Summary
Infrarød nerve stimulering har vært foreslått som et alternativ til elektrisk stimulering i en rekke nerve typer, inkludert de som er forbundet med det auditive system. Denne protokollen beskriver en patch klemme metode for å studere mekanismen av infrarød nerve stimulering i en kultur av primære auditive nevroner.
Abstract
Det har blitt demonstrert i de senere år at pulset, infrarød laser lys kan benyttes for å avstedkomme elektriske responser i nervevev, uavhengig av en ytterligere modifikasjon av målvevet. Infrarød nevrale stimulering har blitt rapportert i en rekke perifere og sensorisk nevrale vev in vivo, med spesiell interesse vist i stimulering av nerveceller i hørselsnerven. Men mens INS har vist seg å arbeide i disse innstillinger, er mekanismen (eller mekanismer) av infrarødt lys som forårsaker eksitasjon nevrale for tiden ikke fullt ut forstått. Protokollen presenteres her beskriver en hel celle patch clamp metode utviklet for å lette etterforskningen av infrarød nervestimulering i dyrkede primære auditive nevroner. Ved grundig å karakterisere responsen til disse cellene overfor infrarød laser belysning in vitro under kontrollerte forhold, kan det være mulig å oppnå en forbedret forståelse av den grunnleggende Physical og biokjemiske prosesser underliggende infrarød nevrale stimulering.
Introduction
Områdene nevrofysiologi og medisinsk bionics avhengige av teknikker som tillater kontrollerbar stimulering av elektriske reaksjoner i nervevev. Mens elektrisk stimulering forblir den gull-standarden i nevral magnetisering, lider det en rekke ulemper som nærvær av stimulering gjenstander ved opptak av nevrale responser, og en mangel på stimulering spesifisitet på grunn av spredning av strøm inn i en omkringliggende vev.
De to siste tiårene har sett utviklingen av optisk medierte stimulering teknikker to. Flere av disse teknikker krever modifikasjon av målvevet, enten ved tilsetning av en bestemt molekyl (f.eks bur molekyler) 3 eller en eller annen form av genetisk manipulering (f.eks optogenetics) 4, verken som er lett å påføre utvendig av et forsknings-innstilling. Av spesiell interesse er derfor infrarød nervestimulering (INS), whereby nevrale vev er begeistret av pulset infrarødt laserlys. INS har potensial til å overvinne mange av svakhetene ved elektrisk stimulering ved at svært spesifikke, ikke-kontakt stimulering av nervevev to. Men mens INS har blitt vist i en rekke innstillinger i vivo, forblir den nøyaktige mekanismen for eksitasjon usikker.
Noen nyere publikasjoner har vist fremgang mot å avdekke mekanismen bak INS 5-7. Rask oppvarming på grunn av absorpsjon av laserlys ved vannet ser ut til å spille en nøkkelrolle. Men utover dette en konsensus er ennå ikke nådd. Shapiro et al. Syv foreslå en meget generell mekanisme hvorved hurtig oppvarming fører til en forstyrrelse i fordelingen av ladede partikler som grenser til cellemembranen, som fører til en endring i kapasitansen til cellemembranen og påfølgende depolarisering. I tillegg Albert et al. Fem hevde at laser indusert oppvarming aktiverer en spesifikk klasse av temperatursensitive ionekanaler (forbigående reseptor potensielle vanilloid kanaler), som tillater ioner å passere gjennom cellemembranen. På dette stadiet er det uklart hvordan disse mekanismene kombinere, eller faktisk om det er flere faktorer som ennå ikke er identifisert.
Selv om et lite antall publikasjoner (referanser 5,7-9) har undersøkt INS in vitro, har det store flertallet av arbeid publisert på dette feltet er utført in vivo (f.eks referanser 1,6,10-18). Infrarød stimulering av auditive nevroner har vært et område av spesiell interesse, på grunn av de potensielle anvendelser i cochlea implantat 10,14-18. Selv om in vivo-eksperimenter er det viktig å verifisere effektiviteten av teknikken i forskjellige innstillinger, det økte nivå av kontroll gis av in vitro-studier er ventet å føre til en mer detaljert forståelse av mekkraftig svingmekanisme ansvarlig for INS. Denne rapporten beskriver utarbeidelse av dyrkede spiral ganglion nevroner for patch clamp undersøkelser, da disse kan brukes til å studere grunnleggende mekanismer samtidig knytte til den store kroppen av eksisterende data fra det auditive system.
Plasteret klemme teknikken er et utmerket verktøy for undersøkelser av elektrofysiologiske fenomener, gir et middel for opptak elektrisk aktivitet i enkeltceller og studere bidraget fra de enkelte underliggende strømninger 19. Når denne teknikken er brukt på et stabilt in vitro utarbeidelse av primære nevroner, som for eksempel dyrkede spiral ganglion nevroner, og tilbyr muligheten til å studere i dybden de mekanismer som nevrale aktiviteten er kontrollert og manipulert.
Protokollene er spesifisert i dette arbeidet skissere metoder for å undersøke effekten av laser stimulering på de elektriske egenskapene til spiral ganglion nevroner gjennom patch clampinnspillinger. Fremgangsmåten er basert på en fiber-koplet laser i stedet for en fri-plass laser, slik at sikrere drift, så vel som enklere og mer repeterbar innretting uten behov for modifisering av standardmaskin mikroskop-konfigurasjon. På grunnlag av disse protokollene, bør det være mulig å gjennomføre en rekke eksperimenter for å klarere bestemme mekanismen eller mekanismene bak INS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Culture of Spiral Ganglion Nerveceller
- Sterilisere små runde (f.eks 10 mm diameter) glass Dekkglass og buet tang i en autoklav. Overfør steriliserte Dekkglass i individuelle brønner på en steril 4-ring 35 mm petriskål eller 4-brønners plate, ved hjelp av sterilisert pinsett. Påfør 150 pl av poly-L-ornitin (500 ug / ml) og laminin mus (0,01 mg / ml) til den øvre overflate av dekkglass og plasser i en inkubator (37 ° C) i opptil 48 timer. Påse at Dekkglass ikke flyte bort fra bunnen av brønnen.
- Forbered 50 ml sterile Neurobasal medier (NBM) for hver nevrale kultur: 47,5 ml Neurobasal A, 0,5 ml N 2 supplement, 1 ml B27 supplement, 0,5 ml L-glutamin, og 0,5 ml penicillin-streptomycin. Bemerk: kosttilskudd kan bli frosset, lagret ved -20 ° C og tilsatt til mediet på den dag nødvendig.
- Distansere spiral ganglion nevroner fra post-natal dag 4-7 rotteunger som tidligere beskrevet 20,21, ossing både enzymatisk (0,025% trypsin og 0,001% DNase I) og mekaniske teknikker. Referere til Whitlon et al. 22 og Vieira et al. 23. for detaljerte prosedyrer for spiral ganglion neuron kultur, eller Parker et al. 24. for en demonstrasjon av modiolus isolasjon.
- Sug eventuelle gjenværende poly-L-ornithine/laminin løsning fra Dekkglass og vask kort med NBM.
- Legg 150-200 pl av den dissosierte spiral ganglion neuron suspensjonen til dekkglass og fyll i en inkubator (37 ° C, 10% CO2). Merk: opptil 20 Dekkglass kan tilberedes fra et gjennomsnitt kull på åtte rotteunger.
- Fire timer etter plating nevroner, suge løsningen for å fjerne celle rusk og erstatte med 150-200 ul varmet frisk NBM. Merk: media kan kreve daglig påfyll for å unngå dehydrering.
- Returner Dekkglass til inkubatoren før det er nødvendig for elektrofysiologiske opptak. Merk: dissociated spiralganglion neuron kulturer kan anvendes for elektrofysiologiske eksperimenter, fire timer etter dissosiasjon og for inntil to dager deretter. Tid in vitro bør tas hensyn til ved analyse av resultatene. Etterfyll NBM hver 24-48 hr.
2. Forberedelse til Patch Clamp Recordings
- Forbered løsninger
- Intracellulær (micropipette) løsning: 115 mm K-gluconate, 7 mM KCl, 10 mMHEPES, 0,05 mM EGTA, 2 mM Na 2 ATP, 2 mM MgATP, 0,5 mM Na 2 GTP (juster til pH 7,3 med KOH, justere til 295 mOsmol / kg med sukrose). Sende oppløsningen gjennom et sterilt filter (0,2 um) og deler seg i 200 pl aliquoter blir lagret ved -20 ° C inntil dagen for opptaket.
- Ekstracellulær (bad) løsning: 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 10 mMHEPES, 10 mM glukose (juster til pH 7,4 med NaOH, justere til 300-310 mOsmol / kg med sukrose) . Denne oppløsning fremstilles ved opptak.
- Forbered opptak mikropipetter med en motstand på 2-6 MΩ. Vi bruker en CO 2-laser avtrekker (P-2000, Sutter Instruments) og borsilikatglass (1,0 mm ytre diameter, 0,58 mm indre diameter, 75 mm lengde).
- Klargjør laser. Denne protokollen er beregnet for bruk med en fiber-kombinert laser, slik som 1870 nm Infrarød Nerve Stimulator fra OptoTech P / L. Den optiske fiber som brukes for lys levering i våre eksperimenter er en 200/220 mikrometer kjerne / isolasjon diameter silica fiber med en numerisk apertur på 0,22 og FC-PC-kontakter i begge ender (AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C -0,22). De patch ledninger ble kuttet i to for å produsere to fiber musefletter (dvs. connectorized i den ene enden og spaltes i den andre). Effektene av fiber kjernediameter og numerisk apertur på laser induserte temperaturendringer er diskutert i detalj av Thompson et al. 25.
- Kløve spissen av lys levering fiber ved bruk av standardteknikkerog sikre at den resulterende spissen er av høy kvalitet ved observasjon med et optisk mikroskop (dvs. tuppen være vinkelrett på fiber-aksen og vises flate ved visuell inspeksjon). Koble lys levering fiber til fiber-koblet utgangen fra laser stimulering ved hjelp av en passende gjennom kontakt (f.eks Thorlabs ADAFC2).
- Måle utgangen laser strøm fra kløyvde spissen av lys levering fiber ved hjelp av et egnet instrument (f.eks Samstemt Fieldmate med LM-3 detektoren hodet). Det anbefales å sjekke laser makt hver gang lyset levering fiber er kløyvde eller en betydelig justering er gjort til laser (f.eks transport fra en lab til en annen).
- Sett lys levering fiber inn i en fiber chuck eller tilsvarende enhet og påføre chuck til riktig micropositioner. Det er viktig å være i stand til å nøyaktig bestemme vinkelen θ at den optiske fiber gjør med dekkglasset. Dette ANGLe kan måles ved å ta et fotografi av det eksperimentelle arrangement og ved hjelp av bildebehandling (f.eks ImageJ) for å oppnå den vinkel. Vinkelen θ (eller rekke mulige vinkler) er primært begrenset av romlige begrensninger av det eksperimentelle arrangement - i særdeleshet i mikroskopet. Typiske verdier av θ i våre eksperimenter (basert på en oppreist mikroskop) er rundt 36 °, men den optimale vinkelen kan avvike betydelig for alternative oppsett (f.eks de som bruker en invertert mikroskop).
- Lage forbindelser mellom laseren og den patch clamp datainnsamlingssystemet (f.eks Digidata 1440A, Molecular Devices) som vist i figur 2.. Den digitale utgangen fra patch clamp datainnsamlingssystemet skal kobles til laseren via en ekstern funksjon generator, som gjør det mulig å spesifisere laserpuls parametere som er uavhengige av datainnsamlingssystemet. Alternativt denne utgangen kan kobles direkte tillaserdriveren (krever puls lengde og repetisjon sats for å bli satt av datainnsamling programvare). I begge tilfeller bør det signal som benyttes til å utløse laseren være koblet tilbake til en inngang på datainnsamlingssystemet å sikre at tidspunktet og lengden av laserpulser kan tas opp samtidig med elektrofysiologisk signal.
3. Patch Clamp Recordings for Undersøkelse av INS
- Fyll passende beholder av perfusjonen system med ekstracellulær løsning og justere strømningshastigheten for å gi perfusjon av badet med en hastighet av 1-2 ml / min. Vi bruker et tyngdekraft-matet system (aspirator flaske, klemmeventilen, og PE-rør) med et in-line ovn for å muliggjøre hurtig oppvarming av løsningen, og en peristaltisk pumpe for å fjerne brukt løsning ved avsugning.
- Plasser et dekkglass med dyrkede celler i innspillingen kammer (bad) av en oppreist mikroskop. Ved hjelp av en høy forstørrelse vann-nedsenking objektiv (e. G. 40X) og fase-kontrast (f.eks differensial interferens kontrast eller Dodt gradient kontrast), visuelt finne spiral ganglion nevroner innenfor kultur. En typisk spiral ganglion neuron er fase-lyse, rund og omtrent 15 pm i diameter med en fremtredende kjerne, som vist i Figur 1a.
- Når en nervecelle har blitt plassert, bytte til en lavere forstørrelse objektiv (f.eks 10X) og lokalisere målet nervecellen innen det visuelle feltet.
- Flytt lys levering optisk fiber på plass ved hjelp av følgende prosedyre (eller tilsvarende):
- Bruk micropositioner å bevege utgang fiberen til spissen er nær målet neuron i både de horisontale og vertikale plan. Den vertikale stilling av fiberen spissen kan verifiseres ved å bevege objektiv opp og ned (gjennomsøking fokus).
- Bytte tilbake til høy forstørrelse objektiv og posisjonere spissen av den optiske fiberen i den tiltenkte posisjon ved siden av than neuron (se figur 2 innfelt). Ved justering av den vertikale stilling av fiberen, er det viktig at den nedre kant av fiberen hviler på (dvs. bare berøre) dekkglass, å redusere usikkerhet i plasseringen av fiberen. Optimal oppstilling i horisontalplanet vil avhenge av vinkelen θ at fibrene gjør med dekkglass og radiusen til fiberen r. For å posisjonere fiberen slik at midten av målet neuron ligger langs fiber-aksen, bør den horisontale avstand mellom den øvre kant av fiber og målcellen bli
Δ target = r (cosec θ - 2 sin θ),
hvor negative verdier tilsier at den optiske fiberen overheng cellen. Ved å rette inn fiberen, kan en avstand på Δ target mellom den øvre kanten av fiberen og midten av nervecellen være tilnærmet oppnås ved visuell inspeksjon. Imidlertid Δ målet er konstruert for åtjene som en grov rettesnor bare. Posisjonering av fiberen slik at den virkelige avstand Δ mellom den øvre kant av fiber-og sentrum av nervecellen målbart forskjellig fra Δ målet (som i figur 1) kan gi kunnskap om effekten av både en radiell forskyvning (dvs. fra midten av stråle) og aksial forskyvning (dvs. langs fiber-aksen) av strålen i forhold til målet neuron. For eksempel angir Δ ≈ 0 ville være forventet å øke den lokale temperatur i nærheten av cellen - dvs. siden strålen profil for typiske flermodusfibere er godt tilnærmet ved en flosshatt fordeling 26, nedgangen i lokalt absorbert energi (temperatur) ved fortrengning fra midten av bjelken er minimal i forhold til den økning av absorbert energi fra å bevege fiberendeflaten nærmere cellen.
Mens forsiktighet bør tas for å posisjonere fiber så nøyaktig og repeatably som possible bruker visuelle hint, presis måling av fiber plassering i forhold til målet nervecellen (f.eks Δ) er av større betydning enn å plassere det en forhåndsbestemt avstand unna. Δ kan bestemmes (med en beregnet maksimal usikkerhet på ± 3 um) ved bildeanalyse som beskrevet i trinn 3.8.2 av protokollen. I noen eksperimenter 5,8, har hvite lyskilder blitt koblet gjennom fiber for å målrette ønsket celle. Denne metode ble funnet å være ineffektive i oppreist mikroskop oppsett, som intensiteten av lys som spres fra målområdet var relativt lav i disse grunne vinkler (θ). - Når fiberen er i posisjon, beveger den ut av en kjent mengde for å muliggjøre enkel posisjonering av mikropipette. Fiberen kan så returneres til den opprinnelige stilling når en neural opptak er oppnådd.
- Fyll mikropipette med den intracellulære løsning og sikkert på plass på plass på hodeneDen vesentligste fordelen i forsterkeren (f.eks Multiclamp 700B, Molecular Devices). Ved hjelp av slangen er festet til siden av mikroelektroden holderen, anvende en liten mengde positivt trykk for å hindre tilstopping av mikropipette.
- Ved hjelp av en micromanipulator, flytter micropipette på plass like over målet nervecellen.
- Protokoll for helcelle opptak:
- Påfør en 10 ms, 10 mV square wave puls (f.eks Seal Test) i spenning-klemme-modus på forsterkeren og juster micropipette potensial (pipette offset) på grunnlinjen signal til 0 nA. Forseglingen testen bør også bli brukt til å bestemme hvorvidt motstanden mikroelektroden er innenfor det ønskede område (for eksempel 2-6 MΩ).
- Mens overvåking av motstanden, bruk finjusteres mikromanipulator å forsiktig posisjonere mikropipette på overflaten av mål-neuron. Når mikropipette er i kontakt med neuron, vil motstanden øke (ved ~ 0,5 til 1 MΩ). Jegmmediately følge motstanden øker, fjerne den positive væsketrykk og bruke en liten negativ press. Når motstanden har passert 10 - 20 MΩ, fikse membranen potensial til et holdingselskap nivå (for eksempel rundt -60 mV).
- Elektroden motstanden skal fortsette å øke fram til den overstiger en GΩ, som viser at en effektiv tetning (kalt 'gigaseal') har blitt dannet mellom cellemembranen og micropipette. På dette punktet, fjerne alle fluidtrykk fra mikropipette.
- Når gigaseal har blitt dannet, bruke korte strømpulser (25 til 100 μsec; +1 V) eller korte pulser med negativ fluidtrykk til å sprekke cellemembranen og oppnå helcelle-konfigurasjon.
- Ta opp film kondensatorer, serie motstand og innspill motstand som bestemmes av eksponentiell kurve montert på strøm under segl test puls. Minimere kapasitans transienter ved å justere CpFast og CpSlow kontrollene på forsterkeren, så switch forsterkeren inn i helcelle-modus, og kompensere kapasitans og motstand til en flat strøm observeres under forseglingen test. Påfør serie motstand kompensasjon (~ 70% korreksjon, 70% prediksjon), justere kapasitans og motstand kontroller for å opprettholde en flat test segl respons.
- Bytte til strøm-klemme modus i forsterkeren. Legg merke til det hvilende membranpotensial (i fravær av strøminjiseringen). Sett en holdestrøm for å stabilisere membran potensial på det ønskede nivå (for eksempel -60 mV). Nøytralisere pipette kapasitans og justere brua balanse å balansere spenningsfall.
- Kontroller avfyring egenskapene til nervecellen ved å stimulere med depolariserende strøm (10-200 pA i 10 pA trinn; 300 ms varighet).
- Bevege den optiske fiber tilbake i posisjon ved siden av neuron. Ved hjelp av bildebehandling koplet til et CCD-kamera, ta bilder av posisjonen til fiberen med hensyn til målet neuron, med fokus på planet til nervecellen utgangspunktet, og deretter på den øvre kanten av den optiske fiber (se figur 1).
- Ved påfølgende analyse av de resulterende bilder (f.eks figurene 1b og 1c) er det mulig å bestemme nøyaktig Δ (posisjonen til den øvre kanten av den optiske fiber i forhold til midten av målet neuron). Når Δ er kjent, kan parametere som avstand fra fiberendeflaten til målet neuron (langs fiber-aksen) z og den radielle forskyvningen av nervecellen fra sentrum av strålen δ r beregnes ved hjelp av enkle trigonometriske relasjoner:
z = r synd 2θ + Δ cos θ
δ r = ((R cos 2θ - Δ sin θ) 2 + δy 2) 1/2,
hvor δy er avstanden mellom den fiber-aksen og midt i nervecellen sett ovenfra (se f.ekse figur 1).
Analysen bør ta hensyn til posisjonelle variasjoner fra celle til celle, så nøyaktig kunnskap om disse plassering parametrene kan være nødvendig for å løse mulige forskjeller mellom stimulering prosesser 25.
4. INS Experiments
- Når du spiller elektrofysiologiske data i enten strøm klemme eller spenning klemme konfigurasjoner, kjøre stimulering laser på de ønskede parametere (for eksempel strøm, puls lengde, repetisjon rate osv.). Med laser vår, er optisk effekt styres via en direkte inngang til laser driver og er spesifisert manuelt før hvert opptak. Puls lengde og repetisjonsrate kan kontrolleres av enten et eksternt signal generator eller datainnsamling programvare (som beskrevet i trinn 2.3.4). Sikre at data blir registrert fra både patch clamp kanal og laseren avtrekkeren kanal.
Laser pulser med lengder spennerfra rundt 500 μsec til 15 ms og energier av ~ 0,25 til 5 mJ per puls gir vanligvis målbare elektriske svar. Innstilling av repetisjonsrate av laserpulser til å være 1 Hz eller mindre kan være nyttig for innledende forsøk, da det vil redusere effekten av denne parameteren. Typiske resultater som viser endringen i den innspilte signal er presentert i følgende avsnitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spiral ganglion nevroner svare på laser belysning med repeterbare kurver både spenning-klemme og strøm-klemme opptak konfigurasjoner. Figur 3a viser typiske endringer i gjeldende flyt på tvers av en cellemembran som svar på en 2,5 ms, 0,8 mJ laser puls (gjennomsnittlig svartid fra 6 laserpulser, gjentas med en sek intervaller) med membranen potensial holdt på -70 mV, -60 mV og -50 mV. Netto innover strømmer konsekvent fremkalt respons på laser pulser, tilbake til opprinnelige verdier etter belysning har opphørt. Formen på laser-induserte strømmer kan ses å variere som membranpotensialet endres, noe som indikerer at det kan være viktig å utføre eksperimenter på en rekke holde potensialer for å få en fullstendig forståelse av prosessene som ligger til grunn INS. Forsøkene kan utføres med mindre modifikasjon av den aktuelle protokoll, og analysert ved hjelp av etablerte teknikker som lade-spenning (QV)-analyse (see Reference 7 for eksempler på QV kurver hentet fra INS in vitro).
Dataene som presenteres i figur 3b er tegn på endring i membranpotensialet vanligvis fremkalt av en 2,5 ms, 0,8 mJ laser puls (initial membranpotensiale-73mV, i gjennomsnitt over 16 laserpulser levert på en gjentakelse rate på 4 Hz). Nåværende-klemme opptak viser en jevn hinne depolarisering i løpet av laserpulsen, etterfulgt av en ca eksponentiell nedgang mot hvile-membranpotensialet etter pulsen. Eksempelet i figur 3b også oppviser en liten ekstra membran depolarisering etter laserpulsen. Shapiro et al. Syv har vist at laser-induserte endringer i membranpotensial er nært relatert til lokale endringer i temperatur (dvs. temperaturen i umiddelbar nærhet av cellen). Videre er modellen beskrevet av Thompson et al. 27.har fastslått at under visse betingelser innretting, kan diffusjon som skyldes aksiale og radiale temperaturgradienter i det opplyste område føre til lokale temperaturvariasjoner tett likner de forandringer i membranpotensialet som er vist i figur 3b. Som et resultat av disse funnene, er det tenkt at plasseringen av målcellen i forhold til ende-forsiden av lys levering fiber spiller en betydelig rolle i å bestemme både tidsforløpet av laser-fremkalt variasjoner i membranpotensial og maksimumstemperaturen i regionen av cellen.
Belyst med overdreven energi eller eksponering for store økninger i temperaturen kan føre til skade på målet nervecellen. Dette kan ofte observeres ved forringelse av cellen elektriske egenskaper (for eksempel en brå økning i spenningen som kreves for å opprettholde den membranpotensialet på et jevnt nivå, og / eller en stor økning i støy og ustabilitet i signalet). I ekstreme tilfellers celledød oppstår nesten umiddelbart på laser eksponering. Figur 4 viser en spenning-klemme opptak av død av en spiral ganglion neuron følge av eksponering for en 25 ms, 8 mJ laser puls.
Figur 1. Fasekontrast bilder som viser en typisk spiral ganglion neuron og de relative posisjoner av optisk fiber og mikropipette (som sett ovenfra) i løpet av optiske stimulering eksperimenter. A) Typisk spiral ganglion neuron. B) den optiske fiberen i posisjon (bildet er fokusert på toppen kanten av den optiske fiber) c) overleggsbildene viser den fiber stilling i forhold til cellen (merk:. den øvre kant av fiber er svakt overhengende cellen dvs. Δ er negativ). Som sett ovenfra, δ y og & DelTA, er den radielle forskyvning av nervecellen sentrum fra fiber-aksen og avstanden fra den øvre kant av fiberen til midten av nervecellen hhv. Pilene angir posisjonen til spiral ganglion neuron. Scale barer 20 mikrometer.
Figur 2. Skjematisk av det eksperimentelle oppsettet for optiske stimulering eksperimenter (ikke i målestokk) Innfelt:. Stilling av optisk fiber og microelectrode forhold til målcellen. θ, Δ og z er som definert i protokoll trinn 3.4.2 og 3.8.2.
Figur 3. A) Spenning-klemme (gjennomsnittlig svartid fra 6 laser pulser levere denrød med en hastighet på 1 Hz) og b) gjeldende-klemme (gjennomsnittlig svartid fra 16 laserpulser gjentas med en hastighet på 4 Hz) opptak fra spiral ganglion nevroner viser laser indusert endringer i membranen nåværende og membran potensial ved belysning av en 2,5 ms , 0,8 mJ laser puls. Skraverte områdene viser tidspunktet for laser eksponering. Innfellinger viser svarene under laser belysning i mer detalj. Merk: det innfelte i a) fokuserer på sporet oppnådd med en membran på -60 mV. Klikk her for å se større figur .
Figur 4. Spenning-klemme opptak viser celledød som følge av eksponering for en svært energisk (25 ms, 8 mJ) laser puls. Legg merke til at amplitudensignalet er vist i nA og er vesentlig større enn strømmene pA er vist i figur 3..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjelp av protokollene som er skissert i denne artikkelen er det mulig å trekke ut og kultur spiral ganglion nevroner og undersøke laser-fremkalt elektrisk aktivitet ved å utføre helcelle patch clamp eksperimenter. Når den brukes in vitro, gir plasteret klemmeteknikken en grad av kontroll over eksperimentelle parametere som ikke er oppnåelig in vivo. Laser stimulering parametere som bølgelengde, puls energi, puls lengde, puls form, og puls repetisjon sekvenser kan studeres i en reproduserbar innstilling. I tillegg kan det miljøet der nervecellene er opprettholdt (f.eks løsning temperatur, kjemiske påvirkninger) være systematisk variert, noe som gjør det mulig å studere de membran-egenskaper og dermed de mekanismer som ligger til grunn for infrarød nervestimulering. Samspillet mellom elektriske og optiske stimulering modaliteter kan også bli undersøkt på en kontrollert måte. Disse fundamentale studier kan være mer avansert ved å innføre fluorescent sonder for å overvåke flere parametre som ioniske konsentrasjoner eller uttrykk for heat shock proteiner. En klar forståelse av disse ulike parametre er ikke bare viktig for å oppnå en fullstendig forståelse av fenomenet, men også for å oppnå mer effektiv stimulering gjennom prosessoptimalisering.
På grunn av den viktige rollen temperatur i mekanismen INS 5-7, er nøyaktig måling av lokal oppvarming på grunn av laser belysning av overordnet betydning i å definere denne mekanismen 27. En detaljert metode for å skaffe kalibrerte temperaturmålinger ved å ta opp den strøm som flyter gjennom en åpen lapp pipette har blitt beskrevet av Yao et al. 28 og anvendes av mange forfattere, for å bestemme størrelsen på og tiden løpet av laser-induserte temperaturendringer i miljøer representative for de funnet in vitro (for eksempel se referanser 7, 8). Gid. plassering av lys levering fiber kan bestemmes helt nøyaktig (ved bruk av f.eks nåværende protokoll), er denne metode for temperaturmålinger sannsynlig å muliggjøre nøyaktig kartlegging av lokal endring i temperatur på grunn av typiske INS stimuli.
Bølgelengden av den stimulerende laseren er en parameter som bør tas i betraktning i INS eksperimenter, siden laser induserte temperaturendringer (og dermed de underliggende mekanismer av INS) er mediert av bølgelengden uselvstendige absorpsjonsegenskapene til vann 7 (se Thompson et al. For 25 en detaljert diskusjon av forventede bølgelengde effekter). Bortsett fra 1870 nm diode laser som brukes i denne protokollen (Infrared Nerve Stimulator, Optotech P / L), en rekke bølgelengder og laser pakker har blitt brukt av andre forfattere. Noen vanlige eksempler på lasere som brukes i eksisterende INS publikasjoner er: diode lasere fra Aculight med bølgelengder som spenner fra 1,840-1,940 nm 6,7,10,13,16-18; Holmium: YAG lasere (2,12 mikrometer) fra Laser 1-2-3 6,11,12,14,15, og diode lasere som opererer på 1875 5,8 nm, 1470 nm 8 og 1535 nm 8 fra Sheaumann laser.
En potensiell ulempe ved å anvende denne teknikk for å dyrkede spiral ganglion neuroner, er at på grunn av den relativt lille størrelsen av nevroner (~ 10-15 mikrometer diameter), blir opptak elektroden direkte belyst av laseren. Det har vært antydet at laser belysning utover et visst nivå, som kan forandre egenskapene for opptak kretsen 7 (dvs. forsegling og motstand pipette). Shapiro et al. Syv målt denne terskel ved å overvåke endringen i reversering potensial QV kurver som laser-kraft ble øket, å finne en terskel pulsenergien til 3 mJ. Som en alternativ fremgangsmåte, kan det være mulig å bestemme størrelsen av denne virkning ved å måle den kombinerte motstand av tetningen og pipetten i whulls celle-modus (dvs. ved å registrere den aktuelle reaksjon på en 10 msek, 10 mV spenningspuls) samtidig å variere temperaturen av ekstracellulær løsning. For å fullt ut forstå mekanismene INS, er det viktig at laser indusert motstand endringer måles og tas hensyn til.
Hittil flertallet av eksperimentelt arbeid om infrarød nervestimulering har blitt gjennomført in vivo. Mens rapporterte strålende eksponering terskler for infrarød stimulering in vivo variere noe (for eksempel 0,32 JCM -2 på 2,12 mikrometer for rotte sciatic nerver 1, <0,1 JCM -2 på 1,855 mikrometer for gerbil hørselsnervene 18), de er betydelig lavere enn terskler fastsatt gjennom in vitro studier (f.eks ca 20 JCM -2 på 1,875 mikrometer for mus retinal ganglion celler og rotte vestibulære ganglion celler 5,8, 8,3 J cm -2 for rotte neonatal cardiomycytes 9). På dette stadiet detaljene i INS prosessen ikke er godt nok forstått å spekulere om årsaken til denne forskjellen, men kan ved hjelp av in vitro-modeller som auditive nevroner som likne på målene i forrige in vivo arbeid være en fordel å finne en forklaring .
Noen andre in vitro-modeller involvere større celler som for eksempel Xenopus oocytter (~ 1 mm diameter) som brukes av Shapiro et al. 7. Disse kan være nyttige for sondering romlige variasjoner i effektiviteten av INS tvers av individuelle celler for å undersøke om cellulære komponenter påvirkes ved stimulering. Enklere modeller som lipidbilag blemmer kan gi enda mer presis kontroll over eksperimentelle parametre enn in vitro eksperimenter, er imidlertid slike modeller noe begrenset i omfang og kan ikke avsløre den fulle kompleksiteten i INS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av den australske Forskningsrådet i henhold Linkage Prosjekt stipend LP120100264.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials and equipment | |||
| Glass coverslips | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-ring cell culture dish | VWR International | 82050-542 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Curved forceps | WPI | 14101 | Dumont #5 tweezers (45° angle tip) |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Table 1. Cell culture materials and equipment. | |||
| Neurobasal media | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-149 | |
| Intracellular solution | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Potassium hydroxide | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Extracellular solution | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sodium hydroxide | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution. | |||
| Upright microscope | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipped with Dodt contrast |
| Water-immersion objective | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| Platform and X-Y stage | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Vibration isolation table | TMC | Micro-g 63-532 | |
| CCD Camera | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
| Camera software | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
| In-line solution heater | Warner | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Patch clamp data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Micropipette glass | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Borosilicate glass with filament |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P2000 | |
| Recording Software | AxoGraph | Lab pack and electrophysiology tools | |
| Aspirator bottle | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing |
| PE Tubing | Harvard | PolyE #340 | |
| Masterflex peristaltic pump | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Table 3.Patch clamp equipment. | |||
| 1,870 nm laser diode | Optotech | ||
| 200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA |
| Optical fiber through connector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Optical fiber cleaver | EREM | FO1 | |
| Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm) | Siemens | For removing optical fiber jacket | |
| Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm) | Siemens | For removing outer coating of patch cord | |
| Signal generator | Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered | ||
| Optical fiber positioner | Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments | ||
| Optical fiber chuck | Newport | FPH-DJ | |
| Laser power meter and detector head | Coherent | FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head) | |
| Table 4. Laser equipment. | |||
References
- Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003 (2005).
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).
- Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Albert, E. S., et al. Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
- Wells, J., et al. Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve. Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
- Bec, J. -M., et al. Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons. Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).
- Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).
- Izzo, A. D., et al. Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth. Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).
- Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation. Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).
- Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique. Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).
- Jenkins, M. W., et al.
- Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T.
- Izzo, A. D., et al. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli. J. Biomed. Opt. 12, 021008 (2007).
- Richter, C. P., et al. Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening. Hearing Research. 242, 42-51 (2008).
- Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. Laser stimulation of single auditory nerve fibers. Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).
- Izzo, A. D., et al. Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291, 1-14 (2012).
- Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons. Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).
- Whitlon, D. S., et al. Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion. Neuroscience. 138, 653-662 (1016).
- Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice. Hearing Research. 230, 17-23 (2007).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. J. Vis. Exp. (36), e1685 (2010).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 17, 075002 (2012).
- Snyder, A. W., Love, J. D. Optical Waveguide Theory. , Chapman and Hall. (1983).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).
- Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies. Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).
