Summary
Моноциты, макрофаги важны клетки врожденной иммунной системы. Здесь мы описываем простой в использовании
Abstract
Моноциты, макрофаги представляют собой важный тип клеток врожденной иммунной системы. Мышь моделей изучения биологии макрофагов страдают от фенотипических и функциональных различий между мышиных и человеческих моноцитов макрофагов. Поэтому мы опишем здесь в пробирке модель для создания и изучения первичных человеческих макрофагах. Вкратце, после центрифугирования в градиенте плотности периферической крови, взятой из вены предплечья, моноцитов, выделенных из периферической крови мононуклеарных клеток с использованием отрицательных магнитных гранул изоляции. Эти моноциты затем культивировали в течение шести дней при определенных условиях вызывать различные типы дифференциации макрофагов или поляризации. Эта модель проста в использовании и позволяет обойти проблемы, вызванные видоспецифической различий между мышью и человеком. Кроме того, он ближе к в естественных условиях, чем при использовании иммортализованных клеточных линий. В заключение отметим, что модель, описанная здесь подходит для изучения macrophagэлектронной биологии, выявление механизмов болезни и новые терапевтические мишени. Даже если не полностью заменить эксперименты с животными или тканями человека получили посмертно, модель, описанная здесь позволяет идентификации и проверки механизмов болезни и терапевтических целей, которые могут быть весьма актуальны для различных заболеваний человека.
Introduction
Моноциты, макрофаги являются важным клеточным компонентом врожденной иммунной системы и способствует многих острых или хронических воспалительных процессов 1. Макрофаги играют важную роль во многих воспалительных заболеваний, как атеросклероз или рака 2. Макрофаги показывают высокую степень пластичности и смогут взять на себя различные фенотипы в зависимости от местных микроокружения 3. Таким образом, изучение дифференциации макрофагов и неоднородность имеет важное значение для увеличения наших знаний о патофизиологии многих заболеваний и позволить идентификации новых терапевтических мишеней и развитие новых методов лечения.
Во многих случаях, мышиных моделях используются для изучения патофизиологии конкретных болезней. Однако, изучая биологию макрофагов с помощью мыши модели сопровождается рядом недостатков: (1) доля лейкоцитов номера подмножество (т.е. моноциты и гранулоциты) в peripHeral крови мышей или людей существенно отличается предлагая различные роли моноцитов в мышиных и человеческих патофизиологии. (2) Есть существенные различия в экспрессии генов между мышиных и человеческих моноцитов периферической крови свидетельствует о наличии существенного различия в их функции во время здоровье и болезни 4. (3) количество маркеров, которые используются для выявления мышиных моноцитов и макрофагов (F4/80, Lyc и т.д.). Не существует в миелоидных клетках человека, что делает передачу результатов на мышах с человеческой ситуации довольно трудно.
Таким образом, для того, чтобы улучшить наше понимание дифференциации макрофагов и неоднородности в болезнях человека, нам необходимо использовать модели работы с человеческой макрофагов. Таким образом, мы здесь описывать модель человеческого первичный поколение макрофагов, которое легко в использовании и позволяет изучение человеческих моноцитов макрофагов в пробирке в различных условиях, что приводит к различным макрофаг роПоляризация типов. В нескольких исследованиях мы использовали в пробирке модель моноцитарных первичных человеческих макрофагах проанализировать биологии макрофагов и его потенциальное отношение к развитию атеросклероза у человека 5-7.
Даже если не полностью заменить эксперименты с животными или тканями человека получили посмертно, модель, описанная здесь позволяет идентификации и проверки механизмов болезни и терапевтических целей, которые могут быть весьма актуальны для различных заболеваний человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Протокол
- Подготовка буферов следующим образом:
- Подготовить буфер для Выделение РВМС: «промывочного буфера" = 0,02% ЭДТА в PBS (использование 0,5 М ЭДТА).
- Подготовка буфера для моноцитов изоляции: "MACS промывки буфером" = 0,5% БСА (250 мг) и 2 мМ ЭДТА (200 мкл) + PBS (50 мл). Дега буфера.
- Подготовка буфера FACS-окрашивание и хранения клеток: "FACS буфера" = 10% FCS в PBS и "фиксации буфера" = 1% PFA в PBS.
- Ничья 30 мл цельной крови из вены предплечья. Используйте ЭДТА в качестве антикоагулянта.
- Изолят РВМС (Histopaque) следующим образом:
- Приготовьте два стерильные 50 мл пробирки (без полистирола).
- Развести крови из стадии 2, с PBS 1:1.
- Добавить 25 мл Histopaque + 25 мл цельной крови / PBS на пробирку. Убедитесь, что Histopaque и кровь не смешиваются.
- Центрифугируют при 400 х г в течение 30 мин при комнатной температуре, ни тормоза.
- Аспирируйте плазмы и выбросьте.
- Аспирируйте непрозрачные интерфейс и пипеткой в чистую ванну 50 млé.
- Добавить 20 мл 0,02% EDTA в PBS.
- Центрифугируют при 250 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
- Удалите супернатант.
- Добавить 10 мл 0,02% ЭДТА в PBS.
- Граф клеток следующим образом:
- Хорошо перемешать путем встряхивания в течение 10 сек.
- Возьмите 200 мкл суспензии клеток + 300 мкл 0,02% ЭДТА в PBS + 500 мкл трипанового синего (200-500 клеток/10 квадратов, в противном случае изменить коэффициент разбавления).
- Выполнение отрицательного изоляции моноцитов следующим образом:
- Центрифуга клетки, полученной на стадии 3,10 в течение 10 мин, 120 г х. Удалите супернатант.
- Мытье осадок клеток 2x путем добавления 10 мл PBS + 0,02% ЭДТА и центрифугировали в течение 10 мин, 120 г х.
- Добавить 9 мл стерильной воды в течение 3 сек, добавить 1 мл PBS 10X.
- Вымойте еще раз с PBS + 0,02% ЭДТА и центрифуги 10 мин, 120 х г.
- Граф во время центрифугирования.
- Развести в EasySep буфера при 5 х 10 7 / мл.
- Добавить 50 мкл / мл моноцитов петух обогащенияхвост.
- Инкубируют в течение 10 мин при 4 ° С.
- Vortex бисера в течение 30 сек.
- Добавить 50 мкл / мл бисером.
- Инкубировать в течение 5 мин при 4 ° C.
- Залейте буфера EasySep завершить объемом 2,5 мл. Решение появится коричневатый.
- Положить в магнит.
- Подождите 2,5 мин при комнатной температуре. За это время не-моноциты связанного с магнитным шарик будет двигаться к стенке трубы и придерживаться там.
- Налейте буфер с необязательными моноцитов в свежем стерильную пробирку. Это решение выглядит беловатые.
- Промывают один раз PBS + 0,02% ЭДТА и центрифуги в течение 10 мин, 120 х г.
- Пластина клеток в пластиковую чашку или многослойный пластины при плотности 0,5 × 10 6 / см 2. Добавить 1 мл культуральной среды / 1 х 10 6 клеток.
- Культуры клеток в условиях, представляющих интерес для 6-14 дней.
- Изменение среды через 3 дня заменив 50% СМИ свежей средой (см. таблицу 1 для деталей).
- После шести дней урожай клеток для выделения мРНК, проточной цитометрии, вестерн-блоттинга и др.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя протокол, описанный выше, мы регулярно получать 25,1 х 10 6 ± 2,2 х 10 6 monocytes/100 мл крови (среднее ± стандартная ошибка из 26 независимых экспериментов, рис. 1А). Моноциты чистоты, как определено с помощью проточной цитометрии окрашивание на CD14 является обычно более 95% (97,1 ± 0,4%, среднее ± стандартная ошибка из 3 независимых экспериментов, фиг.1В). Жизнеспособность клеток свежевыделенным моноциты, как это определено путем окрашивания трипановым синим является обычно более 95% (данные не показаны). Хотя первоначально клетки имеют круглую форму, и плавать, они обычно начинают придерживаться в течение нескольких часов. Соблюдение связано с изменением формы к "жареным яйцом" или шпинделя-образную форму (рис. 2). После шести дней в культуре с M-CSF (100 нг / мл) с добавлением или без добавления окисленного LDL (100 мкг / мл в течение последних 24 часов), примерно 80% клеток не подвергается OxLDL жизнеспособны, в то время как третерпимостью и лечением с OxLDL привели около 70% жизнеспособных клеток (рис. 3). Проточной цитометрии после шести дней культуры с M-CSF показывает, что в то время как клетки продолжает высказывать лейкоцитов CD45RO маркером, они снижают их количество моноцитов маркером CD14 (рис. 4). Особые условия могут вызвать поляризацию макрофагами - таким образом, M1-M2-или поляризованного макрофаги выражают типичные маркеры, как IL-6, TNF-альфа (M1) или CD36 и CD206 (M2) (рис. 5). Макрофаги могут быть дополнительно изучены в функциональном экспериментов. Например, поглощение окисленного LDL могут быть изучены с помощью флуоресцентной метки LDL (рис. 6).
Рисунок 1. (А) Число моноцитов периферической получены после отрицательного шарик изоляции. Сотовые номера нормализацииг на 100 мл периферической крови. Данные из 26 независимых экспериментов. (B) Чистоту моноциты, полученные с использованием отрицательного шарик изоляции, как определено с помощью проточной цитометрии. Представитель вперед участок разброс стороны и гистограмма CD14 окрашивание, отрицательный контроль показан в виде пунктирной линии.
Рисунок 2. Клетки культуры после 3 и 6 дней с M-CSF. Шкала бар = 50 мкм.
Рисунок 3. Жизнеспособность макрофагами после 6 дней в культуре с M-CSF или после 6 дней в культуре с M-CSF и OxLDL (100 мкг / мл) в течение последних 24 часов, как это определено пропидий йодида (PI) окрашивание. Представитель передней стороне подкожноAtter участков и гистограммы для окрашивания PI.
Рисунок 4. Проточная цитометрия для моноцитов маркером CD14 на моноцитах свежевыделенным или моноцитов макрофагов после шести дней в культуре с M-CSF (100 нг / мл).
Рисунок 5. Генной экспрессии IL-6, TNF-альфа, CD36 и CD206 (рецептора маннозы) в первичных человеческих макрофагов дифференцированы с M-CSF (100 нг / мл, 6 дней) и поляризованная в направлении M1 фенотип (LPS, 100 нг / мл и IFN-гамма, 20 нг / мл, в течение последних 18 часов) или M2 (IL-4, 20 нг / мл в течение последних 18 ч). генной экспрессииизмеряется количественной ПЦР. * Р <0,05, ** P <0,01.
Рисунок 6. (A) иммунофлуоресценции изображение M-CSF-индуцированной макрофагов макрофагов человека. Клетки подвергали воздействию 10 мкг / мл DiI меченных OxLDL течение 4 часов. Ядра окрашивали DAPI. Шкала бар = 50 мкм. (B) представитель гистограмма проточной цитометрии измерения DiI-OxLDL поглощения M-CSF-индуцированных человеческих макрофагах. Серый = необработанного контроля, черная линия = OxLDL обработанного макрофагами.
| Тип | Условия | Работах |
| M0 |
| 7-8 | M1 |
| 8 |
| 9-10 | |
| 9 | |
| 10 | |
| 10 | |
| М2а |
| 9-10 |
| 8 | |
| 10 | |
| 8 | |
| M2b |
| 8 |
| М2с |
| 10 |
| M4 |
| 7 |
| M-HB |
| 11 |
| M-бык | 12 | |
| Другие типы макрофагов |
| 13 |
Таблица 1. Пример для типичных условий и маркеры установленных М1 или М2 типа макрофагов поляризации (см. ссылки на конкретные процедуры изоляции или условиях культуры клеток).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Моноциты, макрофаги представляют собой ключевой типа клеток врожденной иммунной системы. Они играют важную роль во многих воспалительных заболеваний, включая атеросклероз или рака 2. Таким образом, изучение биологии макрофагов имеет важное значение для увеличения наших знаний о патофизиологии многих заболеваний и, чтобы позволить разработку новых методов лечения.
Многие исследования применяются моделей мыши сверхэкспрессирующей или отсутствие определенных генов, представляющих интерес. В случае моноцитов макрофагов, это, кажется, не самый лучший способ для изучения процессов, имеющих отношение к человеку заболевание как имеются существенные различия между мышиных и человеческих моноцитов и моноцитов клетки 4. Таким образом, действительный модели с использованием первичных человеческих клетках кажется хорошей альтернативой для изучения болезни соответствующие механизмы дифференцировки макрофагов.
Явное преимущество в пробирке модель, представленная здесь в том, что она не опирается на immortaliZed клеточных линий, как ТНР-1 или других 14-15. В то время как клеточные линии могут быть легко получены и обойти необходимость регулярного забора крови, клеточные линии фенотипически и функционально не идентичны первичной клетки. Таким образом, Чо и соавт. Сравнили геном подписи первичных человеческих макрофагах и сравнили их с ранее опубликованными данными, полученными из ТНР-1 12,14. Они обнаружили значительное, но умеренная корреляция между обоими типами клеток предполагая, что клетки ТНР-1 не может быть идеальной моделью для изучения дифференциации макрофагов и неоднородность во многих случаях. Кроме того, есть различные модели, как отличить неадгезивные моноцитов, как клетки ТНР-1 к макрофагов. Даже при использовании вероятно, наиболее применим протокол, в котором ТНР-1 клетки обрабатывают PMA следуют пять дней отдыхал в культуру без PMA (PMAr), клетки не полностью ведут себя как первичные элементы 16. Взятые вместе, эти результаты показывают, что для изучения человеческих болезнеймеханизмы на клеточном уровне, первичные макрофаги, кажется более подходящим, чем клеточных линиях.
Человек должен знать о других методах, которые позволяют изоляции первичных моноцитов человека: соблюдение пластик, положительные шарик изоляции, или против Отмучиванием центрифугирования потока 17. Коктейль обогащение моноцитами, используемые здесь, содержит антитела против CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123, гликофорина и покрытым декстраном магнитных частиц. Эти антитела связываются с эпитопами на лейкоцитах, кроме моноцитов, которые могут впоследствии связывается магнитные частицы и удерживаются в трубке под действием магнитного поля, а все несвязанные моноцитов могут быть переданы во вторую трубу. Кроме того, обогащение коктейль содержит антитела к Fc-рецепторы человека (который экспрессируется на высоком уровне в моноцитах), которые предотвращают неспецифического связывания с моноцитами. Соответственно, метод, представленный здесь дает "нетронутой" неактивированных моноцитов с высокой степенью чистоты.
Есть некоторые моменты, которые необходимо иметь в виду при применении этой модели. Ficoll / Histopaque центрифугирования должны быть выполнены при комнатной температуре. ЭДТА в промывочный буфер ясек, необходимой для ингибирования интегрин-зависимое связывание тромбоцитов с моноцитами. Важно, чтобы семена моноцитов в нужное плотности для того, чтобы достичь оптимальной дифференциации. Оба посева моноциты слишком свободно или слишком плотно к нерациональному результаты роста и дифференцировки. Опции для изменения включают посева клеток на специфические субстраты или с использованием различных факторов роста (например, GM-CSF, 18) или добавление специфических активаторов клеток (например, цитокины или LPS 8, Таблица 1).
Использование клеток, полученных из различных индивидуумов может привести к более высокой степени изменения, касающиеся конкретных клеточных функций. Таким образом, Martin-Фуэнтес и соавт. Показали, что моноциты-макрофаги от разных людей отображают различные возможности ЛНП 19. Интересно, что эти различия остаются стабильными в течение долгого времени предполагая, что различия между клетками от различных доноров неиз-за различных экспериментальных условиях, а скорее отражают индивидуальные генетические или эпигенетические различия. С одной стороны, это более значительное отклонение требует больших количествах для получения значимых результатов с помощью специальных экспериментов, как OxLDL поглощения. Напротив, эти различия также позволить исследователям изучить различия между здоровыми и больными лицами на клеточном уровне, обнаруживая тем самым механизмы романа заболевания.
В общем, протокол, описанный здесь, является простым в использовании, воспроизводимый и полезным для получения сверхчистой моноцитов населения, которые могут быть затем дифференцировались в макрофагах. В зависимости от условий культивирования, различные типы моноцитов макрофаги могут быть изучены, позволяющие идентифицировать конкретных физиологических и патофизиологических процессах, имеющих отношение к болезни человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не должны раскрывать конфликт интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Надин Wambsganss за отличную техническую помощь. Эта работа была поддержана грантом Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1), а частично за счет гранта из инновационного фонда границы (Гейдельбергский университет), чтобы CAG
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml centrifuge tube (sterile) | Fisher | 055398 | |
| D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 14190-250 | |
| EDTA | Sigma | T9285 | |
| BSA | Sigma | A-8806 | |
| FCS | Invitrogen | ||
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| FACS tubes | Fisher | 352008 | |
| Macrophage-SFM (1X) | Invitrogen | 12065-074 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | |
| human M-CSF 10 μg | Peprotech | 300-25 | |
| Cell Culture Plates 6-well | Fisher | 07-200-80 |
References
- Gordon, S., Taylor, P. R.
- Gordon, S., Mantovani, A. Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes. European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M.
- Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
- Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).
- Gleissner, C. A., et al. CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages. Circ. Res. , (2009).
- Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages. J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).
- Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
- Verreck, F. A. W., et al. Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
- Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. PLoS One. 7, e42656 (2012).
- Boyle, J. J., et al. Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype. American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).
- Cho, H. J., et al. Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation. Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).
- Vogt, G., Nathan, C. In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).
- Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus. Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).
- Qin, Z. Y. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5, e8668 (2010).
- Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Martín-Fuentes, P., et al. Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response. The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).
