Summary
В последние годы образовании половых клеток с использованием методов культурах клеток было продемонстрировано с использованием нескольких различных типов клеток соматических стволовых клеток. В этой статье мы представим дифференциации новорожденных мышей стволовые клетки для ранней ооцитов-подобных клеток.
Abstract
Изучение ЗАРОДЫШЕОБРАЗОВАНИЕ и дифференцировки клеток традиционно было очень трудно из-за низкого количества клеток и их расположение глубоко внутри развивающихся эмбрионов. Наличие «закрытых» в пробирке система может оказаться бесценным для нашего понимания гаметогенеза. Формирование яйцеклетки-подобных клеток (ЭПУ) из соматических стволовых клеток, выделенных из кожи новорожденных мышей, была продемонстрирована и могут быть визуализированы в этом видео протокола. Полученные ЭПУ выражать различные маркеры соответствуют ооцитов, таких как Oct4, Vasa, Bmp15 и SCP3. Тем не менее, они по-прежнему не в состоянии пройти созревания или оплодотворения из-за неспособности завершить мейоза. Этот протокол будет создать систему, которая будет полезна для изучения ранней стадии формирования и дифференциации зародышевых клеток в более зрелых гамет. Во время ранней дифференциации количество клеток, экспрессирующих Oct4 (потенциальный зародыш-подобные клетки) достигает ~ 5%, однако в настоящее время FРеформации из ЭПУ остается относительно неэффективны. Протокол относительно прямой, хотя особое внимание следует уделять обеспечению исходной клеточной популяции здоровых и на ранней проход.
Introduction
Во время раннего эмбриогенеза, гаметогенеза происходит через ряд этапов, включая изначальную зародышевых клеток (PGC) образование, миграция, и, наконец, колонизации половых хребтов. За это время PGCs пройти пролиферации и дифференцировке во все более и более зрелые гаметы 1. Тот факт, что PGCs мигрировать из базы аллантоис в эмбрион кишке и, наконец, вдоль дорсальной стенки в конечном счете колонизации половых гребни делает их чрезвычайно трудным для изучения 2. Несмотря на успехи в области исследования пытаются понять PGC формирования и дифференциации препятствовали их ограниченное количество, расположение и миграционного характера 3,4.
В последние годы эмбриональные стволовые клетки, как было показано, имеют потенциал для формирования половых клеток в пробирке 5,6. Кроме того, несколько стволовых соматические клетки, также было показано, что потенциал для формирования половых клеток Follблагодаря в пробирке культивирования 7-11. Последнее стволовые клетки, выделенные из кожи новорожденных мышей были дифференцированы в пробирке в зародышевые-подобные клетки и ооциты ранней стадии 12. Во время дифференцировки подмножество стволовых клеток, экспрессирующих Oct4 увеличена и структуры, напоминающие кумулюсных-ооцита комплексы были сформированы. Ооцитов-подобных клеток (ЭПУ) могут быть выбраны из культур и по сравнению с природным ооцитов. С помощью этого метода культуры ЭПУ измерения 40-45 мкм получаются, которое выражает подобные маркеры, такие как ооциты Gdf9b, Vasa, и DAZL. На сегодняшний день в результате ЭПУ-прежнему не созреть или быть оплодотворены 12.
Хотя ПУЭ остаются не в состоянии функционировать протокол, используемый для формирования этих ЭПУ могут по-прежнему находят применение в качестве анализа для изучения формирования и развития половых клеток ранних стадия в рамках закрытой системы в пробирке. Оригинальная публикация обсуждают формирование ЭПУ из такхор стволовых клеток использовали плода свиной кожи в качестве источника стволовых клеток 8. Развивая это исследование PGC-подобные клетки формируются в раннем возрасте во время индуцирует дифференциацию было показано, что предшественники ПУЭ и ускоренная такие маркеры как PGC OCT4, Vasa, Стелла, C-KIT и DAZL 13. Эти данные подтверждают потенциал использовании этой системы для изучения образование зародышей и дифференцировки клеток в пробирке. Протокол, используемый для формирования ЭПУ из кожи новорожденных мышей будет показано в этом видео статье. Этот протокол предлагает в пробирке модель для изучения развития зародышевых клеток, которые могут обеспечить средства для выяснения факторов, важных для их пролиферации и дифференцировки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление среды
- Подготовьте СМИ 2-3 часов до начала использования и место с ослабил крышку в инкубаторе для клеточных культур, где эксперимент будет проходить. Медиа, используемые в настоящем протоколе:
- Подготовка стволовых клеток среду, состоящую из DMEM/F12, дополненной 1 х В27, 40 нг / мл BFGF и 20 нг / мл EGF.
- Подготовка зародышевых клеток дифференциации среды, состоящей из M199 с добавлением 0,05 международных единиц ФСГ, 0,03 МЕ ЛГ, 3 мг / мл BSA, 5 мкл / мл ЕЕ, 0,23 мМ пирувата натрия, 1 мг / мл фетуином и 1 нг / мл ЭФР. Основную среду, состоящую из всех добавок но без ФСГ, ЛГ и EGF могут быть подготовлены и хранили при 4 ° С в течение одной недели.
2. Подготовка Стволовые клеточные культуры
- Изолировать стволовые клетки новорожденных щенков мыши, как описано выше 12. Использование стволовых клеток при прохождении 2-4 для экстракорпорального дифференцировки клеток зародыша. ЭффективностьOLC образование напрямую связана с качеством исходных стволовых клеток. Лучше всего, чтобы начать дифференциации, как только население оказывается чистой и здоровой которая обычно составляет около прохода 2. Дальнейшее культивирование стволовых клеток прошлые 2 Прохождение негативно влияет на эффективность формирования КЮ (неопубликованные результаты).
- 48 часов до начала дифференциации субкультуре стволовых клеток. Удалите все приостановленные сферические агрегаты клеток и истощенные среды от культуры блюдо, используя серологические пипетки, и поместить в 15 мл трубки. Важно только собирают взвешенных сферических агрегатов клеток, а не клетки, прикрепленные к нижней части блюда, которые спонтанно дифференциации.
- Осаждения клеток при 500 мкг в течение 5 мин., Отбросить супернатант, и ресуспендируют в 500 мкл свежей среды стволовых клеток нагревают до 37 ° С. Аккуратно пипетки агрегатов частично диссоциируют клеток. Не агрессивно пипетки клеткис, как это приведет к снижению жизнеспособности клеток. Промыть частично диссоциированных клеток в 9,5 мл свежей предварительно нагретой стволовых клеток среднего на низкий крепление 10 см чашку культуре клеток.
- Возврат клетки 37 ° С, 5% СО 2 инкубаторе для клеточных культур в течение 48 ч до начала дифференциации.
3. Дифференциация КЮ
- Использование серологические пипетки удалить стволовые клетки из культуры блюдо и поместить в 15 мл трубки, оставить позади все подключенные к нему клеток. Осаждения клеток при 500g и ресуспендируют в 500 мкл стерильной PBS. Энергичное пипетки клеток с использованием широкого отверстие 1000 мкл наконечник в сгустки не более 10-20 клеток. Периодически удаления небольшого количества клеток, во время диссоциации и проверить под микроскопом белый свет, чтобы подтвердить агрегированные клетки находятся в сгустки 10-20 отдельных клеток. За диссоциации приведет к снижению жизнеспособности клеток.
- Добавить 9,5 мл PBS в диссоциированных клеток и добавить 15 мкл этой клеточной суспензии в гемоцитометре для подсчета клеток. Гранул клетки при 500 х г в течение 5 мин.
- Повторное приостановить клеток в концентрации 1.32X10 6 клеток / мл в дифференциации среды.
- Пластина клеток путем добавления 500 мкл на лунку в плоское дно 24-луночный планшет подвески.
- Поместите 24 хорошо блюдо в инкубаторе для клеточных культур при 37 ° С в 5% СО 2 в течение 48 часов. Удалить 250 мкл среды из каждой лунки и место в помечены соответственно 1,5 мл трубки. Добавить 250 мкл свежей среды, дифференциацию в каждую лунку. Центрифуга истощенной среды при 500 х г в течение 5 мин. и отбросить супернатант. Ресуспендируйте любой осажденные клетки в 50 мкл свежей среды дифференциации и вернуться к соответствующей культуре также на дифференциацию пластины.
- Каждые 48 часа изменить половину среды до 12-й день дифференциации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Изначально клетки прикрепляются к нижней блюдо культуры и распространиться. В 42-72 часов в дифференциации взвешенных мелких OCT4 позитивные клетки размножаются и образуют (рис. 1А). Вскоре после визуализации этих клеток большинство исчезнет, и прикрепленные клетки образовывают плотные агрегаты колонии на нижней культуры. После нескольких дней эти агрегаты будут отделяться от поверхности культуры. В некоторых из этих агрегатов большой камере можно наблюдать (1b и 1с рисунок). При первоначальном визуализации клеток будет ~ 35 мкм в диаметре. При продолжении культуры ЭПУ возрастет до ~ 45 мкм в диаметре. Эти ПУЭ и может быть собрана с поддержкой клетки или трипсином для получения ПУЭ без другой клетки, прикрепленные (рис. 1, г).
Для того, чтобы подтвердить, что ПУЭ отражают аналогичную транскриптов как природные ооцитов ПУЭ могут быть собраны и проверены наВыражение таких маркеров, как кондитерская фабрика, SCP3, CMOS, Oct4, Bmp15 и Васа. В то время как Oct4 и Васа выражены в недифференцированные стволовые клетки несколько маркеров, таких как Bmp15 и ССВ в ооцитах конкретными. BMP15 является членом TGF-β семьи и участвует в ооцитов и развитие фолликулов. Ооцитов конкретных пеллюцида мембранная структура состоит из нескольких белков, включая ZP3. Экспрессия этих ооцитах специфические маркеры могут быть использованы для подтверждения наличия ПУЭ в дифференциации. Кроме того, выражение мейотического специфические маркеры, такие как SCP3 и КМОП может идентифицировать потенциально мейотического клеток в культуре системы. В приведенном примере 10 ПУЭ и 10 ооциты были собраны и прямого синтеза кДНК выполняется (рис. 2). Полученные образцы были протестированы с использованием полуколичественной ПЦР. Сравнение экспрессии этих маркеров для природного ооцитах мыши мы видимразличия в уровне транскриптов (рис. 2). Многие маркеры выраженные ооцитов будет выражаться ПУЭ, если дифференциации была успешной.
Рисунок 1. Общие морфологии в течение индуцирует дифференциацию кожи стволовые клетки. а) во время ранней стадии дифференцировки клеток, позитивных для OCT4 (зеленый) могут быть обнаружены в культуре. Ядра в противоположных окрашивали Hoechst (синий). Б) в качестве дифференциации прогрессирует некоторых клеточных агрегатов будет видно с OCT4 (зеленый) положительных клеток, окруженных OCT4 негативные клетки. Ядерная окрашивания Hoechst также изображен (синий). С) белый светлый образ фолликул-подобной структуры после отрыва от поверхности культуры. D) Во Разницадифференцирование большой OCT4 положительный (зеленый) ооцит-подобные клетки можно увидеть либо окружении клеток или отдельно в культуре. Масштабные линейки: а = 20 мкм, B = 100 мкм, с = 40 мкм, D = 10 мкм.
Рисунок 2. Стенограмма уровне в ПУЭ, по сравнению с ооцитов, общих маркеров яйцеклетки. Представитель ПЦР в реальном времени результаты, показывающие, стенограммы уровне общих маркеров ооцитов в ПУЭ. Это сравнение результате 10 ооцитов-подобных клеток сравнивали с новорожденным 10 ооцитов мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
На сегодняшний день функциональные ЭПУ не были разработаны с использованием полностью в пробирке анализа. В последнее время исследования Хаяши и соавт. Был в состоянии произвести потомство от PGC-подобные клетки формируются в пробирке и в естественных условиях передается для дальнейшего развития 14. Начиная с ЭС клетки или индуцированных плюрипотентных клеток они были способны образовывать PGC как клетки, которые, когда они извлечены после трансплантации в естественных условиях могли быть созрели, оплодотворены, и используется для генерации потомства 14. Это свидетельствует о том, что стволовые клетки из различных источников имеют возможность, при соблюдении условий, формировать функциональный ооцитов.
Некоторые аспекты системы культуры являются критическими для его функционирование. Штамм мышей использовали для изоляции стволовых клеток является очень важным. Этот протокол был разработан и использован с B6 мышей от Jackson Lab (Лот № 008 214). Эти мыши несут Oct4-EGFP трансгенов позволяющие отношениюualization клеток, экспрессирующих Oct4 через белок EGFP. Когда протокола была предпринята попытка с использованием стволовых клеток от мышей CD1 эффективность была значительно ниже, и OLC образование было менее надежными. В настоящее время эффективность ОЛЦ образование остается низкой даже при использовании мышей В6. Стволовые клетки должны быть использованы при прохождении 2-4 до начала дифференцировки клеток зародышей как эффективность зародыш образования клеток значительно ниже при использовании позднее клетки проход. Источник различных реагентов также оказалось важным.
Анализ различных мРНК-транскриптов в ЭПУ может оказаться полезной при оптимизации системы культуры. С помощью полуколичественной ПЦР позволяет осуществлять сравнение нескольких выражение маркеры уровней между ПУЭ и ооцитов (рис. 2). Результаты показывают, что ПУЭ представляют менее чем ZPC ооцитов, который может объяснить, хрупкой природы и тоньше пеллюцида мембране ПУЭ. Выражение мейоз маркер
Протокол, описанный здесь, обеспечивает контроль в пробирке метод для изучения зародышей формирование и дифференцировку клеток. В настоящее время, как PGC-клеток, полученных не способны образовывать функциональные ЭПУ, когда поддерживается в пробирке. В совокупности с новорожденным яичников соматических клеток и пересадить в естественных условиях PGC-подобные клетки способны образовывать ранней стадии вторичных фолликулов. Однако, когда ПУЭ восстанавливаются они все еще не могут быть надежно созрели и оплодотворенная 12. Утилита в этом анализе происходит от изучения предварительно мейотического зародышевые клетки, полученные из соматических клеток, стволовых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
PWD при поддержке Канадского института исследований в области здравоохранения общение (CIHR) и CIHR грант Джеральд М. Киддер в Западном университете. Автор хотел бы также признать Julang Ли в университете гвельфов за помощь в разработке протокола, представленные здесь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 well plates | Nunc | 144530 | |
| 10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml tubes | BD | 352095 |
References
- van den Hurk, R., Zhao, J. Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).
- Molyneaux, K. A., Stallock, J., Schaible, K., Wylie, C. Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration. Dev. Biol. 240, 488-498 (2001).
- Lawson, K. A., Hage, W. J. Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse. Ciba Found Symp. 182, 68-91 (1994).
- Ginsburg, M., Snow, M. H., McLaren, A. Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation. Development. 110, 521-528 (1990).
- Hubner, K., Fuhrmann, G., et al. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. Science. 300, 1251-1256 (2003).
- Toyooka, Y., Tsunekawa, N., Akasu, R., Noce, T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11457-11462 (2003).
- Wang, L., Cao, J., et al. Oocyte-like Cells Induced from Mouse Spermatogonial Stem Cells. Cell Biosci. 2, 27 (2012).
- Dyce, P. W., Wen, L., Li, J. In vitro germline potential of stem cells derived from fetal porcine skin. Nat. Cell Biol. 8, 384-390 (2006).
- Danner, S., Kajahn, J., Geismann, C., Klink, E., Kruse, C. Derivation of oocyte-like cells from a clonal pancreatic stem cell line. Mol. Hum. Reprod. 13, 11-20 (2007).
- Cheng, X., Chen, S., Yu, X., Zheng, P., Wang, H. BMP15 gene is activated during human amniotic fluid stem cell differentiation into oocyte-like cells. DNA Cell Biol. 31, 1198-1204 (2012).
- Song, S. H., Kumar, B. M., et al. Characterization of porcine multipotent stem/stromal cells derived from skin, adipose, and ovarian tissues and their differentiation in vitro into putative oocyte-like cells. Stem Cells Dev. 20, 1359-1370 (2011).
- Dyce, P. W., Liu, J., et al. In vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived from newborn mouse skin. PLoS One. 6, e20339 (2011).
- Linher, K., Dyce, P., Li, J. Primordial germ cell-like cells differentiated in vitro from skin-derived stem cells. PLoS One. 4, e8263 (2009).
- Hayashi, K., Ogushi, S., et al. Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-Like Cells in Mice. Science. , (2012).
