Summary
이 논문은 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 microindentation을 통해 살아있는 세포의 기계적 특성을 특성화 할 수있는 프로토콜을 보여줍니다.
Abstract
세포와 세포 외 기질 (ECM)의 기계적인 특성은 줄기 세포 분화, 종양 형성, 상처 치유 등 많은 생물 학적 과정에 중요한 역할을한다. 세포와 ECM의 강성의 변화는 종종 세포 생리학 또는 조직의 질병의 변화의 징후입니다. 따라서, 세포 강성 세포 배양의 상태를 평가하는 인덱스입니다. 세포와 조직의 강성을 측정하는 적용 방법의 무리 사이, 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 마이크로 들여 쓰기 안정적으로 살아있는 세포의 강성을 측정하는 방법을 제공합니다. 이 방법은 널리 금속 표면에서 부드러운 생물학적 조직과 세포에 이르기까지 다양한 재료에 대한 마이크로 스케일 강성의 특성을 적용하고있다. 이 방법의 기본 원리는 선택한 형상 AFM 팁과 셀을 들여 쓰기 AFM 캔틸레버의 휨에서 적용되는 힘을 측정하는 것입니다. 헤르츠 모드로 강제 압입 곡선을 피팅해당 팁 지오메트리 난 재료 강성의 정량적 측정을 제공 할 수 있습니다. 이 논문은 AFM을 이용하여 살아있는 세포의 강성을 특성화하는 과정을 보여줍니다. MATLAB 루틴을 사용하여 AFM 교정 과정, 강제 곡선 수집, 데이터 분석 등 주요 단계를 설명합니다. 이 방법의 제한 사항에 대해서도 설명합니다.
Introduction
각각의 세포와 그 주변의 세포 외 기질의 기계적 특성, 특히 강성 (ECM)은 세포 성장, 운동, 분열, 분화 및 조직 항상성 등 많은 생물 학적 과정에 중요한 1. 그것은 세포 기계적 강성은 주로에 의해 결정되는 증명되었다 악틴 및 중간 필라멘트의 체외 네트워크에서의 기계적 시험의 골격, 악틴 및 중간 필라멘트 및 그와 관련된 다른 단백질 특히 네트워크 2. 결과는 세포 역학의 골격 구조와 미리 스트레스에 크게 의존하는 것이 좋습니다 세포 골격. 살아있는 세포의 3-5 강성은 다음 골격 구조 6, 미오신 활동 7 및 다른 많은 세포 과정을 평가하는 지표로 간주됩니다. 더 중요한 것은, 세포 기계적 성질의 변화는 종종 밀접하게 연관된다는 것을 발견하는종양의 형성과 전이 등 다양한 질병 상태와 ated 8-10 모니터링 살아있는 세포의 기계적 강성 따라서 세포 생리학을 모니터링하는 새로운 방법을 제공 할 수 있습니다. 감지 및 질병에게 8을 진단;. 및 약물 치료의 효과를 평가하기 11 12
입자 추적 미세 유변학, 13-16 자기 왜곡 세포 계측법, 17 micropipette의 열망 18,19 및 microindentation 20-22 등 다양한 방법이 세포의 탄력성을 측정하기 위해 개발되었습니다. 입자 추적 미세 유변학은 세포의 cytoskeleton 세포 내부 또는 기준점 표지에 주입 미크론 형광 입자 하나의 열 진동을 추적합니다. 세포의 23 탄성과 점성 특성이 변동 방산 정리를 사용하여 측정 된 입자의 변위에서 계산됩니다. 14,23이 방법은 수 지역의 동시 측정셀에 다른 장소에서 높은 공간 해상도를 가진 기계적 성질. 그러나 세포에 형광 입자를 주입하면 세포 기능의 변화, 세포 골격 구조, 따라서 세포 역학으로 이어질 수 있습니다. micropipette의 열망 방법은 피펫으로 세포막의 작은 조각을 빨아 1 ~ 5 μm의에 이르기까지 직경 마이크로 피펫에 부정적인 압력을 적용합니다. 세포의 강성이 적용 부정적인 압력과 세포막의 변형. 18이 방법은 계산한다, 그러나, 세포를 통해 강성의 불균일 분포를 감지 할 수 없습니다. 자기 왜곡 세포 계측법 (MTC)는 세포막에 부착 된 초 상자성 구슬 토크를 생성하는 자기장을 적용합니다. 17 셀 강성이 적용되는 토크와 세포막의 왜곡 변형 사이의 관계에서이 방법으로 파생됩니다. 그것은 MTC 방법에 자석 구슬의 위치를 제어하기 어렵고, 또한 challengi입니다높은 해상도 왜곡 변형의 특성을 NG. Microindentation은 세포에 구멍을 뚫을 수있는 잘 정의 된 지오메트리 압자를 적용합니다. 들여 쓰기 힘과 세포의 결과 들여 쓰기는 종종 헤르츠 모델의 예측을 수행합니다. 세포의 영의 계수는 헤르츠 모델로 피팅에 의해 강제 압입 곡선으로부터 계산 될 수있다. 이 방법은 널리 접점 결정, 헤르츠 모델의 적용, 물리적으로 세포를 손상하는 가능성의 불확실성 등의 한계에도 불구하고 조직과 세포의 기계적 특성을 시험하기 위하여 적용되었습니다. microindentaion 20 많은 장치 사이에서 원자 힘 현미경 (AFM)은 시판되고 널리 살아있는 세포와 조직 21,24-27의 기계적 성질을 특성화하기 위해 적용되었습니다.
이 논문은 세포 역학의 특성을 정신 병원 MFP3D 바이오 AFM을 사용하는 절차를 보여줍니다. AFM하지에LY 세포의 고해상도 지형을 제공하지만 또한 널리 조직 세포의 기계적 특성을 특성화하기 위해 적용되었습니다. AFM 들여 쓰기의 원리는 그림 1에 나와 있습니다. AFM 캔틸레버는 위의 몇 마이크로 미터에서 셀을 접근, 세포와의 접촉을 만든다; 들여 쓰기 셀 캔틸레버 편향이 미리 선택된 세트 포인트에 도달 할 수 있도록하고, 멀리 셀에서 가져옵니다. 그림 1과 같이이 과정에서 캔틸레버의 처짐은 그 위치의 함수로 기록됩니다. 세포와 접촉하기 전에, 캔틸레버는 명백한 편향하지 않고 중간에 이동합니다. 셀 캔틸레버 굴절과 편향 신호 증가에 들여 쓰기를합니다. 캔틸레버들은 편향은 셀에 적용된 힘에 비례하도록 탄성 빔으로 모델링된다. 최대 캔틸레버 편향을 설정하여 샘플에 적용되는 힘의 최대 크기는 D를 방지하기 위해 제한됩니다세포 amage. 셀에 팁 들여 쓰기는 세포의 강성을 추출 헤르츠 모델에 적합하다 그림 1에서 C를 가리 B 지점에서 힘 곡선의 부분입니다.
그림 1. AFM의 microindentation와 힘 곡선의 해석의 그림입니다. 상단 패널은 피에조 스캐너에 의한 AFM 캔틸레버의 움직임을 보여줍니다. 캔틸레버 Z와 캔틸레버 편향 신호 D의 수직 위치는 과정에서 기록됩니다. 캔틸레버 포인트, 셀 위의 몇 마이크로 미터부터 시작합니다. 셀을 접근하면서 끝이 세포와 접촉에 와서 B 지점에 도달 할 때까지, 샘플 들여 쓰기 δ 제로 남아있다. 플롯의 점 B의 좌표는 중요한 값이다데이터 분석, (Z 0, D 0>)로 표시. B에서 C로, 셀에 캔틸레버 들여 쓰기 캔틸레버 편향 대상으로 최대의 들여 쓰기 힘과 상수 캔틸레버 봄의 비율로 설정되어 세트 포인트에 도달 할 때까지. 편향 신호가 설정 한 최대 값에 도달하면, 캔틸레버 다음 셀은 종종 팁 - 샘플 부착으로 인해 아래를 뽑아 점 D에 철회 세포를 반환에서 전자의 초기 위치로 분리되어 있습니다. 오른쪽 패널은 들여 쓰기 및 기록 Z와 D 신호 사이의 관계를 보여줍니다. 왼쪽 하단 패널에있는 스프링 상수가 M / 0.07N로 측정하는 대표 힘 곡선, 외팔보의 최대 들여 쓰기의 음모로는 최대의 들여 쓰기 힘에 적용될 수 있도록 17 나노로 설정되어 있습니다 예제 1.2 윈은입니다. 들여 쓰기를하는 동안 키 위치가 표시됩니다.
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Protocol
1. 캔틸레버의 스프링 상수 보정
- 제조업체의 지침에 따라 AFM으로 캔틸레버를 넣습니다. 그것은 어떤 실험을하기 전에 에탄올로 캔틸레버 홀더를 청소해야합니다. 이 AFM 측정시 문화 세균 오염을 제한하는 데 도움이됩니다.
- InvOLS을 (역 광 레버 감도) 보정합니다. 이 매개 변수는 캔틸레버 편향 나노 미터 당 다이오드 응답 (볼트)의 양을 설명합니다.
- 샘플 무대에 깨끗한 유리 슬라이드를로드 한 후 제조업체의 지침에 따라 AFM 헤드를 설치하고 레이저 빔과 정렬을 조정합니다. 유리 슬라이드에 AFM 팁을 갖습니다.
- 압전 철회로, -2의 포토 다이오드 독서 미러를 다시 정렬 V. +2의 트리거 포인트 (최대 다이오드 응답)에 힘 분광 측정을 수행 V.
- 압전 철회로, -2의 포토 다이오드 독서 미러를 다시 정렬 V. FO를 수행+2 V. 노트의 트리거 포인트 (최대 다이오드 응답)로 경찰 분광 측정 : 여기 전압 값은 정신 병원 AFM에 따라 다릅니다. 이 값은 제조업체에서 제공하는 사양에 따라 설정해야합니다.
데이터 수집이 완료되면, 힘 곡선의 확고한 접촉 영역을 확대. V / 뉴 멕시코에있을 것이다 경사를 찾기 위해이 지역에 선형 피팅을 수행합니다. 이 값의 역수는 캔틸레버 다이오드 앙상블의 광 감도를 설명합니다. - 0의 무료 편향에 거울 정렬을 다시 V.
- 캔틸레버의 스프링 상수 보정합니다. 열 조정 방법은 캔틸레버 28 스프링 상수를 결정하는 데 사용됩니다.
- InvOLS을 보정 한 후, 팁과 샘플 사이의 상호 작용이 없다는 것을 같은 샘플 단계에서 스캐너를 멀리 올립니다.
- 열 데이터를 캡처 시작합니다. 이 과정에서, 외팔보의 열 진동 기록 병입니다라. AFM 소프트웨어는 열 진동 및 데이터 창에서 플롯을의 파워 스펙트럼을 분석합니다.
- 데이터 수집의 몇 초 후에, 스프링 상수를 결정하기 위해 낮은 주파수 (기본 공명) 피크를 중심으로 데이터 세그먼트에 적합을 수행합니다.
2. 샘플을로드
- AFM 무대에서 접시 히터 액세서리를 설치, 이미 장착되지 않은 경우.
- 37 ° C 온도를 설정하고 안정적인 열적 평형에 도달하도록 시스템을위한 20 분을 기다립니다.
- AFM 무대에서 배양 접시를 놓고 접시 히터와 함께 제공되는 클램프를 사용하여 고정합니다. 그것은 인큐베이터에서 접시를 제거하고 세포에 외상을 방지하기 위해 무대에 배치 사이의 시간을 최소화하는 것이 중요합니다. 30 분 이상 측정, CO 2 독립 매체는 일반 문화 매체를 대체하는 데 사용되어야한다.
- T의 끝을 37 ° C 배양 배지의 작은 방울을 적용그는 AFM 캔틸레버와 팁 그냥 액체에 빠져들 때까지 AFM 헤드를 낮 춥니 다.
- 상위 뷰 CCD 카메라를 사용하여 외팔보 (액체 정렬 때문에 매체의 굴절률의 변화, 공기 다를 것이다)에 레이저 빔을 맞 춥니 다.
- 배양 접시의 청정 지역에서 AFM 팁을 갖습니다.
- 액체 환경에서 캔틸레버 감도, 위에서 설명한대로 InvOLS 교정을 수행합니다.
참고 : 세포가 수화를 배양하는 경우)는, InvOLS의 교정은 세포 배양 매체로 가득 배양 접시의 바닥면에 대하여 사전에 수행해야합니다. 세포 샘플을 전환 할 때 특별한주의가 캔틸레버와 레이저 빔 정렬을 변경하지 지불해야합니다. B) InvOLS는 레이저 정렬에 변화가있을 때마다 다시 보정해야합니다. C) 그것은 또한 몇개의 교정 곡선의에서 값의 평균으로 InvOLS을하는 것이 좋습니다각 교정은 다른 InvOLS를 생성 인스. InvOLS의 변동은 평균값을 비교하지만, 작은 수 있습니다. 예를 들어, 100 배 0.06 N 액체 / m의 스프링 상수와 브루 커 DNP-10 캔틸레버를 교정하는 0.5 나노 / 표준 편차, 66.3 nm의 / V의 평균 InvOLS 값을 생성 V.
3. 셀의 들여 쓰기 힘 곡선 수집
- 들여 쓰기 셀을 선택합니다. 광학 현미경의 도움으로, 끝이 요정 핵 지역에 위치한되도록 셀 위의 캔틸레버를 배치하는 단계를 이동합니다. 캔틸레버의 위치를 정밀 조정은 X와 Y 스캐너에 오프셋을 적용하여 수행 할 수 있습니다.
참고 : AFM 캔틸레버가 대상 셀을 선택 샘플 스테이지를 이동하는 동안 시료 표면에서 인출 할 수있다. 시료 표면이 평평하지 않을 수 있기 때문에 이것은 샘플로 노크에서 캔틸레버를 보호합니다. - 분광학 모드를 강제로 전환합니다. 들여 쓰기를 설정유체 효과를 방지하기 위해 충분히 낮은 1-10 μm의 / 초 범위 내 속도.
- 세포에 손상을 방지하기 위해 최대의 들여 쓰기 힘을 제한하는 편향 트리거 포인트를 설정합니다. 편향 신호의 모든 드리프트를 교정 할 상대 트리거링 옵션을 선택합니다. 2 윈은의 최대 힘은 대부분의 샘플에 대한 좋은 출발점입니다. 이 값은, 그러나, 샘플 강성에 따라 조정되어야한다. 부드러운 샘플 낮은 값은 샘플 과도한 들여 쓰기를 방지하기 위해 사용되어야한다. 뻣뻣한 샘플은 높은 값이 측정 들여 쓰기를 생성하는 데 사용되어야한다.
- 끝이 완전히 힘의 측정과 세포에서 분리 될 수 있도록 충분히 큰 힘 거리를 설정합니다. 보통, 힘 거리가 5 μm의에서 설정됩니다.
- 하나의 힘 곡선을 취할 수있는 AFM을 명령.
- 각 셀의 요정 핵 영역의 다른 위치에서 적어도 세 힘 커브를 수집합니다. 그것은 여러를 취할 유용하지만너무 많은 힘 곡선을 가지고 신뢰할 수있는 통계 자료에 대한 각 셀 곡선, AFM 프로브에서 때문에 스트레스 세포 강성의 변화로 이어질 수 있습니다.
- 데이터 수집이 완료되면, 팁을 철회하고, 특정 샘플 조건에서 세포의 강성 좋은 통계 데이터를 필요에 따라 반복은 많은 셀 3.1-3.6 단계를 반복합니다. 보통 30 세포는 각 조건에 대해 측정됩니다.
단일 셀 내에서 강성 분포의 특성을 강제 맵 모드가 적용됩니다. 강제 맵 모드에서, 관심의 영역을 포함하는 스캔 크기를 설정, 적절한 해상도를 설정하고, 하나의 힘 곡선 선택한 것과 같은 들여 쓰기 매개 변수를 설정, AFM는 정의 된 샘플 영역에 걸쳐 래스터하고 하나의 힘 곡선을 샘플 영역의 각 픽셀에서.
4. 데이터 분석
기록 된 힘 곡선은 세포의 강성을 계산하는 사용자 정의 MATLAB 프로 시저를 사용하여 분석. 다음은 MATLAB 절차에 대한 간략한 설명입니다 :
- . MATLAB 프로그램은 접점이 린 등에 의해 게시 방법에서 채택 된 알고리즘 29을 사용하여 (그림 1 참조) Z0와 D0 좌표를 식별합니다 :
- 최대 세트, 힘 곡선의 각 데이터 포인트에 대해, 관심 지점의 왼쪽에있는 데이터의 선형 피팅을 수행하고, 헤르츠 모델은 오른쪽 (접점의 초기 지점으로 선택한 점 사용)에 적합 최대 들여 쓰기 (200-300 nm의 권장).
- 각 포인트에 모두 적합의 상대 RMS 오차를 계산하고이 값을 합계입니다.
- 최소 총 피팅 오류를 달성 점 접촉의 초기 점으로 선택됩니다.
참고 : 계산 시간이 아니라 선형 전체 힘 곡선을 스캔보다 황금 섹션 검색을 구현하여 줄일 수 있습니다. - 샘플 변형 δ와 힘 F를 들여 다음과 같이 계산된다 :
- 최소 제곱 피팅 대 F에 맞게 적용 포스트 접촉 영역에서 δ 데이터, Z ≥ Z 0,의 탄성 계수, 세포의 E를 추출하는 헤르츠 모델 :
여기서 V는 푸 아송의 비율입니다.
참고 : δ는 샘플의 두께 (셀 높이)의 10 % 이상이면, 측정 셀 강성 기판 강성에 의해 영향을받습니다. 요정 핵 영역의 두께는 일반적으로 몇 마이크로 미터의 순서입니다. 따라서, F-δ 곡선의 첫 번째 200 ~ 300 nm의은 헤르츠 모델에 적합하다.
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Representative Results
그림 2a는 각각 플라스틱 표면, 영의 계수 3000 아빠와 17,000 아빠의 폴리 아크릴 아마이드 젤에 배양 3T3 섬유 아세포에서 가져온 세 가지 대표적인 힘 곡선을 보여줍니다. 조심스럽게 곡선의 접점을 식별 한 후, 세포 변형 함수로 들여 힘은 그림 2B에 나타내었다. 0.3 윈은, 3 kPa의 폴리 아크릴 아마이드 젤에 배양 세포에 피라미드 모양의 팁 들여 3 마이크로 미터보다 작은 크기의 힘 아래. 반면, 강제보다 1.6 윈은이 같은 팁을 사용하여 일반 배양 접시에서 자란 세포로 500 나노 미터 들여 쓰기해야합니다. 부드러운 폴리 아크릴 아마이드 젤에 배양 세포가 딱딱 배양 접시에 배양 한 세포보다 부드러운 것을이 그래프에서 분명하다. 헤르츠 모델 포스 δ 곡선의 첫 번째 세그먼트 (δ <30 nm의) 피팅은 각각 10 kPa의 1.2 kPa의, 1.10 kPa의 이러한 세 가지 세포의 탄성 계수를 제공합니다. cultur의 셀전자 요리는 폴리 아크릴 아마이드 젤에 배양 세포보다 100 배 더 뻣뻣합니다. 솔론 등은. 유사한 결과에게 25보고있다. 그들은 섬유 아 세포가 적극적으로 그들에 부착 기판의 강성을 일치하기 위해 cytoskeletons을 경직 것으로 나타났습니다. 딱딱한 기판 30에서 배양 할 때 많은 다른 세포 유형은 엄격한 될 것으로보고있다.
그것은 들여 쓰기 세포에서 소성 변형을 일으킬 수 있습니다하는 것이 중요합니다, 이는 보라색 곡선에 도시 된 바와 같이 꼬임을 발생합니다. 일반적으로, 이러한 곡선은 데이터 분석에서 제외되어야한다. 그러나 곡선은 여전히 꼬임 피팅 데이터 범위를 초과하는 경우 세포의 강성을 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 보라색 곡선 꼬임은 약 400 nm에서 발생합니다. 이 곡선은 여전히 1.2 kPa의의 강성 값을 산출하기 헤르츠 모델까지만 δ에 = 30 nm의 데이터를 피팅하여 분석 할 수 있습니다. 그것은 일에 따라 "트리거 포인트"를 조정하는 것이 중요합니다전자 샘플 강성. 예를 들어, 파란색 곡선은 3 kPa의 폴리 아크릴 아마이드 겔에서 배양 소프트 셀에서 가져온 것입니다. 셀에 5 nm의 AFM 팁 들여 3 마이크로 미터에서 상대 편향 트리거 포인트 설정. 그것이 파열 세포막을 수 있고 세포를 죽일 때문에 그런 큰 들여 쓰기, 셀 강성 측정하는 동안 방지해야한다. 힘 곡선 취득시 팁 속도와 데이터 수집 속도 등 많은 다른 요인 취득한 힘 곡선을 따라서 셀 (31)의 결과 강성의 품질에 영향을 미칠 수 있습니다. 신뢰할 수있는 측정을하기 위해 그것을 비선형 증가 후 접촉 부분에 다음 평평한 사전 접촉 부분이 그림 2a에 표시된 빨간색 곡선으로 "깨끗한"힘 곡선을 얻기 위해 모든 매개 변수를 조정할 필요가 있습니다.
그림 3A는 세포 배양 접시에 3T3 섬유 아세포에서 형광 이미지를 보여줍니다. 세포가 GFP vimentin에 형질 전환됩니다중간 필라멘트의 유형입니다. AFM 강제 매핑은 32 × 32 픽셀의 해상도로, 80 μm의 영역하여 80 μm의에서 수행되었습니다. 그 결과 강성 맵은 그림 3b에 표시됩니다. 강성은 셀에 걸쳐 다릅니다. 그리고, lamellipodium 지역은 치열한 핵을 둘러싸고 요정 핵 지역보다 엄격한 더 이질적이다.
그림 2. 힘 곡선 데이터 및 분석 강제 압입 곡선.) 유리 배양 3T3 섬유 아세포 취득 세 가지 대표적인 힘 곡선 데이터 세트 (빨강), 17 kPa의 폴리 아크릴 아마이드 젤 (보라색), 3 kPa의 폴리 아크릴 아마이드 젤 (파란색). 곡선 접점 (Z 0, D 0) 좌표의 원점 (0,0)에 위치하도록 이동됩니다시스템입니다. B) 들여 쓰기 - 힘 곡선은 들여 쓰기의 첫 번째 300 nm의 사용 헤르츠 모델에 들여 데이터) 및 피팅 계산. ) B에 삽입 들여 쓰기의 첫 번째 300 nm의에 대한 헤르츠 모델 적합도를 보여줍니다 원은 실험 데이터이고, 선은 맞는 데이터를 나타냅니다. 캔틸레버의 스프링 상수는 0.062 N이 경우에 / m이다.
그림 3. ) 3T3 섬유 아세포의 형광 이미지 GFP vimentin에 형질 전환. 세포 만이 부분이 이미지에 표시됩니다. 스케일 바는 20 μm의 같은 영역. B) 32 × 32 픽셀 강성 맵을 나타냅니다. 각 픽셀은 2.5 μm의를 나타냅니다.
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Discussion
AFM 들여 쓰기 방법은 살아있는 세포의 기계적 성질을 특성화하는 장점이 있습니다. piconewton 레벨 32 힘을 측정 할 수있는 자기 왜곡 세포 계측법 및 광학 핀셋보다 덜 민감이기는하지만, AFM은 힘의 범위를 비교 피코 뉴턴의 수십에서 나노 뉴턴의 수백에 이르는 샘플에서 저항 힘을 감지 할 수 마이크로 피펫 19을 사용하여 셀에 적용 할 수 있습니다. 힘의이 범위는 셀 19의 모든 종류의 측정 변형을 만들 요구에 맞는. 높은 공간 해상도는 가능한 서브 미크론 수준에서 33 조직 및 단일 세포 내에서 이질성을 특성화 할 수 있습니다. 또한 실시간 라이브 셀 측정을 할 수 있습니다. 생물 학적 샘플 용으로 설계된 여러 AFM 모델은 유체 환경에서 작동 할 수 있으며 정확한 온도 제어를 제공 가열 샘플 단계가 장착되어, 가능한 생리적 인 ENVI를 유지하고측정 기간 동안 살아있는 세포에 대한 ronment. AFM 들여 쓰기가 성공적으로 세포 유형, 25,34-36의 범위의 기계적 성질을 측정하기 위해 적용하고 세포 분화와 관련된 세포의 기계적 특성과 다양한 병에 걸린 상황에서 평가 변화를 광범위하게 사용하고있다. 30,37
힘 곡선의 강성을 계산하는 중요한 단계는 끝이 첫 번째 셀과 접촉하게 포인트를 식별합니다. 접점의 불확실성은 탄성 계수 31에 영향을 줄 수 있습니다. 뻣뻣한 재료, 편향 신호가 갑자기 팁 샘플에 접촉했을 때 증가하고 접점이 쉽게 곡선의 고비로 식별됩니다. 이러한 급격한 전환점은, 그러나, 종종 낮은 세포 강성 (그림 2 참조)에 의한 세포 강제 곡선에 표시되지 않습니다. MATLAB 코드는 정확히 힘 곡선의 접점을 찾기 위해 개발린 등에 의해 제안 된 알고리즘을 사용하여 부드러운 샘플에서. 29 코드는 우리가 자동으로 접점을 검색하고 헤르츠 모델을 들여 데이터를 피팅하여 데이터 분석의 과정을 자동화 할 수 있도록 부드러운 샘플의 힘 곡선을 처리 할 수 있습니다. MATLAB 코드는 강성 대량 레올 로지 측정하여 7.2 kPa의 수에 측정했던의 폴리 아크릴 아미드 젤의 같은 위치에서 찍은 60 힘 곡선의 접점을 결정하기 위해 적용됩니다. 코드는 다음과 곡선 점을 문의 발견했습니다. 접점 위치 변화의 범위는 15 나노 미터보다 작습니다. 이 접점에 근거하여 계산 된 평균 강성이 6.9 kPa의이며, 표준 편차는 0.2 kPa의, 그리고 변화 0.6 kPa의의 최대 범위입니다. 이 실험의 결과는 측정 된 강성의 불확실성을 평가하는 척도를 제공합니다. 평균 값진의 10 % 미만 강성 불확실성의 접점 결과에서 15 nm의 불확실성전자. 편향 신호의 매우 낮은 수준의 부드러운 젤의 경우, 접점에서의 불확도는 30 나노, 30 %로 높은 강성의 불확실성에 이르게만큼 높은 수 있습니다. 코드는이 문서에 대한 보충으로 사용할 수 있습니다.
AFM은 안정적으로 대부분의 조직과 세포에 대한 강성의 범위를 포함하는 100 개 미만 파에서 10 6 파에 이르기까지 강도를 측정 할 수 있습니다. 신뢰할 수있는 측정을 위해, 그것은 잘 샘플 강성에 일치 스프링 상수 AFM 캔틸레버를 선택하는 것이 중요합니다. 캔틸레버가 너무 딱딱 할 때, 그 편향을 감지하기에 너무 작하고 세포를 손상시킬 수 있으며, 캔틸레버가 너무 부드러운 경우에는 신뢰할 수있는 재료의 특성을 얻기 위해 충분히 셀을 들여하지 않으며 그것의 열 진동 힘 곡선을 지배 할 수 있습니다. 피라미드 팁 0.06 N / m의 캔틸레버는 뻣뻣한 배양 접시에서 배양 대부분의 세포 유형에 적용 할 수 있습니다. 이 캔틸레버는, 그러나,에서 배양 세포를 측정하는 적용되지 않습니다부드러운 기질. 그림 2에서 보듯이, 3000 아빠 폴리 아크릴 아마이드 젤에 배양 세포는 3 μm의 들여 쓰기 캔틸레버의 5 nm의 편향을 생성하는 데 필요한 것을 아주 연약하다. 힘 곡선은 사전 접촉 및 사후 접촉 영역 사이에 약간의 차이가 너무 평평. 이 접점에서 큰 불확실성 따라서 결과 강성 값에 이르게한다. 부드러운 캔틸레버를 사용하면 약간 사전 접촉 후 접촉 영역 사이의 대비를 향상시킵니다. 측정하는 등 부드러운 재료는 큰 구형 팁 캔틸레버하는 것이 좋습니다. 직경 10 마이크로 미터의 구형 팁 0.06 N / m의 캔틸레버는 구형 팁 100 아빠 캔틸레버보다 강성이 낮은 여러 공급 업체에서 구입과 샘플을 측정하기 위해 적용 할 수 있습니다. 또한 주문품 일 수 tipless 외팔보에 접착 마이크로 있습니다. 구형 팁 큰 편향 신호를 제공하고 세포막의 손상을 방지합니다. However, 그들은 세포와의 접촉 면적에 따른 고해상도 강성 매핑에 적용 할 수 없습니다. 표 1은 세포의 강성 측정을 위해 권장 AFM 프로브의 목록을 제공합니다.
| 모델 | 스프링 상수 (N / M) | 팁 유형 | 팁 반경 (NM) |
| 브루 커 DNP10-D | 0.06 | 피라미드 | 20 |
| 브루 커 MLCT-B/C/E | 0.01/0.02/0.03 | 피라미드 | 20 |
| Novascan PT.GS | 0.01/0.03/0.06 | 유리 구 | 2,000 / 5,000 / 10,000 |
| Novascan PT.PS | 0.01/0.03/0.06 | 폴리스티렌 구체 | 1,000 / 4,500 / 10,000 |
표 1. 자체세포의 들여 쓰기 적용 스프링 상수 및 팁 형상과 AFM 프로브의 성귀.
제시된 방법의 한계도 표시되어야한다. 들여 쓰기 데이터에 맞게 적용되었습니다 헤르츠 모델은 단순한 모델입니다. 그것은 대칭 인 덴터에 의한 순수 탄성 물질의 극소의 들여 쓰기위한 강제 압입 관계를 예측한다. 헤르츠 모델의 가정의 일부는 세포의 들여 쓰기 적용되지 않습니다.
세포가 이종 (그림 3 참조) 비선형 탄성 동안 헤르츠 모델은 균질 선형 탄성 물질을 가정합니다. lamellipodium 지역에서는 의한 액틴 세포 골격의 이종 구조에 다소 불균일입니다. 세포의 기계적 강도가 상대적으로 균일 한 perinuclear 지역에서 얻은 세 개 이상의 힘 곡선에서 추출 된 평균 강도로보고됩니다. 25,36은 networ을 재구성 된악틴 및 중간 필라멘트 캔자스 긴장 보강 재료입니다 즉, 그들은 큰 변형에서 엄격한 수 있습니다. 38,39 이러한 비선형 탄성 살아있는 세포 관찰하지만, 헤르츠 모델에서 설명되지되었습니다. 보고 된 세포의 강성 비선형 탄성 효과를 제한하려면 들여 쓰기 데이터의 첫 번째 300 nm의은 헤르츠 모델에 적합하다.
또한 재료가 순수 신축성이있는 헤르츠 모델로 간주됩니다. 그러나 세포와 그 세포 골격은 점탄성 물질은 측정의 시간 간격에 따라 강성이다. 짧은 시간 규모에서, 캔틸레버 편향는 주로 세포의 탄성 응답에서 비롯됩니다. 긴 시간 규모에서, 그러나, 샘플 섬뜩한과 부드러운 응답을 제공합니다. AFM 들여 쓰기의 시간 척도는 끝 속도에 의해 제어됩니다. 힘 곡선이 동일한 들여 쓰기 VELO로 취득하는 경우 따라서, 세포의 강성 관찰 된 차이에만 의미가 있습니다도시. 양적 세포의 빈도에 따라 점탄성을 추출하려면, AFM "강제 변조"방법은 크게 들여 쓰기 21,27에 고주파 작은 진폭 진동을 적용하여 개발되었습니다.
헤르츠 모델의 무한한 샘플 두께의 가정은 셀에 적용되지 않습니다. 세포는 일반적으로 perinuclear 지역의 두께가 몇 마이크로 미터와 라멜라 지역에서 두꺼운 몇 백 나노 미터이다. 수정은 유한 샘플의 두께를 고려하여 제작되었습니다. 힘 매핑에서 얻은 31,40 데이터 들여 데이터와 셀 높이 데이터가 모두 포함되어 있습니다. 지역의 시료 두께는 고도 데이터로부터 계산 될 수있다. 미래의 작업은 강제 매핑 데이터에 대한 분석 시료 두께 보정을 구현해야합니다.
요약하면, 본 연구는 정신 병원 MFP3D 바이오 원자 힘 MICR을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 강성을 특성화하는 프로토콜을 제시oscope. AFM의 작동 원리와 MATLAB 데이터 분석 절차는 모든 다른 AFM 모델에 적용 할 수 있습니다. 최근 몇 년 동안, 시야, 공 초점 현미경, 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRF) 등의 광학 현미경 기술은 기계적 자극에 대한 세포의 실시간 이미징 AFM과 결합되어있다. 41,42이 설정은 또한 동시에 측정 할 수 세포 역학과 세포 골격 구성 요소의 이미지. 지방 세포 골격 구성 요소의 배포에 대한 로컬 강성 데이터 상호 연계하여 골격 구성 요소가 세포 역학에 기여하는 방법에 대한 통찰력있는 정보를 제공합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는이 논문에서 사용 된 세포주를 제공하기 위해 펜실베니아 대학에서 박사 폴 Janmey 감사합니다. QW는 AFM 기술에 대한 통찰력있는 논의를 위해 JF 바이 필드와 에반 앤더슨을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atomic Force Microscope | Asylum Research | MFP3D-BIO |
References
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Wagner, O. I., et al. Softness, strength and self-repair in intermediate filament networks. Exp. Cell Res. 313, 2228-2235 (2007).
- Wang, N., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 7765-7770 (2001).
- Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282, 606-616 (2002).
- Kasza, K. E., et al. Filamin A is essential for active cell stiffening but not passive stiffening under external force. Biophysical Journal. 96, 4326-4335 (2009).
- Elson, E. L. Cellular mechanics as an indicator of cytoskeletal structure and function. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 397-430 (1988).
- Schafer, A., Radmacher, M. Influence of myosin II activity on stiffness of fibroblast cells. Acta Biomaterialia. 1, 273-280 (2005).
- Guck, J., et al. Optical deformability as an inherent cell marker for testing malignant transformation and metastatic competence. Biophysical Journal. 88, 3689-3698 (2005).
- Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2, 780-783 (2007).
- Plodinec, M., et al. The nanomechanical signature of breast cancer. Nature Nanotechnology. 7, 757-765 (2012).
- Rotsch, C., Radmacher, M. Drug-induced changes of cytoskeletal structure and mechanics in fibroblasts: an atomic force microscopy study. Biophysical Journal. 78 (00), 520-535 (2000).
- Cross, S. E., Jin, Y. S., Lu, Q. Y., Rao, J., Gimzewski, J. K. Green tea extract selectively targets nanomechanics of live metastatic cancer cells. Nanotechnology. 22, 215101 (2011).
- Hoffman, B. D., Crocker, J. C. Cell mechanics: dissecting the physical responses of cells to force. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 259-288 (2009).
- Hoffman, B. D., Massiera, G., Van Citters, K. M., Crocker, J. C. The consensus mechanics of cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10259-10264 (2006).
- Lau, A. W., Hoffman, B. D., Davies, A., Crocker, J. C., Lubensky, T. C. Microrheology, stress fluctuations, and active behavior of living cells. Physical Review Letters. 91, 198101 (1981).
- Liu, J., et al. Microrheology probes length scale dependent rheology. Physical Review Letters. 96, 118104 (2006).
- Deng, L., et al. Fast and slow dynamics of the cytoskeleton. Nature Materials. 5, 636-640 (2006).
- Oh, M. J., Kuhr, F., Byfield, F., Levitan, I. Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness. J. Vis. Exp. (67), e3886 (2012).
- Hochmuth, R. M.
- Levental, I., et al. A simple indentation device for measuring micrometer-scale tissue stiffness. J. Phys-Condens. Mat. 22, (2010).
- Mahaffy, R. E., Park, S., Gerde, E., Kas, J., Shih, C. K. Quantitative analysis of the viscoelastic properties of thin regions of fibroblasts using atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86, 1777-1793 (2004).
- Radmacher, M. Measuring the elastic properties of biological samples with the AFM. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine: The Quarterly Magazine of the Engineering in Medicine & Biology Society. 16, 47-57 (1997).
- Crocker, J. C., Hoffman, B. D. Multiple-particle tracking and two-point microrheology in cells. Methods in Cell Biology. 83, 141-178 (2007).
- Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. J. Vis. Exp. (54), e2911 (2011).
- Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophysical Journal. 93, 4453-4461 (2007).
- Wu, H. W., Kuhn, T., Moy, V. T. Mechanical properties of l929 cells measured by atomic force microscopy: Effects of anticytoskeletal drugs and membrane crosslinking. Scanning. 20, 389-397 (1998).
- Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope. Biophysical Journal. 70, 556-567 (1996).
- Levy, R., Maaloum, M. Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods. Nanotechnology. 13, 33-37 (2002).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129, 430-440 (2007).
- Davis, J. T., Wen, Q., Janmey, P. A., Otteson, D. C., Foster, W. J. Muller cell expression of genes implicated in proliferative vitreoretinopathy is influenced by substrate elastic modulus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 3014-3019 (2012).
- Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: Measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Method Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
- Lele, T. P., et al. Tools to study cell mechanics and mechanotransduction. Methods in Cell Biology. 83 (07), 443-472 (2007).
- A-Hassan, E., et al. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74, 1564-1578 (1998).
- Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. Non-Hertzian approach to analyzing mechanical properties of endothelial cells probed by atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128, 176-184 (2006).
- Xiong, Y., Lee, A. C., Suter, D. M., Lee, G. U. Topography and nanomechanics of live neuronal growth cones analyzed by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 96, 5060-5072 (2009).
- Byfield, F. J., et al. Absence of filamin A prevents cells from responding to stiffness gradients on gels coated with collagen but not fibronectin. Biophysical Journal. 96, 5095-5102 (2009).
- Cross, S. E., et al. AFM-based analysis of human metastatic cancer cells. Nanotechnology. 19, 384003 (2008).
- Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A.
- Wen, Q., Janmey, P. A.
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (02), 2798-2810 (2002).
- Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J. Vis. Exp. (44), e2072 (2010).
- Lim, S. M., Kreipe, B. A., Trzeciakowski, J., Dangott, L., Trache, A. Extracellular matrix effect on RhoA signaling modulation in vascular smooth muscle cells. Exp. Cell Res. 316, 2833-2848 (2010).
