Summary
कमजोर बिखरने वस्तुओं की तीन आयामी स्थानों विशिष्ट एक मानक खुर्दबीन के लिए एक मामूली संशोधन शामिल है जो डिजिटल इनलाइन holographic माइक्रोस्कोपी (DIHM), का उपयोग कर पहचाना जा सकता है. हमारे सॉफ्टवेयर तीन आयामी स्थिति और एक सूक्ष्म चरण वस्तु की ज्यामिति उपज के रेले-Sommerfeld वापस प्रचार के साथ मिलकर एक सरल इमेजिंग अनुमानी का उपयोग करता है.
Abstract
ऐसी छोटी कोलाइडयन कण और सबसे जैविक कोशिकाओं के रूप में कमजोर बिखरने वस्तुओं, अक्सर माइक्रोस्कोपी में सामना कर रहे हैं. दरअसल, तकनीक की दूरी बेहतर इन चरण वस्तुओं कल्पना करने के लिए विकसित किया गया है, चरण विपरीत और डीआईसी विपरीत बढ़ाने के लिए सबसे लोकप्रिय तरीकों में से एक हैं. हालांकि, बाहर के इमेजिंग विमान दिशा में रिकॉर्डिंग स्थिति और आकार चुनौती बनी हुई है. यह रिपोर्ट सही डिजिटल इनलाइन holographic माइक्रोस्कोपी (DIHM) का उपयोग कर, स्थान और तीन आयामों में वस्तुओं की ज्यामिति को निर्धारित करने के लिए एक सरल प्रयोगात्मक विधि का परिचय. मोटे तौर पर, सुलभ नमूना मात्रा पार्श्व दिशा में कैमरा संवेदक आकार, और अक्षीय दिशा में रोशनी जुटना द्वारा परिभाषित किया गया है. ठेठ नमूना संस्करणों एलईडी रोशनी का उपयोग कर 200 माइक्रोन x 200 माइक्रोन x 200 माइक्रोन से, करने के लिए सीमा5 मिमी एक्स 5 मिमी एक्स 5 मिमी या बड़ा लेजर रोशनी का उपयोग कर. विमान लहरों नमूना पर घटना होते हैं इसलिए इस रोशनी प्रकाश विन्यस्त है. नमूना मात्रा में वस्तुओं तो रोशनी दिशा को सीधा हस्तक्षेप पैटर्न के लिए फार्म unscattered प्रकाश के साथ हस्तक्षेप है, जो प्रकाश बिखेरा. इस छवि (होलोग्राम) तीन आयामी पुनर्निर्माण के लिए आवश्यक गहराई में जानकारी शामिल है, और इस तरह के एक CMOS या सीसीडी कैमरे के रूप में एक मानक इमेजिंग डिवाइस पर कब्जा कर लिया जा सकता है. रेले-Sommerfeld वापस प्रसार विधि संख्यानुसार माइक्रोस्कोप छवियों refocus करने के लिए कार्यरत है, और GOUY चरण पर आधारित एक सरल इमेजिंग अनुमानी विसंगति को खंगाला मात्रा के भीतर वस्तुओं बिखरने की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस सरल लेकिन मजबूत विधि सूक्ष्म नमूने में वस्तुओं के स्थान और आकार की एक स्पष्ट, मॉडल से मुक्त माप में यह परिणाम है.
Introduction
डिजिटल इनलाइन holographic माइक्रोस्कोपी (DIHM) जैसे तैराकी सूक्ष्मजीवों 1,2 और एक मानक माइक्रोस्कोप स्थापना के लिए न्यूनतम संशोधन के साथ मुलायम मामले सिस्टम 3,4, के रूप में सूक्ष्म नमूने, के तेजी से तीन आयामी इमेजिंग की अनुमति देता है. इस पत्र में DIHM के एक शैक्षणिक प्रदर्शन हमारी प्रयोगशाला में विकसित सॉफ्टवेयर के आसपास केंद्रित, प्रदान की जाती है. इस पत्र, माइक्रोस्कोप की स्थापना डाटा अधिग्रहण का अनुकूलन, और तीन आयामी डेटा के पुनर्निर्माण के लिए दर्ज की गई छवियों की प्रक्रिया के लिए की एक विवरण शामिल हैं. और उदाहरण छवियों (डीजी Grier और 5 अन्य द्वारा विकसित सॉफ्टवेयर पर आधारित) सॉफ्टवेयर हमारी वेबसाइट पर आसानी से उपलब्ध हैं. एक विवरण, माइक्रोस्कोप कॉन्फ़िगर होलोग्राम से तीन आयामी मात्रा में फिर से संगठित और सॉफ्टवेयर पैकेज अनुरेखण एक मुक्त रे का उपयोग हित के परिणामस्वरूप मात्रा में रेंडर करने के लिए आवश्यक कदम के प्रदान की जाती है. कागज पुनर्निर्माण की गुणवत्ता प्रभावित करने वाले कारकों की एक चर्चा के साथ समाप्त, और प्रतिस्पर्धा के तरीकों के साथ DIHM की तुलना.
DIHM (किम 6 को देखें, अपने सिद्धांतों और विकास का एक सामान्य समीक्षा के लिए) कुछ समय पहले बताया गया था हालांकि, आवश्यक कंप्यूटिंग शक्ति और छवि प्रसंस्करण विशेषज्ञता अब तक काफी हद तक साधन विकास पर ध्यान देने के साथ विशेषज्ञ अनुसंधान समूहों के लिए इसके उपयोग सीमित कर दी है. यह स्थिति कंप्यूटिंग और कैमरा प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में हाल के अग्रिमों के प्रकाश में बदल रहा है. आधुनिक डेस्कटॉप कंप्यूटर को आसानी से प्रसंस्करण और डेटा भंडारण आवश्यकताओं के साथ सामना कर सकते हैं, सीसीडी या CMOS कैमरा सबसे माइक्रोस्कोपी प्रयोगशालाओं में मौजूद हैं, और अपेक्षित सॉफ्टवेयर तकनीक विकसित करने में समय का निवेश किया है जो समूहों द्वारा इंटरनेट पर आसानी से उपलब्ध कराया जा रहा है.
विभिन्न योजनाओं के लिए एक तीन आयामी नमूना मात्रा में सूक्ष्म वस्तुओं के विन्यास इमेजिंग के लिए प्रस्तावित किया गया है. इनमें से कई छवियों का एक ढेर एम द्वारा दर्ज की गई है, जिसमें तकनीक 7,8 स्कैनिंग कर रहे हैंechanically नमूना के माध्यम से छवि विमान के अनुवाद. स्कैनिंग confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी शायद सबसे परिचित उदाहरण है. आमतौर पर, एक फ्लोरोसेंट डाई नमूना विपरीत का एक स्वीकार्य स्तर को प्राप्त करने के क्रम में एक चरण वस्तु को जोड़ा, और confocal व्यवस्था स्थानिक फ्लोरोसेंट उत्सर्जन स्थानीयकरण इस्तेमाल किया जाता है. इस विधि यह भीड़ सिस्टम 9-11 के तीन आयामी गतिशीलता के लिए उपयोग की अनुमति दी है जहां कोलाइड विज्ञान के क्षेत्र में उदाहरण के लिए महत्वपूर्ण प्रगति हुई है. लेबलिंग का उपयोग प्रतिदीप्ति confocal माइक्रोस्कोपी और DIHM के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर है, लेकिन दो तकनीकों के अन्य सुविधाओं की तुलना के लायक हैं. DIHM तंत्र नहीं चलती भागों है कि में एक महत्वपूर्ण गति लाभ है. confocal प्रणालियों में यांत्रिक स्कैनिंग दर्पण डाटा अधिग्रहण दर पर एक ऊपरी सीमा जगह - एक 512 x 512 पिक्सेल छवि के लिए आम तौर पर लगभग 30 फ्रेम / सेक. विभिन्न फोकल विमानों से ऐसी छवियों का एक ढेर शारीरिक रूप से transl द्वारा प्राप्त किया जा सकता हैएक 30 फ्रेम ढेर के लिए प्रति सेकंड के आसपास एक मात्रा के अंतिम कब्जा दर के लिए अग्रणी, फ्रेम के बीच नमूना मंच या उद्देश्य लेंस ating. इसकी तुलना में, एक आधुनिक CMOS कैमरा पर आधारित एक holographic प्रणाली ही छवि आकार और संकल्प में 2,000 फ्रेम / सेकंड पर कब्जा कर सकते हैं, प्रत्येक फ्रेम नमूना मात्रा का एक स्वतंत्र स्नैपशॉट देने के लिए `ऑफ़लाइन 'कार्रवाई की है. दोहराना के लिए: एक प्रणाली एक फ्लोरोसेंट विषय 12 के holographic पुनर्निर्माण करती है जो विकसित किया गया है, हालांकि फ्लोरोसेंट नमूने, DIHM के लिए आवश्यक नहीं हैं. साथ ही तीन आयामी मात्रा जानकारी, DIHM भी मात्रात्मक चरण विपरीत छवियों 13 प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन लगता है कि यहाँ चर्चा के दायरे से बाहर है.
कच्चे DIHM डेटा छवियों दो आयामी हैं, और कुछ मामलों में ध्यान से बाहर है, हालांकि मानक माइक्रोस्कोप छवियों की तरह दिखेगा. DIHM और मानक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के बीच मुख्य अंतर यह है कि वस्तुओं है कि चारों ओर विवर्तन के छल्ले में निहित है मैंn देखने के क्षेत्र, इन रोशनी की प्रकृति के कारण हैं. आम तौर पर एक एलईडी या लेजर - DIHM उज्ज्वल क्षेत्र की तुलना में एक अधिक सुसंगत स्रोत की आवश्यकता है. होलोग्राम में विवर्तन के छल्ले एक तीन आयामी छवि को फिर से संगठित करने के लिए आवश्यक जानकारी होती है. प्रत्यक्ष फिटिंग और संख्यात्मक refocusing; DIHM डेटा की व्याख्या करने के लिए दो मुख्य दृष्टिकोण हैं. पहला दृष्टिकोण अग्रिम 3,4 में विवर्तन पैटर्न का गणितीय रूप में जाना जाता है, जहां के मामलों में लागू है, इस हालत क्षेत्रों, सिलेंडरों, और आधे विमान बाधाओं की तरह साधारण वस्तुओं का एक छोटा सा मुट्ठी से पूरा किया जाता है. सीधी फिटिंग भी वस्तु का अक्षीय स्थिति में जाना जाता है, जहां के मामलों में लागू है, और छवि छवि टेम्पलेट्स 14 की एक नज़र सारणी का उपयोग कर लगाया जा सकता है.
दूसरा दृष्टिकोण (संख्यात्मक refocusing) बल्कि अधिक सामान्य है और संख्यानुसार में ऑप्टिकल क्षेत्र के पुनर्निर्माण के लिए दो आयामी होलोग्राम छवि में विवर्तन के छल्ले के प्रयोग पर निर्भर करता हैनमूना मात्रा भर (मनमाने ढंग से स्थान दिया गया है) फोकल विमानों के एक नंबर. कई संबंधित तरीकों इस 6 करने के लिए मौजूद हैं, ली और Grier 5 द्वारा वर्णित के रूप में इस काम पर वापस प्रचार तकनीक रेले-Sommerfeld का उपयोग करता है. इस प्रक्रिया के परिणाम को मैन्युअल खुर्दबीन फोकल प्लेन (इसलिए नाम `संख्यात्मक refocusing ') को बदलने के प्रभाव को दोहराने कि छवियों का एक ढेर है. छवियों का एक ढेर उत्पन्न हो जाने के बाद, फोकल मात्रा में विषय की स्थिति प्राप्त किया जाना चाहिए. ऐसे स्थानीय तीव्रता विचरण या स्थानिक आवृत्ति सामग्री के रूप में छवि विश्लेषण heuristics, के एक नंबर, नमूना 15 में विभिन्न बिंदुओं पर ध्यान देने के तीखेपन यों को प्रस्तुत किया गया है. एक विशेष छवि मीट्रिक maximized (या कम से कम) है जब प्रत्येक मामले में, वस्तु फोकस में माना जाता है.
एक वस्तु 'फोकस' में है जहाँ एक विशेष विमान फोकल पहचान की तलाश है कि अन्य योजनाओं के विपरीत, इस काम में विधि पी बाहर उठाताफोकल विमानों की एक विस्तृत श्रृंखला में विस्तार कर सकते हैं जो ब्याज की वस्तु के अंदर है कि झूठ oints,. यह दृष्टिकोण विषयों की एक व्यापक श्रृंखला के लिए लागू है और इस तरह की छड़ के आकार कोलाइड, बैक्टीरिया की चेन या यूकेरियोटिक flagella के रूप में बढ़ाया, कमजोर बिखरने नमूने (चरण वस्तुओं), के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है. वस्तु फोकल हवाई जहाज़ से होकर गुजरता है जब इस तरह के नमूनों में छवि के विपरीत परिवर्तन, यह अन्य पर है अगर वस्तु फोकल हवाई जहाज़ और एक अंधेरे केंद्र के एक तरफ है, तो एक defocused छवि एक प्रकाश केंद्र है. वे फोकल हवाई जहाज़ में बिल्कुल झूठ जब शुद्ध चरण वस्तुओं कोई विपरीत करने के लिए कुछ किया है. इसके विपरीत उलटा की इस घटना में अन्य लेखकों 16,17 से चर्चा की और कारण विसंगति 18 GOUY चरण के लिए अंततः है किया गया है. यह कहीं और, तकनीक की सीमा में मूल्यांकन कर रहे हैं जहां होलोग्रफ़ी के संदर्भ में एक और अधिक कठोर आधार पर डाल दिया गया है, स्थिति में ठेठ अनिश्चितता पूर्वी वायु कमान में 150 एनएम (लगभग एक पिक्सेल) के आदेश का हैज दिशा 19. GOUY चरण विसंगति विधि तीन आयामों में विस्तारित वस्तुओं की संरचना का निर्धारण करने के लिए कुछ अच्छी तरह से परिभाषित DIHM योजनाओं में से एक है, लेकिन फिर भी कुछ वस्तुओं के पुनर्निर्माण के लिए समस्याग्रस्त हैं. (कैमरा तरफ इशारा करते हुए) ऑप्टिकल अक्ष के साथ सीधे झूठ वस्तुओं है कि सही फिर से संगठित करना मुश्किल है, वस्तु की लंबाई और स्थिति में अनिश्चितताओं बड़े हो जाते हैं. इस सीमा के कारण होलोग्राम (कैमरा रिकॉर्ड कर सकते हैं कि अलग ग्रे स्तर की संख्या) रिकॉर्डिंग पिक्सल के प्रतिबंधित थोड़ा गहराई से भाग में है. ब्याज की वस्तु फोकल हवाई जहाज़ के बहुत करीब है जब एक और समस्या पैदा करने वाले विन्यास होता है. इस मामले में, वस्तु की वास्तविक और आभासी छवियों की व्याख्या करना मुश्किल है कि जटिल ऑप्टिकल क्षेत्रों को जन्म दे रही है, करीब निकटता में पुनर्निर्मित कर रहे हैं. यहाँ एक दूसरा, थोड़ा कम महत्वपूर्ण चिंता का विषय है, जिसके परिणामस्वरूप विवर्तन किनारे इस मोटे छोटाबीजवाला inf छवि संवेदक की कम जगह ले, और वह यह है किormation एक गरीब गुणवत्ता पुनर्निर्माण की ओर जाता है.
अभ्यास में, एक साधारण ढाल फिल्टर रोशनी दिशा साथ मजबूत तीव्रता व्युत्क्रम पता लगाने के लिए तीन आयामी खंगाला संस्करणों के लिए लागू किया जाता है. तीव्रता अंधेरा, या इसके विपरीत करने के लिए प्रकाश से जल्दी बदलता है जहां क्षेत्र, फिर बिखरने क्षेत्रों के साथ जुड़े रहे हैं. इन व्यक्तिगत योगदान राशि आसानी से रेले-Sommerfeld वापस प्रचार पद्धति का उपयोग उलटा है जो कुल बिखरे हुए क्षेत्र देने के लिए, कमजोर बिखरने वस्तुओं अच्छी तरह से इस तरह के तत्वों को 20 साल की एक noninteracting संग्रह के रूप में वर्णित हैं. इस पत्र में, अक्षीय तीव्रता ढाल तकनीक स्ट्रेप्टोकोकस कोशिकाओं की एक श्रृंखला के लिए लागू किया जाता है. सेल शरीर चरण वस्तुओं रहे हैं (प्रजाति ई. कोलाई एक तरंग दैर्ध्य λ = 589 एनएम पर 1.384 होने के लिए 21 मापा एक अपवर्तक सूचकांक है, स्ट्रेप्टोकोकस तनाव समान होने की संभावना है) और में जुड़े चारों का एक उच्च तीव्रता श्रृंखला के रूप में दिखाई देते हैं धढाल फिल्टर करने के बाद ई नमूना मात्रा लागू किया गया है. इस फ़िल्टर की मात्रा के लिए लागू मानक सीमा और सुविधा निकासी तरीकों कोशिकाओं के अंदर क्षेत्र के लिए इसी बड़ा पिक्सल (voxels) की निकासी की अनुमति. इस पद्धति का एक विशेष लाभ यह अक्षीय दिशा में एक वस्तु की स्थिति का स्पष्ट पुनर्निर्माण की अनुमति देता है. इसी तरह के तरीकों (कम से कम, एक खुर्दबीन उद्देश्य के माध्यम से imaged वस्तु के करीब उन है कि रिकॉर्ड होलोग्राम,) इस विस्थापन के हस्ताक्षर का निर्धारण करने में असमर्थ होने से ग्रस्त हैं. रेले-Sommerfeld पुनर्निर्माण विधि भी है हालांकि हस्ताक्षर स्वतंत्र इस अर्थ में, ढाल आपरेशन हमें फोकल हवाई जहाज़ के ऊपर और नीचे कमजोर चरण वस्तुओं के बीच भेदभाव करने की अनुमति देता है.
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Protocol
1. सेटअप और डाटा अधिग्रहण
- जमे हुए शेयर में 22 से स्ट्रैपटोकोकस तनाव V4051-197 KTY माध्यम में चिकनी (तैराकी) कोशिकाओं की एक संस्कृति के लिए आगे बढ़ें. संतृप्ति के लिए, 35 डिग्री सेल्सियस और 150 rpm पर रातोंरात एक रोटरी प्रकार के बरतन में सेते हैं.
- संतृप्त संस्कृति के 500 μl के साथ ताजा KTY माध्यम के 10 एमएल टीका लगाना. कोशिकाओं λ = 600 एनएम (लगभग 5 x 10 8 कोशिकाओं / एमएल) में लगभग 1.0 की एक ऑप्टिकल घनत्व पहुँचने तक 35 डिग्री सेल्सियस और 150 rpm पर एक और 3.5 घंटे के लिए सेते हैं.
- चलता - फिरता कोशिकाओं के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए नए सिरे से मीडिया में 1:400 पतला.
- एक खुर्दबीन स्लाइड पर, ऊंचाई में 1 मिमी के आसपास (जैसे पेट्रोलियम जेली से भरा एक सिरिंज से) तेल की एक अंगूठी बनाने और केंद्र में नमूना समाधान की एक बूंद जगह है. सील करने के लिए किनारों पर शीर्ष और प्रेस हल्के ढंग पर एक कांच कवर, जगह है कि तरल सुनिश्चित करने स्लाइड और गिलास को कवर दोनों के साथ संपर्क में है. परिणामस्वरूप नमूना कक्ष arou होना चाहिएगहराई में एन डी 100-200 माइक्रोन.
- कांच और लेंस के बीच तेल में हवाई बुलबुले के गठन को रोकने के लिए, ध्यान से कवर गिलास नीचे का सामना करना पड़ के साथ माइक्रोस्कोप में नमूना कक्ष, जगह और.
- नमूना कक्ष के नीचे सतह पर खुर्दबीन ध्यान दें, और ध्यान केंद्रित करने के कंडेनसर लाना.
- मानक रोशनी बंद कर और माइक्रोस्कोप के कंडेनसर एपर्चर पीछे एलईडी सिर जगह है. अधिकतम उत्पादन के लिए एलईडी बिजली की आपूर्ति निर्धारित करें.
- अपनी पूरी हद तक कंडेनसर एपर्चर बंद करें, और यदि आवश्यक हो तो रोशनी उद्देश्य लेंस एपर्चर पर केंद्रित है, जब तक इसके आरोह में एलईडी कुहनी से हलका धक्का.
- कंप्यूटर और कैमरे पर जाएँ, और माइक्रोस्कोप के कैमरे बंदरगाह के लिए सभी प्रकाश पुनर्निर्देशित. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में फ्रेम दर और छवि का आकार समायोजित करें.
- अभी भी अच्छा विपरीत बनाए रखते हुए संभव के रूप में फ्रेम जोखिम समय के रूप में छोटा रखें. छवि satura नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक छवि तीव्रता हिस्टोग्राम जाँचेंटेड या तहत उजागर.
- यदि आवश्यक हो तो ब्याज की वस्तु से थोड़ा (आमतौर पर 10-30 माइक्रोन से) defocused है, जिससे कि माइक्रोस्कोप refocus. वस्तु और फोकल हवाई जहाज़ (यानी फोकल हवाई जहाज़ नमूना कक्ष के अंदर होना चाहिए) एक ही माध्यम में होना चाहिए.
2. पुनर्निर्माण
डाटा प्रोसेसिंग की दिशा में पहला कदम संख्यानुसार छवियों का एक ढेर का निर्माण, विभिन्न गहराई की एक श्रृंखला पर एक वीडियो फ्रेम refocus करने के लिए है. : इस काम को करने के लिए उपयोगकर्ता के अनुकूल सॉफ्टवेयर यहां पाया जा सकता है http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html (एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त कर लिया, और एक 60x तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस) उदाहरण छवियों के साथ और रे के लिए एक दृश्य फाइल प्रतिपादन पता लगाया.
- इंटरफेस पर प्रासंगिक बॉक्स में इनपुट ब्याज के फ्रेम और अलग छवि फ़ाइलों के रूप में अपने संबंधित पृष्ठभूमि,. एक पृष्ठभूमि छवि एक फ्रेम है च किairly होलोग्राम के अभाव में, वीडियो की पृष्ठभूमि का प्रतिनिधित्व करता है, और होलोग्राम स्थानीयकरण और विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकता है कि किसी भी निर्धारित पैटर्न शोर दबाने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
- कार्यक्रम चलाने से पहले स्क्रीन के बाएं हाथ की ओर वैश्विक सेटिंग्स बॉक्स में मान दर्ज करें. पहले तीन उत्पादन पर ढेर मापदंडों हैं: पहला फ्रेम का अक्षीय स्थिति ('फोकस प्रारंभ'); खंगाला ढेर में स्लाइस की संख्या ('कदम की संख्या'); ढेर में प्रत्येक टुकड़ा के बीच अक्षीय दूरी ('कदम आकार') .
- सही अनुपात के साथ वस्तुओं को फिर से संगठित करने के लिए, कदम आकार पार्श्व पिक्सेल अंतर के रूप में समान आकार का होना चाहिए. पिछले दो बक्से में 'पिक्सेल / माइक्रोन' बॉक्स, रोशनी तरंगदैर्ध्य और मध्यम अपवर्तनांक में कैमरे के पार्श्व नमूने आवृत्ति (1/pixel रिक्ति) दर्ज करें. कार्यक्रम के मूलभूत मूल्यों उदाहरण डेटा के पुनर्निर्माण के लिए उपयुक्त हैं.
- 'फ्लिप जेड ढाल' बटन दबाते हैं obje का केंद्रसीटी होलोग्राम में अंधेरा है (उदाहरण के फ्रेम 2005 और अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें).
- / बंद राज्य पर bandpass फिल्टर की जाँच करें (डिफ़ॉल्ट पर है). ढाल फ्लिप स्विच नीचे एक बॉक्स में स्थित यह वैकल्पिक bandpass फिल्टर, शोर पिक्सल से योगदान दबाने के लिए जिम्मेदार है. bandpass फिल्टर तुरंत पीढ़ी के बाद प्रत्येक छवि टुकड़ा करने के लिए लागू किया जाता है.
- राज्यों से / (डिफ़ॉल्ट पर है) पर मध्यवर्ती उत्पादन स्विच की जाँच करें. इंटरमीडिएट विश्लेषण कदम के रूप में असम्पीडित, दो उत्पादन वीडियो में लिखा है AVI फ़ाइलें:. पहले refocused ढेर ('_stack.avi' में समाप्त होने वाले फ़ाइल नाम), दूसरा अक्षीय ढाल ऑपरेशन के बाद ढेर है (फ़ाइल नाम में समाप्त होने वाले 'है _gradient.avi '). आदर्श रूप में, इस दूसरे पर ढेर ब्याज की वस्तु एक काले रंग की पृष्ठभूमि के खिलाफ एक चमकदार वस्तु के रूप में प्रकाश डाला शामिल होंगे.
- मुख्य विंडो में सभी मापदंडों, प्रेस 'भागो' स्थापित करने के बाद. चयनित फ्रेम सॉफ्टवेयर की मुख्य बॉक्स में दिखाई देगा.
- का प्रयोग करें(बाएं क्लिक) में ज़ूम और (+ लेफ्ट क्लिक पाली) बाहर ज़ूम करने के लिए छवि के बाईं ओर उपकरण पट्टी पर पाया ताल उपकरण. ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र का चयन करने के लिए उपकरण पट्टी पर आयत उपकरण का उपयोग करें. इस पुनर्निर्माण का अनुकूलन के रूप में होगा, आयत के अंदर संभव के रूप में होलोग्राम के किनारे के रूप में कई कैप्चर.
- दो छवि के ढेर उत्पन्न करने के लिए 'प्रक्रिया' बटन दबाएँ. (कम से मुक्त करने के लिए प्राप्त किया जा सकता है, जो ImageJ का उपयोग परिणामस्वरूप ढेर निरीक्षण http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). ब्याज की वस्तु को स्पष्ट रूप से ढाल छवि ढेर में देखा जा सकता है, तो ऑब्जेक्ट निर्देशांक निकालने के लिए अगले कदम के लिए आगे बढ़ें.
3. प्रतिपादन
- फ्रेम refocusing इसके अलावा, इस कार्यक्रम एक्स, वाई, जेड ब्याज की वस्तु में प्रत्येक voxel के लिए निर्देशांक ढूँढ सकते हैं. इस समारोह में सक्षम करने के लिए 'फ़ीचर निष्कर्षण' बटन दबाएँ.
- के लिए, ( घर output.inc: सी उदाहरण के लिए) विस्तार सहित एक पथ, दर्जआउटपुट फाइल निर्देशांक. 'उत्पादन शैली समन्वय' बॉक्स में 'पीओवी रे' शैली का चयन करें. इस कार्यक्रम (से प्राप्त किया जा सकता है जो मुक्त पीओवी रे raytracing सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग कर कल्पना की जा सकती है कि एक वस्तु फाइल लिखने के लिए कारण बनता है http://www.povray.org/ ).
- ऊपर खंड 2 के रूप में छवियों पुनर्संसाधन. कार्यक्रम 'आउटपुट समन्वय' बॉक्स में फ़ाइल नाम के लिए लिखा (एक्स, वाई, जेड) की एक श्रृंखला चयनित आरओआई में निर्देशांक, प्रदान करेगा. वस्तु निर्देशांक की निकासी के ढेर पीढ़ी की तुलना में काफी लंबे समय तक ले जाता है.
- निर्देशांक बस उत्पन्न फ़ाइल के रूप में (पुनर्निर्माण कोड के साथ आपूर्ति) नमूना पीओवी रे फ़ाइल उसी फ़ोल्डर में है कि सुनिश्चित करें. नमूना. पीओवी फ़ाइल को संपादित करें और लाइन पर औंधा अल्पविराम में फ़ाइल नाम की जगह
# "MYFILE.inc" शामिल
पुनर्निर्माण कोड द्वारा उत्पन्न डेटा फ़ाइल के नाम के साथ. - एक बिटमैप छवि प्रस्तुत करने के लिए पीओवी रे में 'भागो' बटन पर क्लिक करें. टीवह कैमरे की स्थिति, प्रकाश और बनावट विकल्पों पीओवी रे में संभव अनुकूलन के कुछ ही रहे हैं, विवरण के लिए ऑनलाइन दस्तावेज़ देखें.
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Representative Results
DIHM की क्षमताओं का प्रदर्शन करने के लिए, प्रयोगों स्ट्रैपटोकोकस बैक्टीरिया की एक श्रृंखला पर प्रदर्शन किया गया. श्रृंखला में ही लंबे समय तक 10.5 मिमी मापा, और सीमा 0.6-1 मीटर में व्यास के साथ 6-7 sphero-बेलनाकार कोशिकाओं (श्रृंखला में कोशिकाओं के दो विभाजित करने के लिए बंद कर रहे हैं) से बना था. 1 ए आंकड़े और मुख्य अंतरफलक दिखाने 1B पुनर्निर्माण और प्रतिपादन सॉफ्टवेयर की. संख्यात्मक refocusing प्रक्रिया के उदाहरण एक स्थानिक bandpass फिल्टर लागू किया गया है जहां, चित्रा 2 में देखा जाता है. 3 चित्रा 2 में छवियों पर ढाल फिल्टर का प्रभाव दिखाता है. इन चित्रों में से दोनों के निर्माण के लिए कच्चे डेटा उदाहरण फ्रेम 108 के रूप में कोड डाउनलोड के साथ बंडल हैं. अन्त में, चित्रा 4 खंगाला ज्यामिति पर अच्छे और खराब गुणवत्ता के डेटा का असर दिखाता है. यह पिछले चित्रा में दोनों तख्तों सैम के एक वीडियो से लिया गयाकोशिकाओं के ई श्रृंखला (पहले दो अंकों में से एक के लिए एक अलग श्रृंखला). एक अच्छा पुनर्निर्माण ज्यादातर मामलों में संभव है, लेकिन श्रृंखला पुनर्निर्माण अंत पर उन्मुख है जब फोकल हवाई जहाज़ पर एक बड़े दौर वस्तु देने में विफल रहता है. इस विफलता मोड ऑप्टिकल अक्ष के साथ उन्मुख वस्तुओं की विशेषता है. पैमाने के लिए, कंप्यूटर प्रदान की गई छवियों में, फर्श पर चेक एक ओर 1 माइक्रोन हैं. इस विधि की सटीक और सटीकता की एक अधिक विस्तृत चर्चा के लिए, पाठकों विल्सन और जांग 19 से परामर्श करना चाहिए.
चित्रा 1. सॉफ्टवेयर इंटरफेस. पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर का मुख्य इंटरफ़ेस पैनल में दिखाया गया है (एक), जहाँ फ़ाइल इनपुट बॉक्स, वैश्विक सेटिंग मानकों और अन्य महत्वपूर्ण विशेषताएंपाठ में निर्दिष्ट प्रकाश डाला गया है. पैनल (ख) कार्यक्रम के डिफ़ॉल्ट दृश्य संपादक में, पीओवी रे के लिए उदाहरण के दृश्य फाइल से पता चलता है. संकेत लाइन पर औंधा अल्पविराम के बीच फाइल नाम पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर से आउटपुट फाइल करने के लिए सेट किया जाना चाहिए. यह ठीक से पुनर्निर्माण कल्पना करने के क्रम में कैमरे के स्थान और दिशा (संकेत प्रासंगिक अनुभाग) बदलने के लिए आवश्यक हो सकता है. आगे के निर्देश के लिए ऑनलाइन पीओवी रे दस्तावेज़ देखें. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. संख्यानुसार refocused छवियों के उदाहरण हैं. बाएं हाथ के कॉलम शो में आंकड़ा पैनल संख्यानुसार refocused(एक्स, वाई) खंगाला मात्रा (संकेत के रूप में) के भीतर हाइट्स की एक किस्म पर विमानों. नीचे बाएँ हाथ की छवि पृष्ठभूमि डेटा द्वारा के माध्यम से विभाजित मूल होलोग्राम डेटा से पता चलता है. सही पर बड़े पैनल में एक ही ढेर के माध्यम से एक (एक्स, जेड) टुकड़ा से पता चलता है. Z-अक्ष के साथ विपरीत उलटा की बात स्पष्ट रूप से छवि के ऊपर से जिस तरह के बारे में एक तिहाई पर देखा जा सकता है. इस विमान (एक्स, जेड) बाईं ओर (एक्स, वाई) विमानों intersects जहां बड़ी छवि दिखाने पर लाल लाइनों. इसी प्रकार, छोटे पैनल में नीले लाइनों (एक्स, जेड) टुकड़ा के चौराहे दिखा. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. ढाल फ़िल्टर छवियों के उदाहरण हैं.0; इस छवि चित्रा 2 में डेटा को ढाल फिल्टर लगाने के प्रभाव दिखाता है. ब्याज की वस्तु एक सममित उज्ज्वल स्थान के रूप में प्रकाश डाला है कि ध्यान दें. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 4. अच्छा और गरीब गाया छवियों के लिए नेतृत्व कि डेटा का उदाहरण. पैनल (क) और (ग) कोशिकाओं का एक tumbling श्रृंखला की एक ही वीडियो से लिया गया में दो छवियों. पैनल में डेटा (एक) श्रृंखला सीधे ऑप्टिकल अक्ष के साथ उन्मुख नहीं है, जिसमें इस श्रृंखला में सबसे फ्रेम के प्रतिनिधि हैं. वस्तु के आकार और स्थिति ईमानदारी में प्रतिलिपि हैंपैनल में प्रतिपादन (ख). इस विन्यास में वस्तुओं के पुनर्निर्माण के लिए कठिन हैं, और पैनल (डी के रूप में देखा आमतौर पर, करीब फोकल हवाई जहाज़ को एक 'बूँद' उपज; पैनल (ग) के मामले में, श्रृंखला क्षण भर के फोकल हवाई जहाज़ को अंत पर उन्मुख किया गया था ). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम के लिए एक स्थिर प्रयोगात्मक स्थापना से छवियों की सटीक कब्जा है. गरीब पृष्ठभूमि डेटा के साथ, उच्च निष्ठा पुनर्निर्माण असंभव के बगल में है. यह इस खंगाला छवि नीचा कर सकते हैं, के रूप में (उद्देश्य के पीछे के माध्यम से देख जब एक अंधेरे वलय के रूप में दिखाई दे) एक आंतरिक चरण विपरीत तत्व के साथ उद्देश्य लेंस से बचने के लिए भी महत्वपूर्ण है. ब्याज की वस्तु विवर्तन किनारे के कुछ जोड़े (एक उपयुक्त अनुमानी defocused पैटर्न केंद्रित वस्तु की 10 बार रैखिक आयाम है प्रकट करना चाहिए अपनी छवि में दिखाई दे रहे हैं कि फोकल हवाई जहाज़ से दूर पर्याप्त होना चाहिए - उदाहरण के डेटा देखना ). फोकल हवाई जहाज़ को भी करीब वस्तुओं रूप में पहले वर्णित, जुड़वां छवि और नमूना कलाकृतियों से पीड़ित हैं. यह सही ढंग से refocus दूरी का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण कारक है, क्योंकि यह कैमरे के पिक्सेल अंतर का एक अच्छा लक्षण वर्णन है करने के लिए भी महत्वपूर्ण है. अक्सर, कैमरा documentatआयन विशिष्टताओं में 'पिक्सेल आकार' की सूची होगी, यह एक छोटे से अस्पष्ट हो सकता है, कैमरे के कुछ प्रकार (CMOS कैमरा विशेष रूप से) प्रकाश के प्रति संवेदनशील नहीं हैं कि पिक्सल के बीच अंतरिक्ष के महत्वपूर्ण क्षेत्रों में हो सकता है क्योंकि. इस जानकारी को प्राप्त करने के लिए सबसे विश्वसनीय तरीका इस तरह के एक यूएसएएफ 1951 संकल्प चार्ट के रूप में, एक मानक अंशांकन लक्ष्य का उपयोग करें, और सीधे एक छवि से नमूने आवृत्ति (सुक्ष्ममापी प्रति पिक्सेल की संख्या) को मापने के लिए है.
रंग रोशनी की सीमा में, एक DIHM प्रणाली का संकल्प अंततः उद्देश्य लेंस (एनए) और रोशनी (λ) 23,24 की तरंग दैर्ध्य के संख्यात्मक एपर्चर द्वारा निर्धारित है. Laterally अलग कर अंक कम से कम एक दूरी Δ लैट = 'λ' / 2NA अलावा वे अलग से हल किया जा रहे हैं अगर झूठ चाहिए. इसी प्रकार, आदर्श मामले में अक्षीय संकल्प सीमा 'Δ' कुल्हाड़ी = λ / 2 (एनए) 2 द्वारा दिया जाता है. DIHM में एक एलईडी का उपयोग कर, की गहराई की एक सीमा होती हैimaged किया जा सकता है कि मात्रा, यह अंततः ऑप्टिकल प्रणाली और रोशनी का जुटना द्वारा निर्धारित किया जाता है. प्रभाव के इस प्रकार का एक विस्तृत ब्यौरा कहीं 25 पाया जा सकता है, हालांकि इस 'संवेदनशील' की मात्रा का एक विशिष्ट गहराई, एक एलईडी के लिए 100-200 माइक्रोन के आसपास है. संवेदनशील मात्रा छवि के आकार के द्वारा अन्य दो दिशाओं में सीमित है. सॉफ्टवेयर काफी मजबूत है हालांकि, कुछ कार्रवाई न कि स्मृति की भूखी हैं. एक छवि पर ढेर पुनर्निर्माण और तीव्रता ढाल प्राप्त करने के लिए दोनों काफी रूढ़िवादी हैं, लेकिन एक ढाल ढेर से ब्याज की एक विशेषता के निर्देशांक निकालने (कई गीगाबाइट करने के लिए कई सौ मेगाबाइट) स्मृति का एक बहुत उपभोग कर सकते हैं. यह अंत करने के लिए, यह प्रत्येक आयाम में 100-150 पिक्सल के लिए ब्याज की खंगाला मात्रा को सीमित करने की सलाह दी जाती है. कोड रैम से अधिक 4 जीबी (सॉफ्टवेयर को 12 जीबी के साथ एक मशीन पर लिखा गया था) के साथ एक 64 बिट ऑपरेटिंग सिस्टम पर चलाया जाता है अगर यह प्रतिबंध, कुछ हद तक आसान हो सकता हैगणना समय निषेधात्मक बन सकता है.
आसानी मिलीमीटर - अप करने के लिए - और कम बढ़ाई पर एक बड़ा तंत्र की जांच, एलईडी प्रकाश स्रोत फोकल हवाई जहाज़ से एक बहुत अधिक से अधिक गहराई पर झूठ बोल रही वस्तुओं के पुनर्निर्माण की अनुमति देता है जो एक लेजर द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है. एक एकल मोड ऑप्टिकल फाइबर मिलकर लेजर डायोड का उपयोग इस तरह के एक सेटअप के साथ प्रारंभिक प्रयोगों, खंगाला गहराई ऊपर एक 10X खुर्दबीन उद्देश्य का उपयोग 10 मिमी की अनुमति दी. क्षेत्र की यह वृद्धि गहराई हालांकि, एक कीमत पर आता है, लेजर के बड़े जुटना लंबाई छवि शोर, ऑप्टिकल रेलगाड़ी में विभिन्न सतहों से विशेष रूप से प्रतिबिंब की ओर जाता है ये प्रभाव कुछ हद तक भरपाई कर रहे हैं (नमूना कक्ष, लेंस सतहों, आदि की दीवारों.) तंत्र एक अच्छी पृष्ठभूमि छवि प्राप्त करने के लिए पर्याप्त रूप से स्थिर है. हालांकि, बाहरी प्रतिबिंब चरणों की एक अज्ञात वितरण किया है, तो उनके परिमाण संदर्भ लहर (unscattered प्रकाश), reconstru के बराबर है अगरction असंभव हो सकता है. अन्य लेखकों उदाहरण के लिए, लेजर मौजूदा 26 ड्राइविंग या जुटना 27 कम करने के लिए एक घूर्णन जमीन ग्लास स्क्रीन का उपयोग modulating द्वारा, एक लेजर प्रकाश स्रोत का जुटना संशोधित किया है.
सबसे अच्छा डेटा विश्लेषण का अंतरिम चरणों निरीक्षण द्वारा हल कर रहे हैं holographic पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए देखने का एक समस्या निवारण की दृष्टि से, सबसे अधिक समस्याओं का सामना करना पड़ा. खंगाला छवि ढेर के मामले में, वस्तुओं 'deblur' संतुलित रूप से वे ध्यान में आने चाहिए. विवर्तन किनारे जोरदार विषम देखो, एक गरीब या ऑफसेट पृष्ठभूमि छवि को दोष करने के लिए अक्सर है. पुनर्निर्माण के लिए छवि इसी तरह की छवियों का एक ढेर से लिया गया है, उदाहरण के लिए एक चलती वस्तु का एक वीडियो अनुक्रम से एक फ्रेम के लिए एक पृष्ठभूमि छवि कभी कभी वीडियो के सभी भर में (मतलब या मंझला द्वारा) के औसत से पिक्सेल मूल्यों को प्राप्त किया जा सकता है तख्ते. विषय वीडियो दृश्य के दौरान काफी चलता है, इसकीकिसी भी एक पिक्सेल मूल्य के लिए योगदान छोटा है और प्रमुख योगदान विषय अनुपस्थित था जिसमें अनछुए पृष्ठभूमि फ्रेम से आ जाएगा. एक वस्तु के निर्देशांक ठीक से नहीं दिए गए हैं जहां मामले में, ढाल छवि ढेर एक उपयोगी निदान हो सकता है. वस्तु ढाल छवि ढेर में एक चमकदार अंगूठी से घिरा हुआ एक शून्य के रूप में देखा जाता है, तो ढाल फिल्टर फ़्लिप किया जाना चाहिए और छवि reprocessed. शुरूआत में उल्लेख किया है, रेले-Sommerfeld पुनर्निर्माण विधि फोकल हवाई जहाज़ से एक वस्तु की दूरी के हस्ताक्षर के प्रति असंवेदनशील है. दो कमजोर बिखरने वस्तुओं फोकल हवाई जहाज़ से लेकिन विपरीत दिशा में एक ही दूरी रखते हैं, वे खंगाला छवि ढेर में एक ही स्थान पर फोकस में आ जाएगा. हालांकि, उनके अक्षीय तीव्रता पैटर्न उलट होगा. मूल रूप से (उलटा माइक्रोस्कोप ज्यामिति के संबंध में) फोकल हवाई जहाज़ के ऊपर पाया वस्तु के केंद्र में फोकस पीओ से गुजर रहा पर प्रकाश से अंधेरे में परिवर्तितविपक्षी, अंधेरे से फोकल हवाई जहाज़ परिवर्तन नीचे वस्तु को प्रकाश में जबकि. ढाल फ्लिप विकल्प इसलिए एक स्पष्ट अक्षीय समन्वय देने, ('पर' के लिए सेट ढाल फ्लिप के साथ) फोकल प्लेन (डिफ़ॉल्ट) ऊपर या फोकल हवाई जहाज़ से नीचे वस्तुओं या तो निकालता है. विधि लेकिन कम अच्छी तरह से बड़ा polystyrene कणों के लिए, व्यास में 1 माइक्रोन के लिए ऊपर polystyrene microspheres के लिए बहुत अच्छी तरह से काम करता है, इस सख्ती से ही कमजोर बिखरने वस्तुओं के लिए रखती है कि ध्यान दें. जैविक नमूने आम तौर पर उनके अपवर्तक सूचकांक मध्यम आसपास (polystyrene 1.5 के करीब एक अपवर्तनांक है) के करीब हैं, के रूप में ज्यादा कमजोर बिखरने प्रदर्शन, इतना बड़ा वस्तुओं का अध्ययन किया जा सकता है.
भविष्य दिशाओं के संदर्भ में, इस सॉफ्टवेयर के तीन आयामों में तैराकी सूक्ष्मजीवों या कोलाइडयन कण की ट्रैकिंग सक्षम करने के लिए, एक वीडियो में कई फ्रेम पर कार्रवाई के लिए बढ़ाया जा सकता है. तकनीक देता है कि उच्च फ्रेम दर भी तेजी से तैरना नज़र रखने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैइस तरह के ऊपर 150 मीटर / सेकंड 28 के लिए गति में तैरती जो समुद्र में रहने वाली विब्रियो alginolyticus, के रूप में mers,. एकल कक्षों के सूक्ष्म तैराकी trajectories पहले कुछ समय पहले 29 पर नज़र रखी, लेकिन यह आम तौर पर विशेष उपकरण की आवश्यकता थे. GOUY चरण विसंगति लंबी दूरी पर एकल कक्षों का सरल ट्रैकिंग के लिए उधार देता है, लेकिन अलग अलग व्यक्तियों की तैराकी व्यवहार के बीच सहसंबंध की जांच का अवसर न केवल दृष्टिकोण. यह अब तक तकनीकी कारणों के लिए दुर्गम किया गया है कि तीन आयामी ज्यामिति, डेटा पर विशेष रूप से निर्भर करता है.
शुरूआत में उल्लेख किया है, प्रतिदीप्ति confocal माइक्रोस्कोपी के साथ एक तुलना आदर्श नहीं है, लेकिन confocal प्रणालियों की सर्वव्यापकता सार्थक तीन आयामी इमेजिंग पहलू की तुलना में आता है. वास्तव में, DIHM confocal माइक्रोस्कोपी के पूरक है, दोनों की तुलनात्मक फायदे और नुकसान कर रहे हैं. DIHM बहुत तेजी से डेटा acquisitio अनुमति देता हैn दर: प्रति सेकंड कई हजार संस्करणों एक काफी तेजी से कैमरा दिया, दिनचर्या है. यह अनुमति देता धीमी confocal प्रणालियों की क्षमता से परे है जो (उदाहरण के लिए) कई स्विमिंग बैक्टीरिया, की ट्रैकिंग. यहां तक कि एक तेजी से कैमरे के साथ, DIHM confocal माइक्रोस्कोपी से सस्ता परिमाण के एक आदेश है, और एक तीन आयामी मात्रा के लिए डेटा भंडारण और डेटा बैकअप पर मांगों को कम करने, एक दो आयामी छवि में संग्रहित किया जा सकता है. DIHM अधिक आसानी से स्केलेबल मायने में कम आवर्धन, बड़े नमूनों और लंबे समय तक काम दूरी के साथ काम करने के लिए तुच्छ है. Confocal माइक्रोस्कोपी अभी भी हालांकि, घने या जटिल नमूने में ऊपरी हाथ है. उदाहरण के लिए, एक घने कोलाइडयन निलंबन में, एकाधिक बिखरने holographic पुनर्निर्माण व्यावहारिक रूप से असंभव बना देता है, फ्लोरोसेंट उत्सर्जन या प्रतिबिंब मोड में या तो एक confocal प्रणाली ऐसी प्रणालियों 9 का अध्ययन करने के लिए बेहतर अनुकूल होगा. इसके अलावा, confocal माइक्रोस्कोपी जो च में प्रायोगिक प्रणाली के लिए एक अधिक प्राकृतिक विकल्प हैluorescent लेबलिंग केंद्रीय महत्व का है. प्रतिदीप्ति होलोग्रफ़ी परीक्षण की एक श्रृंखला के साथ काम करने के लिए दिखाया गया है हालांकि संग्रह क्षमता तक एक अच्छा confocal प्रणाली के नीचे है कि वर्तमान में 30 विषयों. इसके अलावा, इस तरह के प्रायोगिक प्रणाली वर्तमान में विशेषज्ञ ऑप्टिकल उपकरण और संचालित करने के लिए अनुभव की आवश्यकता होती है, उम्मीद है कि वे आगे के विकास के साथ और अधिक व्यापक रूप से उपलब्ध हो जाएगा.
संक्षेप में, DIHM उच्च गति पर सूक्ष्म वस्तुओं की उच्च संकल्प तीन आयामी चित्र प्राप्त करने की क्षमता में अद्वितीय है. हम एक मौजूदा माइक्रोस्कोप को न्यूनतम संशोधनों के साथ nonspecialist करने के लिए इस तकनीक सुलभ बना देता है कि उपयोगकर्ता के अनुकूल सॉफ्टवेयर प्रदान करते हैं. इसके अलावा, पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर आसानी से उपलब्ध कंप्यूटर प्रतिपादन सॉफ्टवेयर के साथ आसानी से एकीकृत करता है. यह किसी भी कोण से देखा जा सकता सूक्ष्म विषयों के सहज दृश्य, की अनुमति देता है. Involv कई फास्ट सूक्ष्म प्रक्रियाओं के तीन आयामी प्रकृति को देखते हुए(उदाहरण के लिए, यूकेरियोटिक flagella या सिलिया पिटाई बैक्टीरिया तैराकी, या कोलाइड diffusing) कमजोर बिखरने वस्तुओं आईएनजी, इस तकनीक के क्षेत्र की एक विस्तृत श्रृंखला में रुचि का होना चाहिए.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
लेखकों सूक्ष्मजीवविज्ञानी तैयारी के साथ सहायता के लिए लिंडा टर्नर धन्यवाद. RZ और LGW हार्वर्ड और CGB पर रोलैंड संस्थान द्वारा वित्त पोषित किया गया बॉर्डर्स कार्यक्रम, ब्राजील (प्रोसेस # 7340-11-7) के बिना एक capes फाउंडेशन के विद्वान, विज्ञान के रूप में वित्त पोषित किया गया
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon Corp. | ||
| LED | Thorlabs | M660L3 | emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm |
| LED power supply | Thorlabs | LEDD1B | |
| Thread Adapter | Thorlabs | SM2T2 | |
| Thread Adapter | Thorlabs | SM1A2 | |
| Frame Grabber board | EPIX | PIXCI E4 | |
| High-Speed CMOS camera | Mikrotron | MC-1362 |
References
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