mesh-botten" fasta rack för att förhindra koprofagi. Se till att de har fri tillgång till dricksvatten. Eftersom diabetiska möss används i den aktuella experimentet bör de inte fasta under mer än 16 timmar.
2. Börja med att sätta upp de magtömning kamrarna. Använd rena kammare och lock som har lufttorkas. Dessutom, allarör som förbinder kamrarna till analysatorn eller CO ₂ lufttillförseln ska vara fuktfri, vatten kan störa signalen läses av analysatorn
3. Anslut kamrarna till inloppsrören som ger ett konstant luftflöde. Sedan ansluter utloppsrören från kamrarna till maskinen. Stäng rören och slå på luftflödet.

Obs: Applicera en mycket liten mängd vaselin i slutet av locket lock så att de stänger lätt och säkert förseglade. Denna tät förslutning är nödvändigt att samla in all koldioxid som produceras av mössen.

4. Experimentella procedurer

1. Börja genom att väga varje mus. Kroppsvikt är ett mått på deras fortsatta god hälsa. Placera sedan varje mus i lämplig kammaren. Det är naturligtvis viktigt att ha den luft som strömmar in i kamrarna vid denna tidpunkt.
2. För att starta mätningen låta mössen anpassa sig till kamrarna innan justeringING luften nivåerna.
3. När mössen verkar lugn, vilket kan ta några minuter, justera flöde för varje mus kammare. Detta kan vara olika för varje mus. Typiskt luftflödet justeras i början av experimentet att se till att utandad koldioxid ₂ når nivåer detekterbara genom vilken utrustning som används och se till att nivån förblir tillräckligt låg för att säkerställa en sund luft omsättning. Vi använder initiala CO ₂ nivåer mellan 1.000 och 1.500 ppm.
4. Om har problem med justeringar, kontrollera luftläckage. Sedan upprepa processen för varje kammare och titta på en annan runda av mätningar för att se om justeringar av luftflödet har korrigerat CO _2-nivå. Det är viktigt att erhålla en stabil baslinje läsning före inmatning mössen. Vi använder en maskin med en självkalibrering funktion. Om så inte är fallet Kalibreringen skall kontrolleras.
5. När detta uppnås, administrera ägget måltidentill den första musen och registrerar tiden varje mus erhåller maten.
6. Vi kör förfarandet för 4 timmar för att erhålla tillräckligt värden för montering av ¹³ CO ₂ anrikning kurva för varje mus. Kontrollera om mössen var 30-60 minut för att säkerställa att CO ₂ nivåerna fortfarande säker för mössen.
7. Förbered nya boxar som innehåller mat före slutet av testet så att mössen kan börja äta direkt efter testet är över.

Representative Results

Ett representativt uppgifter som från tre olika möss visas i figur 2. Den svarta kurvan representerar datapunkter från en mus med normal magtömning. Den visar fraktionen av ¹³ C som återvinns i utandningsluften uttryckt som en procentandel av den administrerade dosen per timme uttryckt som en funktion av tiden. Den blå kurvan är från en mus med en accelererad gastrisk tömning med en T halv värde av 40 min och den röda kurvan är från en mus med en fördröjd gastrisk tömning med en T halv värde av 168 minuter. Som fastställs i en tidigare studie i vårt labb ^7, den normala mag halv tömning tid för en icke-diabetisk NOD-musen ålder 9-15 veckor varierar från 62 till 131 minuter som representeras av den grå rutan. Datapunkterna sedan monteras av en icke-linjär regression kurva med följande ekvation ^8:

y = at ^{B E-ct}

Där y är den procentuella andelen av 1/2)

beräknas från en numerisk integration med användning av en invers gamma funktion. Vi har erhållit resultat från flera tusen studier med en biologisk inom mus variation på ca 10%.

Figur 2. Representativa magtömning data från tre olika möss med normal (svart kurva), Fördröjd (röd kurva) och accelererad (blå kurva) magtömning. Den grå rutan belyser normala värden. Ekvationen av de icke-linjär regression kurvor visas i rutan.

Discussion

Den beskrivna tekniken medger häri för upprepad och icke-invasiv in vivo-mätning av fast magsäckstömning hos möss. Detta system har fördelen att djuren inte hålls fast i mätkammaren, så att de flytta och rotera fritt. Eftersom detta är en obekant miljö, mössen fortfarande behöver utbildas och vana vid de tester kammare för att förhindra effekterna av stress på magtömningen. I allmänhet antar vi magtömning data är tillförlitlig om intra-mus variabilitet mellan konsekutiva magtömning tester är mindre än 10%.

Denna rapport är en mer detaljerad beskrivning av våra tidigare rapporter om magtömning mätningar i möss ^8,11,12 och innehåller ytterligare information om felsökning problem med systemet. Den huvudsakliga ändringen är användningen av LGR isotopen analysator för mätning gas nivåer. Analysatorn vi används i föreliggande studie mäter ¹² CO 13 CO _2, och H ₂ O koncentrationen varje sekund. De datorstyrda ventiler i multiple-input enheten automatiskt flöde till detektorn mellan mus kammare var 25 sekund. Därför 12 möss kan samtidigt analyseras med en 5 min intervall mellan mätningarna. Det bör noteras att uppgifterna även kan erhållas genom manuell provtagning av utandningsluften och efterföljande analys. Om manuellt provtagning eller med en annan enhet, se avläsningar erhålls ca 10 minuters intervall. Känsligheten hos vårt system och frekvensen för provtagning innebär att magtömning kurvorna är mer tillförlitliga, lättare att montera och så har vi funnit att vi får mer reproducerbara data med denna förbättrade metod.

De stora fallgropar att denna teknik uppstår när mössen misslyckas med att äta måltiden inom den tilldelade tiden, när mössen förlorar sin tillvänjning till kammaren och när tekniska problem uppstår med detekteringen system. Underlåtenhet att äta måltiden och förlust av tillvänjning är oftast en följd av att inte följa det kritiska steget för att ha ett regelbundet schema för testning. Efter 3 konsekutiva tester åtskilda av 7 dagar eller mindre, blir våra möss vana vid testet och äta måltiden. När vana, tillförlitliga uppgifter erhålls om mössen testas minst en gång var 2 veckor för resten av experimentet. Om av någon anledning mössen inte har testats för 3 eller flera veckor sedan två utbildningstillfällen inom en vecka kommer vanligtvis att säkerställa tillvänjning. Om den personal som hanterar djuren förändras då omskolning av mössen rekommenderas och det är särskilt viktigt att motverka användningen av starkt doftande tvålar och / eller parfymer av folket hanterar mössen. Svårigheter med att upptäcka systemet ofta på grund av de låga ¹³ CO ₂ som genereras av ett litet djur som en mus. Detektorn måste kalibreras och för vissa detektorer, såsom infraröda system, är det mycket important att minska vattenförbrukningen i provet till ett minimum innan mätningar.

Det finns några begränsningar på denna teknik inte utredaren önskar studera magtömning oftare än en gång var 3 dagar i samma mus. Det är inte tillrådligt att snabbt musen så ofta och så dietrestriktioner regelbundet kan förändra mag funktion. Modifieringar tekniken kan göras för att mäta vätska magtömning och det är en användbar potentiell tillämpning av metoden.

Andra metoder för att mäta ventrikeltömning, inklusive scintigrafi eller mätning behöll innehåll efter en bestämd tid har betydligt fler begränsningar, inklusive problem med stress av processen eller på grund av behovet att döda djuret vid slutet av varje prov. Stressfaktorer inkluderar sondmatning av testet måltid eller återhållsamhet av djuret under mätningen. Fördelarna med utandningstest är att musen fritt rör och inte bedövadeseller lugnande på något sätt.

Sammanfattningsvis, medger ¹³ C-oktansyra utandningstest studiet av sjukdomsprogression med ålder och behandling och dessa data kan därefter korreleras med förändringar i andra fysiologiska parametrar och histologisk utvärdering i samma djur. Bland andra tillämpningar, gör testet också studera hur läkemedel kan direkt ändra magtömningen samt undersöka behandlingssvaret hos djur som utvecklar förändringar i gastrisk tömning på grund av sjukdom eller andra insatser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A source of constant air-supply, flow as well as composition	central air supply in the research facility
130 ml sampling chamber that has air inlet, air outlet, and food administration opening Plastic tubes for air supply	In-house built
Octanoic acid	Cambridge isotope laboratories (Andover, MA)	CLM-293-1
To prepare the egg meal: small beaker 50 ml plastic tube Bunsen burner egg spatula	Any supplier		Try to be consistent with the egg supplier since the nutritional content and palatability of the eggs can affect ingestion and gastric emptying of the meal
Carbon dioxide isotope analyzer	Los Gatos Research Inc. (Mountain View, CA)