Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Summary

Dieses Papier zeigt ein Protokoll, um die mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mittels Mikroindentation mit einem Atomic Force Microscope (AFM) zu charakterisieren.

Abstract

Mechanische Eigenschaften der Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM) spielt eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen einschließlich Stammzelldifferenzierung, Tumorentstehung und Wundheilung. Änderungen in der Steifigkeit von Zellen und ECM sind oft Anzeichen von Veränderungen in der Zellphysiologie oder Krankheiten in Geweben. Somit ist Zelle Steifigkeit ein Index, um den Status von Zellkulturen zu bewerten. Unter der Vielzahl von Methoden angewandt, um die Steifigkeit von Zellen und Geweben zu messen, bietet Mikro-Vertiefung mit einem Atomic Force Microscope (AFM) einen Weg, um zuverlässig zu messen die Steifigkeit der lebenden Zellen. Diese Methode wurde in großem Umfang angewendet, um die mikro-Steifigkeit für eine Vielzahl von Materialien, angefangen von Metalloberflächen weichen biologischen Geweben und Zellen zu charakterisieren. Das Grundprinzip dieses Verfahrens ist es, Gedankenstrich eine Zelle mit einer AFM-Spitze aus Geometrie und messen die aufgebrachte Kraft aus der Biegung des AFM-Cantilever. Montage der Kraft-Einzug Kurve nach Hertz-Modusl für die entsprechende Geometrie der Spitze geben können quantitative Messungen der Steifigkeit des Materials. Dieses Papier zeigt das Verfahren, um die Steifigkeit von lebenden Zellen mit AFM charakterisiert. Die wichtigsten Schritte einschließlich des Prozesses der AFM Kalibrierung, Kraft-Kurve Erwerb und Datenanalyse unter Verwendung eines MATLAB Routine demonstriert. Einschränkungen dieser Methode werden ebenfalls diskutiert.

Introduction

Mechanische Eigenschaften, insbesondere Festigkeit, der einzelnen Zellen und der sie umgebenden extrazellulären Matrix (ECM) sind entscheidend für viele biologische Prozesse wie Zellwachstum, Motilität, Teilung, Differenzierung und Gewebshomöostase. ¹ Es wurde gezeigt, dass die Zelle mechanische Steifigkeit wird hauptsächlich bestimmt durch das Zytoskelett, insbesondere die Netzwerke von Actin und intermediären Filamenten und andere Proteine ​​mit ihnen verbunden sind. ^{2 ergibt sich} aus mechanischen Tests in vitro Netzwerke von Actin und Intermediärfilamenten vermuten, dass die Zelle Mechanik weitgehend abhängig von der Zytoskelett-Struktur und der Vorspannung ist in das Zytoskelett. ^3-5 Steifigkeit von lebenden Zellen wird dann als Index für die Zytoskelett-Struktur ^6, Myosin Aktivität ⁷ und viele andere zelluläre Prozesse evaluieren angesehen. Noch wichtiger ist, sind Veränderungen in der Zelle mechanische Eigenschaften auch oft festgestellt, dass nahe stehendeATED mit verschiedenen Krankheitszuständen wie Tumorbildung und Metastasenbildung ^8-10 Kontrolle der mechanischen Steifigkeit von lebenden Zellen kann daher einen neuen Weg zur Zellphysiologie zu überwachen;. zu erkennen und zu diagnostizieren Krankheiten ^8;. und um die Wirksamkeit der medikamentösen Behandlungen ausgewertet ^{11 , 12}

Mehrere Verfahren, einschließlich Teilchen Tracking Mikrorheologie, ^13-16 magnetischen Verdrehen Zytometrie ¹⁷ Mikropipette Streben ^18,19 und Mikroindentation ^20-22 wurden entwickelt, um die Elastizität der Zellen zu messen. Particle Tracking Mikrorheologie zeichnet die thermischen Schwingungen von entweder Submikron fluoreszierenden Teilchen in Zellen oder Bezugsmarkierungen in der Zelle Zytoskeletts injiziert. ²³ elastischen und viskosen Eigenschaften von Zellen aus den gemessenen Verschiebungen Teilchen mit der Fluktuations-Dissipations-Theorem berechnet. ^14,23 Dieses Verfahren ermöglicht gleichzeitige Messungen der lokalenmechanische Eigenschaften mit hoher räumlicher Auflösung an verschiedenen Orten in einer Zelle. Jedoch kann Einspritzen fluoreszierenden Teilchen in die Zellen auf Veränderungen in der zellulären Funktion, Zytoskelett-Struktur und damit die Zellmechanik führen. Die Mikropipette Aspiration Methode gilt Unterdruck in einer Mikropipette mit einem Durchmesser im Bereich von 1 bis 5 um ein kleines Stück von der Zellmembran in die Pipette saugen. Zelle Steifigkeit von der angelegten Unterdruck und Zellmembran Verformung. ¹⁸ Dieses Verfahren berechnet wird, kann jedoch nicht erkennen, die heterogene Verteilung der Steifigkeit über die Zelle. Magnetische Verdrehen Durchflusszytometrie (MTC) gilt Magnetfeld Drehmoment an superparamagnetische Kügelchen, die an der Zellmembran zu erzeugen. ¹⁷ Handy Steifigkeit wird bei diesem Verfahren aus der Beziehung zwischen der angelegten Drehmoments und der Drehverformung der Zellmembran abgeleitet. Es ist schwierig, die Position der magnetischen Kügelchen in der MTC Verfahren zu steuern, und es ist auch challenging, die Verdrehungsdeformation mit hoher Auflösung zu charakterisieren. Mikroindentation gilt ein Stempel mit wohldefinierten Geometrie in die Zelle zu stanzen. Das Einrücken Kraft und die daraus resultierende Vertiefung in Zellen folgen oft die Vorhersage der Hertz-Modell. Young-Modul von Zellen aus den Kraft-Vertiefung Kurven durch Aufstecken auf die Hertz-Modell berechnet werden. Diese Methode wurde in großem Umfang eingesetzt, um die mechanischen Eigenschaften von Gewebe und Zellen trotz seiner Grenzen wie die Unsicherheit in Kontaktstelle Bestimmung Anwendbarkeit der Hertz-Modell, und das Potential zu Schäden am Zellen zu testen. Unter den vielen Geräten für microindentaion ^20, ist der Atomic Force Microscope (AFM) im Handel erhältlich und wurde in großem Umfang angewendet, um die mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen und Geweben ^21,24-27 charakterisieren.

Dieses Papier zeigt das Verfahren der Verwendung eines Asylum MFP3D-Bio AFM zu Zelle Mechanik charakterisieren. AFM nicht aufly liefert hochauflösende Topographie der Zellen, sondern auch weit verbreitet angewendet worden, um die mechanischen Eigenschaften von Gewebe-Zellen charakterisieren. Das Prinzip der AFM Vertiefung ist in Abbildung 1 dargestellt. Die AFM-Cantilever nähert die Zelle von wenigen Mikrometern über, in Kontakt mit der Zelle; Einzüge die Zelle, so dass die Cantileverauslenkung erreicht einen vorgewählten Sollwert und zieht sich aus der Zelle. Dabei wird die freitragende Auslenkung in Abhängigkeit von seiner Lage aufgezeichnet, wie in Abbildung 1 dargestellt. Vor dem Kontakt mit der Zelle bewegt sich der Ausleger in dem Medium ohne sichtbare Verformung. Wenn Einrücken auf der Zelle, den Freischwinger Kurven und den Ablenksignal zunimmt. Die Ausleger sind als elastische Strahlen, so dass die Auslenkung proportional zu der Kraft, die auf die Zelle modelliert. Durch die Einstellung der maximalen Cantileverauslenkung wird die maximale Größe der Kraft, die auf die Probe beschränkt d vermeidenAmage zu den Zellen. Der Abschnitt der Kraftverlauf von Punkt B nach C in Fig. 1, wobei die Spitze Vertiefungen in die Zelle, an die Hertz-Modell zu passen, um die Zelle zu extrahieren Steifigkeit zeigen.

Abbildung 1. Illustration von AFM Mikroindentation und Interpretation der Kraft-Kurve. Das obere Feld zeigt die Bewegung der AFM-Cantilever durch die Piezo-Scanner gefahren. Die vertikale Lage des Auslegers und der z Cantileverauslenkung D wird während des Verfahrens aufgezeichnet. Der Ausleger beginnt bei Punkt a, wenige Mikrometer über der Zelle. Bei Annäherung an die Zelle, bleibt die Probe Vertiefung δ Null bis Punkt B, wo die Spitze in Kontakt mit der Zelle erreicht. Die Koordinaten des Punktes b in der Handlung sind kritische Wertefür die Datenanalyse durch (z _0, d _0>) bezeichnet. Von B nach C, die Cantilever-Einzüge in die Zelle, bis die Cantileverauslenkung erreicht einen Sollwert, der auf das Verhältnis zwischen der maximalen gezielte Eindruckkraft und Kragfeder Konstante sein wird. Sobald die Auslenkung Signal erreicht den vorgegebenen Maximalwert, wird der Ausleger dann aus der Zelle zu Punkt d, wo es oft nach unten durch Spitze-Probe Haftung gezogen werden zurückgenommen, löst sich von der Zelle und kehrt in seine ursprüngliche Lage am e. Das rechte Bild zeigt die Beziehung zwischen der Vertiefung und dem aufgezeichneten z und d-Signals. In der unteren linken Bereich ist eine graphische Darstellung eines repräsentativen Kraftverlauf, die maximale Vertiefung eines Auslegers, der die Federkonstante gemessen werden 0.07N / m ist, ist auf 17 nm, so dass die maximale Eindruckkraft anzuwendenden Probe ist 1,2 nN. Die wichtigsten Orten während der Vertiefung sind markiert.

Protocol

1. Kalibrieren Sie die Federkonstante der Cantilever

1. Legen Sie den Ausleger in die AFM gemäß den Anweisungen des Herstellers. Es ist notwendig, die Cantileverhalters mit Ethanol gereinigt vor allen Experimenten. Dies wird Ihnen helfen zu begrenzen bakterielle Kontamination der Kultur in den AFM-Messungen.
2. Kalibrieren InvOLS (Inverse Optical Lever Sensitivity). Dieser Parameter beschreibt die Menge der Photodiode Antwort (Volt) pro Nanometer Cantileverauslenkung.
3. Legen Sie einen sauberen Glasobjektträger auf die Probe Bühne, installieren Sie dann die AFM Kopf und stellen Sie den Laserstrahl und die Ausrichtung nach den Anweisungen des Herstellers. Rasten Sie die AFM-Spitze auf dem Objektträger.
4. Mit der Piezo zurückgezogen, richten Sie den Spiegel mit einer Photodiode Lesung von -2 V. Führen Sie eine Kraft-Spektroskopie Messung mit einem Triggerpunkt (maximal Photodiode Antwort) von +2 V.
5. Mit der Piezo zurückgezogen, richten Sie den Spiegel mit einer Photodiode Lesung von -2 V. Führen Sie einen foRCE-Spektroskopie Messung mit einem Triggerpunkt (maximal Photodiode Antwort) von +2 V. Hinweis: Die Spannungswerte hier sind spezifisch für die Asylum AFM. Dieser Wert sollte nach den Vorgaben des Herstellers vorgesehen eingestellt werden.
   Nach der Datenerfassung abgeschlossen ist, in der Firma-Kontaktbereich der Kraftkurve vergrößern. Führen Sie eine lineare Anpassung in diese Region, um die Steigung, die in V / nm finden. Der Kehrwert dieser Wert beschreibt die optische Empfindlichkeit des Auslegers-Photodiode Ensemble.
6. Setzen Sie den Spiegel Ausrichtung zu einer freien Auslenkung von 0 V.
7. Kalibrieren der Cantilever Federkonstante. Ein thermischer-tune Verfahren wird verwendet, um die Federkonstante der Ausleger ²⁸ zu bestimmen.
8. Nach der Kalibrierung des InvOLS, erhöhen den Scanner von dem Probentisch derart, dass es keine Wechselwirkung zwischen Spitze und Probe.
9. Beginnen Erfassung thermischen Daten. Dabei ist die thermische Schwingung des Freiträger Recorded. Die AFM-Software analysiert ein Leistungsspektrum eines solchen thermischen Schwingungen und zeichnet es in einem Datenfenster.
10. Nach ein paar Sekunden der Datenerfassung, führen Sie eine Anpassung an die Daten-Segment an der niedrigsten Frequenz (Grundresonanz) Spitze zu bestimmen, die Federkonstante zentriert.

2. Laden der Probe

1. Installieren Sie die Dish Heizung Zubehör auf dem AFM Bühne, wenn nicht bereits ausgestattet.
2. Die Temperatur auf 37 ° C und für 20 Minuten warten, bis das System eine stabile thermische Gleichgewicht zu erreichen.
3. Legen Sie die Kulturschale auf dem AFM Bühne und sichern Sie es mit der Schelle mit der Schale Heizung vorgesehen. Es ist wichtig, um die Zeit zwischen Entnahme der Schale aus dem Inkubator und der ihn in der Phase, die Traumatisierung der Zellen zu vermeiden, zu minimieren. Für Messungen länger als 30 min sollte CO ₂ eigenständiges Medium verwendet werden, um den normalen Kulturmedium ersetzen.
4. Tragen Sie einen kleinen Tropfen von 37 ° C Kulturmedium an der Spitze von Ter AFM-Cantilever, und senken Sie die AFM Kopf, bis die Spitze gerade in Flüssigkeit eingetaucht.
5. Mit dem Top-View CCD-Kamera, richten Sie den Laserstrahl auf den Cantilever (die Ausrichtung in flüssiger wird anders sein als in der Luft, wegen der Änderung des Brechungsindex des Mediums).
6. Rasten Sie die AFM-Spitze auf einer sauberen Fläche von der Kulturschale.
7. Durchführen der Kalibrierung der InvOLS wie oben für den Ausleger Empfindlichkeit in der flüssigen Umgebung beschrieben.

Hinweis: a) Wenn Zellen auf Hydrogele kultiviert werden, die Kalibrierung der InvOLS sollten im Voraus gegen die Bodenfläche einer Kulturschale mit Zellkulturmedium gefüllt durchgeführt werden. Beim Umschalten auf Zellproben, hat besondere Aufmerksamkeit zu zahlen, um nicht die Laserstrahl Ausrichtung des Auslegers werden. b) InvOLS muss neu kalibriert, wenn es eine Änderung in der Laserausrichtung werden. c) Es wird auch empfohlen, InvOLS als Durchschnitt der Wert nehmen aus mehreren Eichkurven, seit jede Kalibrierung erzeugt eine andere InvOLS. Die Variation in InvOLS ist jedoch gering im Vergleich zu dem Mittelwert. Zum Beispiel, Kalibrieren eines Bruker DNP-10 Freischwinger mit Federkonstante 0,06 N / m in Flüssigkeit durch 100 mal produzieren einen mittleren Wert von 66,3 InvOLS nm / V, mit einer Standardabweichung von nur 0,5 nm / V.

3. Sammeln Kraftkurven of Cell Einzug

1. Markieren Sie eine Zelle für den Einzug. Mit Hilfe des optischen Mikroskops, zum Bewegen der Plattform, um den Ausleger über der Zelle so zu positionieren, daß die Spitze in der peri-Kerne Region befindet. Eine genaue Einstellung der Position des Auslegers kann durch Aufbringen Offsets auf die X-und Y-Scannern durchgeführt werden.
   Hinweis: Die AFM-Cantilever muss von der Probenoberfläche zurückgezogen werden beim Bewegen der Probe Bühne, um eine Zielzelle auszuwählen. Dies schützt den Ausleger von Klopfen in der Probe, da die Probenoberfläche eventuell nicht flach.
2. Wechseln Sie zu Spektroskopie-Modus zu erzwingen. Stellen Sie den EinzugRate im Bereich von 1-10 um / sec, niedrig genug ist, um hydrodynamischen Effekte zu vermeiden.
3. Stellen Sie die Ablenkung Triggerpunkt, der die maximale Eindruckkraft begrenzt, um Schäden an Zellen zu vermeiden. Wählen Sie die Relative Auslösung Option, die für jeden Drift im Ablenksignal korrigieren. Eine maximale Kraft von 2 nN ist ein guter Ausgangspunkt für die meisten Proben. Dieser Wert sollte jedoch nach der Probe Steifigkeit eingestellt werden. Für weiche Proben einen niedrigeren Wert sollte verwendet werden, um übermäßige Vertiefung der Probe zu vermeiden. Für steife Proben einen hohen Wert sollte verwendet werden, um messbare Vertiefung erzeugen.
4. Stellen Sie die Kraft Abstand groß genug, um sicherzustellen, dass die Spitze vollständig aus der Zelle zwischen Kraftmessungen abgenommen werden. Üblicherweise wird die Kraft-Weg bei 5 um eingestellt.
5. Befehl die AFM zu einer einzigen Kraft Kurve zu nehmen.
6. Sammeln mindestens drei unterschiedlichen Kennlinien an verschiedenen Stellen in der peri-Kerne Bereich jeder Zelle. Obwohl es vorteilhaft ist, mehrere nehmenKurven auf jeder Zelle für zuverlässige statistische Daten zu viele Kraftkurven kann zu Veränderungen in der Zelle Steifigkeit aufgrund von Stress aus der AFM-Sonde führen.
7. Wenn die Datenerfassung abgeschlossen ist, ziehen Sie die Spitze, und wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.6 für so viele Zellen wie für gute statistische Daten über die Zelle Steifigkeit unter einer bestimmten Bedingung Probe benötigt. In der Regel werden 30 Zellen für jede Bedingung gemessen.

Um die Verteilung der Steifigkeit in einer Zelle zu charakterisieren, wird eine Kraft-Karten-Modus angewendet wird. In der Kraft-Karten-Modus, stellen Sie eine Scan-Größe, um die Region in der Nähe sind, eine angemessene Auflösung; setzen die Vertiefung Parameter wie für einzelne Kraft Kurven ausgewählt, die AFM wird dann über den definierten Bereich Probe rastern und nehmen einzelne Kraft Kurven bei jedem Pixel in den Probenbereich.

4. Data Analysis

Die aufgezeichneten Kraft Kurven werden unter Verwendung eines benutzerdefinierten MATLAB Verfahren, um die Zelle Steifigkeit berechnen. Das Folgende ist eine kurze Beschreibung der MATLAB Verfahren:

1. Die MATLAB-Programm identifiziert die Kontaktstelle koordiniert z0 und d0 (siehe Abbildung 1) mit Hilfe eines Algorithmus aus einer publizierten Methode von Lin et al angenommen ^29.:
2. Für jeden Datenpunkt in der Kraft-Kurve, eine lineare Anpassung der Daten auf der linken Seite zur Sehenswürdigkeit und ein Hertz-Modell auf der rechten Seite (mit dem gewählten Punkt als erste Anlaufstelle) passen, bis zu dem Satz maximale Vertiefung (200-300 nm empfohlen).
3. Für jeden Punkt, die Berechnung der relativen RMS Fehler von beiden passt und die Summe dieser Werte.
4. Der Punkt, der die insgesamt mindestens Anpassungsfehler erreicht wird als erste Anlaufstelle ausgewählt.
   Hinweis: Rechenzeit kann durch die Implementierung eines golden-Abschnitt Suche anstatt linear Scannen des gesamten Kraftkurve reduziert werden.
5. Probenverformung δ und Eindruckkraft F werden wie folgt berechnet:
   
6. Eine der kleinsten Quadrate angewendet wird, um die F vs passen δ Daten in der Post-Kontaktbereich, z ≥ z _0, nach Hertz Modell der Elastizitätsmodul, E der Zelle zu extrahieren:
   
   , Wobei v das Poisson-Verhältnis.
   Hinweis: Wenn δ mehr als 10% der Dicke der Probe (Zelle Höhe) ist die gemessene Zelle Steifigkeit wird durch das Substrat Steifigkeit betroffen. Die Dicke der perinukleären Region ist in der Regel in der Größenordnung von wenigen Mikrometern. Daher wird nur die ersten 200-300 nm von F-δ-Kurve nach Hertz-Modell passt.

Representative Results

2a zeigt drei repräsentative Kraftkurven von 3T3 Fibroblasten auf Kunststoff-Oberfläche, Polyacrylamidgel von Young-Module 3.000 Pa und 17.000 Pa bzw. kultiviert gemacht. Nach sorgfältiger Ermittlung der Kontaktstellen in den Kurven wird das Einrücken Kraft als Funktion der Zelle Verformung in 2b dargestellt. Unter einer Kraft von Größenordnungen kleiner als 0,3 nN, eine Pyramidenform Spitze Spiegelstriche 3 Mikrometer in einer Zelle auf einer 3 kPa Polyacrylamidgel kultiviert. Im Gegensatz dazu wird eine Kraft mehr als 1,6 nN erforderlich Gedankenstrich 500 Nanometer in der Zelle auf Normalpapier Kulturschale mit der gleichen Spitze gewachsen. Es ist aus diesem Diagramm, dass die Zelle auf weichem Polyacrylamidgel kultiviert weicher als der Zelle auf der steifen Kulturschale kultiviert wird. Montage des ersten Segments (δ <30 nm) der Kraft-δ Kurven auf die Hertz-Modell gibt Young-Module dieser drei Zellen als 10 kPa, 1,2 kPa und 1,10 kPa, beziehungsweise. Zellen auf der culturE Gericht sind 100 mal steifer als Zellen auf Polyacrylamidgelen kultiviert. Solon et al. Berichteten ähnliche Ergebnisse ^25. Sie fanden, dass Fibroblasten aktiv versteift ihre Cytoskeletten, um die Steifigkeit von Substraten haften sie übereinstimmen. Viele andere Zelltypen auch berichtet worden, steifer, wenn auf steifer Substrate ³⁰ kultiviert.

Es ist wichtig zu beachten, dass die Vertiefung kann eine plastische Verformung in den Zellen verursachen, Ergebnisse, die Knicke in der violetten Kurve dargestellt. Normalerweise sollten solche Kurven aus der Datenanalyse ausgeschlossen werden. Jedoch kann die Kurve noch verwendet werden, um Zellen Steifigkeit zu berechnen, wenn der Knick ist über den Bereich der Montage-Daten werden. Beispielsweise tritt der Knick in der violetten Kurve bei etwa 400 nm liegt. Diese Kurve kann immer noch durch den Einbau die Daten nur bis zu δ = 30 nm auf die Hertz-Modell, um eine Steifigkeit von 1,2 kPa ergeben analysiert werden. Es ist auch wichtig, um die "Triggerpunkt" einstellen nach the Probensteifigkeit. Zum Beispiel wird die blaue Kurve aus einem weichen Zelle auf einem 3 kPa Polyacrylamidgel kultiviert gemacht. Einstellung des relativen Auslenkung Triggerpunkt bei 5 nm, die AFM-Spitze Spiegelstriche 3 Mikrometer in die Zelle. Solch eine große Vertiefung sollte während der Zelle Steifigkeitsmessungen verhindert werden, da es dabei aufreißen die Zellmembran und die Zelle abzutöten. Viele andere Faktoren, einschließlich der Spitze Geschwindigkeit und Datenerfassungsrate während der Kraftkurve Erwerb kann sich auf die Qualität der erworbenen Kraft Kurven und damit die resultierende Steifigkeit von Zellen ^31. Um zuverlässige Messungen zu machen, ist es notwendig, die alle diese Parameter anpassen, um "saubere" Kraft Kurven wie die rote Kurve in Abbildung 2a, die eine flache pre-contact Teil durch eine nichtlineare Erhöhung nach dem Kontakt Teil gefolgt hat gezeigt erwerben.

3a zeigt ein Bild aus einem Fluoreszenz 3T3 Fibroblasten auf einer Zellkulturschale. Die Zelle ist mit GFP transfiziert Vimentin,eine Art von intermediären Filamenten. AFM-Mapping wurde in dieser 80 um wurde durch 80 um Bereich durchgeführt, mit einer Auflösung von 32 x 32 Pixel. Die resultierende Steifigkeit Karte in 3b gezeigt. Die Steifigkeit unterscheidet sich innerhalb der Zelle. Und die lamellipodium Bereich steifer und heterogener als der perinukleären Region, die den steifen Kern umgibt.

Abbildung 2. Force-Kurve und die Daten analysiert Kraft-Einzug Kurve. A) Ein Satz von drei repräsentativen Kraftkurve Daten für 3T3 Fibroblasten auf Glas kultiviert erworben (rot), 17 kPa Polyacrylamidgel (lila) und 3 kPa Polyacrylamidgel (blau). Die Kurven sind so, daß die Kontaktstelle (z _0, d ₀₎ am Ursprung (0,0) des Koordinatensystems befindet verschobenSystem. b) Die Einbuchtung-Kennlinien aus a) und Anpassung der Daten an die Einbuchtung Hertz-Modell berechnet nur die ersten 300 nm des Eindrucks. Inset in b) zeigt die Güte der Anpassung an die Hertz-Modell für die ersten 300 nm der Vertiefung; Kreise sind experimentelle Daten stellen die Linien fit Daten. Die Federkonstante der Ausleger ist 0,062 N / m in diesem Fall.

Abbildung 3. a) Fluoreszenzbild einer 3T3 Fibroblasten mit GFP transfiziert Vimentin. Nur ein Teil der Zelle in der Abbildung dargestellt. Maßstab Balken stellt 20 um. B) Ein 32 x 32 Pixel Steifigkeit Karte von der gleichen Gegend. Jedes Pixel repräsentiert 2,5 um.

Discussion

Die AFM Vertiefung Methode hat Vorteile gegenüber mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen zu charakterisieren. Wenn auch weniger empfindlich als die magnetische Verdrehen Durchflusszytometrie und optische Pinzette, die Kräfte auf die Pikonewton Stufe ³² messen kann, kann die AFM Widerstandskraft von Proben im Bereich von zig Pico-Newton, um Hunderte von nano-Newton, vergleichbar zu erfassen, um der Kraft reichen, dass Zellen können unter Verwendung einer Mikropipette ¹⁹ aufgebracht werden. Dieser Bereich der Kraft passt die Bedürfnisse zu messbaren Deformationen in allen Arten von Zellen ¹⁹ zu erstellen. Die hohe räumliche Auflösung ermöglicht es, auf dem Submikrometerbereich charakterisieren die Heterogenitäten in Geweben und in einzelnen Zellen ^33. Es ermöglicht auch Echtzeit-Live-Cell-Messungen. Mehrere AFM Modelle für biologische Proben entwickelt in einer flüssigen Umgebung arbeiten und mit beheizten Phasen, die eine präzise Temperaturregelung bereitzustellen ausgestattet, die es ermöglichen, eine physiologische Umwelt beizubehaltenUmwelt für lebende Zellen während der Messungen. AFM Vertiefung wurde erfolgreich zum Messen der mechanischen Eigenschaften einer Reihe von Zelltypen, ^25,34-36 aufgebracht und wurde in großem Umfang für die Beurteilung von Veränderungen in den mechanischen Eigenschaften von Zellen, die mit zellulären Differenzierung verbunden und in verschiedenen Zusammenhängen verwendet erkrankten. ^30,37

Ein wichtiger Schritt, um die Steifigkeit von Kraft-Kurve berechnen ist die Ermittlung der Punkt, wo die Spitze zuerst in Kontakt mit der Zelle. Die Unsicherheit in Anlaufstelle können sich auf den Elastizitätsmodul ^31. Für steife Materialien, erhöht sich die Ablenkung Signal abrupt nach dem Spitze-Probe-Kontakt, und die Kontaktstelle leichter als Wendepunkt in der Kurve gekennzeichnet. Durch einen solchen scharfen Wendepunkt, aber oft nicht in der Kraft-Kurven aus Zellen, aufgrund der geringen Steifigkeit Zelle (siehe Abbildung 2) erscheinen. Ein MATLAB-Code wurde entwickelt, um genau finden die Kontaktstellen in Kraft Kurvenvon weichen Proben unter Verwendung des Algorithmus von Lin et al. ^29. Der Code kann die Kennlinien von weichen Proben, die uns um den Prozess der Datenanalyse durch die automatische Suche nach der Anlaufstelle und der Montage der Einbuchtung Daten zu automatisieren Hertz-Modell ermöglicht behandeln. Die MATLAB-Code wird angewendet, um die Kontaktstellen in 60 Kraftkurven an der gleichen Stelle von einem Polyacrylamidgel, von denen die Steifigkeit war Maßnahme auf 7,2 kPa durch Masse Rheologie Messungen werden gemacht bestimmen. Der Code erkannt Anlaufstellen in diesen Kurven. Die Variationsbreite in Anlaufstelle Lage ist kleiner als 15 nm beträgt. Basierend auf diesen Kontaktstellen, der berechnete Mittelwert Steifigkeit 6,9 kPa ist, ist die Standardabweichung 0,2 kPa und der maximale Schwankungsbreite 0,6 kPa. Ergebnisse aus diesem Experiment eine Maßnahme, um die Unsicherheit der gemessenen Steifigkeit bewerten. Der 15 nm Unsicherheit in Kontaktstelle zu einer Unsicherheit in der Steifigkeit, die weniger als 10% des mittleren wertvoll iste. Für weichere Gele mit sehr niedrigen Ablenksignal kann die Unsicherheit in Kontaktstelle so hoch wie 30 nm, was zu einer Unsicherheit in der Steifigkeit führt so hoch wie 30%. Der Code ist als Ergänzung zu diesem Artikel.

AFM zuverlässig messen Steifigkeit im Bereich von weniger als 100 Pa bis 10 ⁶ Pa, die den Bereich der Steifigkeit für die meisten Gewebe und Zellen. Für zuverlässige Messungen ist es wichtig, die AFM Cantilever mit Federkonstanten gut an die Probensteifigkeit abgestimmt auszuwählen. Wenn der Ausleger zu steif ist, ist seine Auslenkung zu klein, um zu erkennen, und es könnte die Zelle beschädigen; wenn der Ausleger zu weich ist, wird es nicht Gedankenstrich der Zelle ausreichend zuverlässigen Eigenschaften zu erhalten und ihre thermischen Schwingungen kann die Kraft Kurve dominieren. Ausleger von 0,06 N / m mit einer Pyramidenspitze gelten für die meisten Zelltypen auf steifen Kulturschalen kultiviert. Diese Ausleger sind jedoch nicht für Zellen kultiviert auf messenweichen Substraten. Wie in 2 gezeigt, ist die Zelle auf einem 3000 Pa Polyacrylamidgel kultiviert so weich, daß eine 3 um Vertiefung erforderlich ist, eine 5 nm Durchbiegung des Auslegers zu erzeugen. Die Kraft-Kurve ist so flach, dass es kaum einen Unterschied zwischen der Pre-und Post-Kontakt Kontaktbereich. Dies führt zu einer großen Unsicherheit in der Anlaufstelle und damit die daraus resultierenden Steifigkeiten. Mit einem weicheren Cantilever nur geringfügig verbessert den Kontrast zwischen der Pre-und Post-Kontakt Kontakt Regionen. Um die Messung wie weiche Materialien sind Ausleger mit großen kugelförmigen Spitze empfohlen. A 0,06 N / m Ausleger mit einer sphärischen Spitze 10 Mikrometer im Durchmesser angewendet werden, um Proben zu messen mit Steifheit von weniger als 100 Pa Ausleger mit sphärischen Spitze im Handel erhältlich sind von vielen Anbietern werden. Sie können auch maßgeschneidert durch Kleben Mikrosphären Tipless Ausleger. Die kugelförmigen Tipps bieten größere Ablenksignal und verhindern Schäden an der Zellmembran. However, sie sind nicht anwendbar für hochauflösende Kartierung Steifigkeit aufgrund ihrer großen Kontaktfläche mit den Zellen. Tabelle 1 enthält eine Liste der AFM-Sonden für Zelle Steifigkeit Messungen empfohlen.

Modell	Federkonstante (N / m)	Tip Typ	Tip Radius (nm)
Bruker DNP10-D	0,06	Pyramid	20
Bruker MLCT-B/C/E	0.01/0.02/0.03	Pyramid	20
Novascan PT.GS	0.01/0.03/0.06	Glaskugel	2.000 / 5.000 / 10.000
Novascan PT.PS	0.01/0.03/0.06	Polystyrol Sphere	1.000 / 4.500 / 10.000

Tabelle 1. A sewahl von AFM-Sonden mit den geltenden Federkonstante und Spitzengeometrie für Zelle Einbuchtung.

Die Einschränkungen der vorgestellten Methode sollte auch markiert werden. Die Hertz-Modell, das aufgebracht wurde, um den Einzug Daten passen ist ein vereinfachtes Modell. Es sagt die Kraft-Einzug Beziehung für unendlich Vertiefungen der rein elastischen Materialien axialsymmetrischen Eindringkörpern. Einige der Annahmen der Hertz-Modell nicht auf die Zelle Vertiefung gelten.

Das Modell geht davon aus Hertz homogen und linear elastischem Material, während eine Zelle ist heterogen (siehe Abbildung 3) und nichtlinear elastisch. Im lamellipodium Region, ist es eher inhomogene aufgrund der heterogenen Struktur des Aktin-Zytoskeletts. Die mechanische Steifigkeit einer Zelle wird als die durchschnittliche Steifigkeit von drei oder mehr unterschiedlichen Kennlinien aus der relativ homogenen perinukleären Region erworben extrahiert gemeldet. ^25,36 Rekonstituierte networks von Aktin und Intermediärfilament sind Stamm-Versteifung Materialien, dh sie sind steifer bei größeren Verformungen. ^38,39 derartige nichtlineare Elastizität hat für lebende Zellen beobachtet worden, aber nicht entfielen in der Hertz-Modell. Um die Wirkung der nichtlinearen Elastizität des ausgewiesenen Zelle Steifigkeit zu begrenzen, wird nur die ersten 300 nm der Vertiefung Daten an die Hertz-Modell passt.

Es wird auch in der Hertz-Modell angenommen, dass die Materialien rein elastisch sind. Allerdings sind die Zellen und deren Zytoskelett viskoelastischen Materialien mit Steifigkeit abhängig von der Zeitskala der Messungen. Bei kürzeren Zeitskala, die Cantileverauslenkung kommt hauptsächlich aus der elastischen Reaktion der Zellen. Am langen Zeitskala jedoch schleicht die Probe und gibt einen weicheren Antwort. Die Zeitskala der AFM Vertiefung wird durch Spitze Geschwindigkeit gesteuert. Daher ist der beobachtete Unterschied in der Zelle Steifigkeit nur sinnvoll, wenn die Kraft Kurven mit der gleichen Vertiefung velo erworbenStadt. Um quantitativ extrahieren Sie die frequenzabhängige Viskoelastizität von Zellen hat die AFM "Kraftmodulation"-Methode, indem hochfrequente Schwingungen kleiner Amplitude auf einer größeren Vertiefung ^21,27 entwickelt worden.

Die Annahme unendlicher Probendicke in der Hertz-Modell nicht für Zellen gelten. Zellen sind in der Regel nur wenige Mikrometer dick im perinukleären Region, und ein paar hundert Nanometer dick in der Lamelle Region. Korrekturen wurden teilweise aufgrund der endlichen Dicke der Probe gemacht. ^31,40 Daten aus Kraft-mapping erworben enthält sowohl Daten und Vertiefung Zelle Höhendaten. Lokale Probendicke kann aus den Höhendaten berechnet. Zukünftige Arbeiten erforderlich, um die Dicke der Probe Korrekturen in der Analyse für Kraft-Mapping-Daten implementieren.

Zusammenfassend stellt dieses Papier ein Protokoll, um die mechanische Steifigkeit der lebenden Zellen mit Hilfe eines Asylum MFP3D-Bio atomic force micr charakterisierenOSCOPE. Die Grundsätze der AFM-Betrieb und die MATLAB Datenanalyse Verfahren gelten für alle anderen Modelle AFM. In den letzten Jahren haben optische Mikroskopie Techniken einschließlich Hellfeld, konfokale Mikroskopie und Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) mit dem AFM für Echtzeit-Bildgebung von Zellen auf mechanische Reize kombiniert. ^41,42 Diese Einstellungen ermöglichen auch zeitgleiche Messungen Zellmechanik und Abbildung der Zytoskelett-Komponenten. Korrelieren der lokale Steifigkeit Daten der Verteilung der lokalen Zytoskelett-Komponenten interessanten Informationen darüber, wie die Zytoskelett-Komponenten tragen zu Zellmechanik bereitzustellen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atomic Force Microscope	Asylum Research	MFP3D-BIO