Summary
In deze video laten we zien modificatie technieken voor poreuze metalen implantaten om hun functionaliteit te verbeteren en om celmigratie te controleren. Technieken omvatten de ontwikkeling van poriën verlopen naar cel beweging beheersen 3D en productie van basale membraan bootst naar cel beweging beheersen 2-D. Ook is een HPLC-methode voor toezicht integratie implantaten in vivo via analyse bloedeiwitten beschreven.
Abstract
Metalen implantaten, vooral titanium implantaten worden veel gebruikt in klinische toepassingen. Ingroei van weefsel en integratie deze implantaten in de weefsels zijn belangrijke parameters voor succesvolle klinische resultaten. Om weefselintegratie te verbeteren, hebben poreuze metalen implantaten ontwikkeld. Open porositeit van metallisch schuim is zeer voordelig, omdat de porie gebieden kunnen worden gefunctionaliseerd zonder de mechanische eigenschappen van de gehele structuur. Hier beschrijven we dergelijke wijzigingen met poreus titanium implantaten op basis van titanium microbolletjes. Door inherente fysische eigenschappen zoals hydrofobiciteit van titanium, is het mogelijk om hydrofobe poriën gradiënten vinden binnen microbead gebaseerde metalen implantaten en tegelijkertijd om een fundament membraan bootsen basis van hydrofiele, natuurlijke polymeren. 3D porie verlopen worden gevormd door synthetische polymeren zoals poly-L-melkzuur (PLLA) door vries-extractiemethode. 2D nanofibrillar survlakken worden gevormd door collageen / alginaat gevolgd door een verknopende stap met een natuurlijke crosslinker (genipin). Deze nanofibrillar film werd per laag opgebouwd door laag (LBL) depositie methode van de twee tegengesteld geladen moleculen, collageen en alginaat. Tenslotte, een implantaat waarbij verschillende gebieden geschikt verschillende celtypes, zulks voor vele meercellige weefsels, kan worden verkregen. Door deze wijze cellulaire beweging in verschillende richtingen door verschillende celtypen kan worden geregeld. Een dergelijk systeem wordt beschreven voor het specifieke geval van trachea regeneratie, maar kan worden aangepast voor andere doelorganen. Analyse van de cel migratie en de mogelijke methoden voor het creëren van verschillende porie-gradiënten worden uitgewerkt. De volgende stap in de analyse van dergelijke implantaten is hun karakterisering na implantatie. Echter, histologische analyse van metalen implantaten is een lang en moeizaam proces, dus voor het toezicht gastheerreactie metallische implantaten in vivo een alternatieve methode gebaseerd op monitoring CGA en verschillende bloed-eiwitten wordt ook beschreven. Deze werkwijzen kunnen worden gebruikt voor het ontwikkelen in vitro maat migratie en kolonisatie tests en worden gebruikt voor analyse van gefunctionaliseerde metalen implantaten in vivo zonder histologie.
Introduction
Momenteel beschikbare metalen implantaten zijn geschikt voor dragende toepassingen, maar zij niet-afbreekbaar noodzakelijk ontwerpen die een sterke koppeling met het omringende weefsel te waarborgen 1. Door structuren die cellulaire ingroei en kolonisatie in vivo te vergemakkelijken, kan de levensduur van metalen implantaten worden verlengd 2. Openlijk poreuze metalen implantaten zijn veelbelovende materialen voor tissue-interface engineering en ook voor het waarborgen van een goede kolonisatie van de implantaten. Zij zijn actief als orthopedische implantaten en als tracheale implantaten 3-5. Er zijn echter nog problemen die moeten worden opgelost, zoals de nauwkeurige controle over de beweging van cellen in de porie gebieden. Niet dit proces te controleren kan leiden tot onvolledige kolonisatie in een uiteinde en restenose in de andere. Ook verdere functionalisering van deze implantaten is noodzakelijk voor het bereiken van hogere functies, zoals afgifte van groeifactoren,geregisseerd vascularisatie en gelijktijdige beweging van verschillende celtypes 6-8. Tracheale implantaten, is belangrijk als de kolonisatie van het implantaat door een gevasculariseerd weefsel gewenst is. De ongecontroleerde weefsel-groei het lumen van trachea is ongewenst omdat het verlaagt implantaat patency.
Een mogelijkheid tot cel beweging te controleren is uitsluiting op grootte. Door het kennen van de omvang van de doelcellen en hun vermogen tot interactie met een bepaald synthetisch polymeer is het mogelijk om gradiënten van poriën effectief bepalen de diepte van celbeweging ontwikkelen. Bijvoorbeeld door een porie architectuur die groot genoeg is voor de toevoeging van bindweefselcellen zoals fibroblasten extraluminally, maar klein genoeg (minder dan 10 um) om hun beweging intraluminaal voorkomen dat een effectieve controle kolonisatie van een buisvormig implantaat kan worden bereikt.
Uit beschikbare porie creatie methoden zoals freeze-drying, deeltje uitloging, gas schuimende 9,10, het makkelijkst te passen methode voor snelle vorming van poriën gradiënten met een minimale hoeveelheid benodigde apparatuur is freeze-extractie 11. In deze werkwijze wordt een polymeeroplossing bevroren in een binair mengsel van een organisch oplosmiddel en water. Daarna wordt het oplosmiddel uitgewisseld via extractie met een mengbaar voorgekoelde vloeistof zoals ethanol. Invriezen en extractiecondities bepalen de vorm en grootte van de poriën en wanneer de extractie op een manier waarbij de beweging van de extractieoplossing kan worden geregeld, kan poriegrootte en vorm hebben gerichte gemoduleerd.
Tweede stap meercellige weefsels is de vorming van poreuze grenzen tussen verschillende celtypen op hun wisselwerking te controleren. Dit is ook nodig voor de beschikbaarheid van verschillende micro-omgevingen voor verschillende celtypes afhankelijk van hun behoeften 12,13. Luchtpijp is een buisvormig orgaan dat strottenhoofd verbindt met bronchi. Het heeft een innerlijke pseudostratified ciliaire epitheel voering met onderling gedispergeerd slijmbekercellen die slijm produceren. De 3D-structuur en stabiliteit van de trachea gehouden door kraakbeen in de vorm van C-ringen. Dus in een kunstmatige trachea moet er een bepaalde verbinding tussen het bindweefsel en het ciliaire epitheel laag. Terwijl een 3D structuur voor de bindweefselgedeelte, de migratie van epitheelcellen vereist een basaal membraan-achtige oppervlak gerichte beweging en wondsluiting bereiken. Polyelectrolyt meerlaagse folies (PEM) een mogelijkheid zijn om basale membraan mimiek te verkrijgen. Layer-by-layer methode (LBL) is een veelzijdige werkwijze te dun en functionele coatings te verkrijgen. Het is gebaseerd op elektrostatische interacties van twee tegengesteld geladen polyelektrolyten en hun opbouw in een sequentiële wijze nanoschaal coatings waarvan de eigenschappen kunnen worden gevarieerd door simpelweg variabelen zoals polyelektrolyt species, pH verkrijgen,laagnummer, toevoeging van een deklaag, verknoping etc. Een van de belangrijkste voordelen van de LbL werkwijze is de mogelijkheid om te voldoen aan de topografie van het onderliggende substraat. Aldus, onder gecontroleerde omstandigheden kan deze methode ook worden gebruikt voor het oppervlaktebedekking van poreuze structuren. Wanneer collageen wordt gebruikt als een van de polyelektrolyten kan men nanofibrillar structuren die het oppervlak van fundament membraan kan nabootsen verkrijgen. De hydrofobe eigenschappen van titanium maakt de ontwikkeling van dergelijke structuren en fibrillarity kan worden bewaard in dikke coatings 14. Zo hechting en beweging van cellen op het oppervlak kan ook worden geregeld. Door freeze-extractie en LbL filmbekleding achtereenvolgens, een structuur waarin celbeweging zijdelings worden gecontroleerd langsrichting en omtreksrichting worden verkregen 15.
Hier beschrijven we twee nieuwe modificatiewerkwijzen voor titanium implantaten door hun hydrofobe gedrag dat kan wordenuitgebreid tot een wijziging van verschillende poreuze implantaten: i) vorming van gradiënten van microporiën in de macroporeuze titanium implantaten met hydrofobe, synthetische polymeren ii) vorming van een dikke polymere filmlaag op het oppervlak van het implantaat die celgroei en voering vorming van polyelektrolyt multilagen ondersteunt. Deze werkwijzen kunnen sequentieel of afzonderlijk worden gebruikt. Ze bieden structuren die gecontroleerde migratie en ruimtelijke organisatie van verschillende celtypes in meercellige weefsels 16,17 garanderen. Voor het specifieke geval van de trachea, zou het gewenste resultaat voor het implantaat de kolonisatie fibrovasculair weefsel binnen de microporiën verlopen zonder restenose en de vorming van de binnenwand van gecilieerde epitheliale cellen op de polyelektrolyt multilagen.
Een manier van het controleren integratie van implantaten is een kleine chirurgische ingrepen tijdens de duur van hun integratie in de gastheer in situ. Om te kunnen to beslissen over de timing van zijn optreden, is het belangrijk om informatie over de systemische effecten van de implantaat. C-reactief proteïne (CRP) is gebruikt voor bewaking van infecties en inflammatoire respons in klinische settings. Chromogranine A (CGA) kan ook worden gebruikt op een soortgelijke wijze kunnen nauwkeurigere resultaten aan de graad van inflammatie 18 waarnemen. Als een mogelijke manier van observeren metallic integratie implantaat in vivo, presenteren we een voortdurende controle procedure van implantaat systemische effecten door karakterisering van dierlijke bloedmonsters met High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) en de daaropvolgende eiwit sequencing. Uitwerking van deze methode kan worden gebruikt om ontwijken regelmatige eindpunt histologische analyse. Histologische snijden van metalen implantaten is een lang, omslachtig en duur proces en kan alleen plaatsvinden op specifieke tijdstippen. Omwille van deze reden, goed ontworpen bloedtesten leveren van robuuste informatie over de gezondheid implantaat zouzijn mogelijke routes om dierproeven te verminderen als mandataris van de recente EU-regels inzake dierproeven.
De hier gepresenteerde werkwijzen kunnen worden gebruikt om de prestaties van metalen implantaten via functionalisering verbeteren of om een alternatieve manier van controle bestaande implantaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van Micropore Gradients in Macroporeuze Metallic Implants
- Reinig de implantaten (zoals implantaten gemaakt van medische kwaliteit titanium parels die in grootte variëren van 400-500 um, Neyco SAS, Frankrijk) met ethanol en ultrasone trillingen in aceton gedurende 15 minuten daarna.
- Ontwerp en productie Teflon matrijzen afhankelijk van de grootte en vorm implantaat (Voor standaard experimenten, cilindrische vormen van 1,5 cm diameter met een hoogte van 2 cm gebruikt). Mallen zou modulair zijn, zodat de bepaalde delen tijdens extractie verwijderd. Een dergelijke matrijs ontwerp zorgt voor de controle over het extractieproces door het forceren van de verplaatsing van de extractievloeistof in een gerichte wijze.
- Voor buisvormige implantaten ter trachea vervangen, de structuur bestaat uit drie delen: i) een onderste deel aan de grootte van het implantaat, ii bepalen) een doorn en iii) een buitenste kern die verwijderbaar is. Zo kan de poriegrootte gradiënt gevormd van buiten naar binnen. <li> Bereid de synthetische polymeren (PLLA) oplossing: Voor vries / extractie PLLA oplossing moet worden bereid in een binair mengsel van dioxaan en water (87:13%, v: v).
- Verwarm het mengsel tot 60 ° C om een homogene oplossing te verkrijgen. 60 ° C gekozen omdat het de bovengrens van de hittebestendigheid en de precisie glazen spuiten die moet worden gebruikt voor de introductie van de oplossing in de implantaten.
- Indien hoge concentratie (≥ 6%), hoog molecuulgewicht PLLA oplossingen worden gebruikt, dient de oplossing in het implantaat onmiddellijk na verwarming. Anders gelering van de oplossing plaatsvindt zonder volledige onderdompeling.
- Bereken het volume van de vereiste polymeeroplossing met betrekking tot de porositeit van het implantaat, de nauwkeurigheid verandering in het volume van de bevroren oplossing kan rekening worden gehouden.
- Introduceren van de oplossing in de implantaten met precisie glazen spuiten met 0,1 pl nauwkeurig. De ondergrens voor het polymeer concentratie3% voor reproduceerbare porie gradiënt formatie dat het moeilijk wordt om een homogene verdeling te verkrijgen in de dikke monsters boven de 6%. Voor specifieke toepassingen kunnen andere concentraties worden gebruikt.
- Bevries de monsters direct bij -80 ° C of met voorafgaande incubatie gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Vriesweer bepalen gedeeltelijk de poriënvorming, waardoor de vorst kan worden aangepast aan de porositeit richting op. Houd de monsters gedurende de nacht bij -80 ° C.
- Extractie: Dompel de implantaten in 80% pre-gekoelde EtOH. Het uitvoeren van de extractie bij -20 ° C gedurende de nacht. Om porositeit gradiënten te verkrijgen, verwijder alle vormdelen behalve de doorn van de buisvormige implantaten en alle onderdelen, behalve het onderste deel voor schijfvormige implantaten. Gebruik een pre-gekoelde scalpel makkelijker zijn te scheiden van de mal.
- Na extractie bij -20 ° C gedurende de nacht 19, verwijder het resterende vormdelen en lucht drogen de implantaten. Voor de karakterisering vande algemene porositeit van de structuur kwikporosimeter blijft noodzakelijk. Kwikporosimeter metingen toonden verschillende pieken die overeenkomen met de poriën op de beide zijden van het implantaat en de kleinere onderling gedispergeerd poriën. De meer belangrijke gegevens echter het verschil tussen de porositeit van intraluminale en extraluminale oppervlakken, die kunnen worden geanalyseerd door Image J poriegroottespreiding met een scanning elektronenmicroscoop (SEM) 20. Voor de verificatie van de porie gradiënt, bevriezen-breuk de monsters en observeer de doorsnede met SEM.
- Door de open poreuze aard van de implantaten en de lichtreflecterende vermogen van titaan, is het mogelijk om z-stapels gelabelde cellen doen binnen de poreuze implantaten. Label de cellen met PKH26 of Calcein-AM en de implantaten met confocale laser microscopie visualiseren.
2. Surface Coating van poreuze metalen implantaten met collageen / alginaat Multilayers
- Voor opbouwvan meerdere lagen, wordt de hoogste reproduceerbaarheid verkregen met het onderdompelen van robots. Indien een dompelen robot niet beschikbaar te werk handmatig worden gedaan.
- Gebruik medische kwaliteit collageen type I en natrium alginaat. De geoptimaliseerde concentratie 0,5 g / L van elk in 150 mM NaCl in citraatbuffer bij pH 3,8.
- Los de collageenoplossing nachts de homogeniteit van de oplossing te waarborgen. Zure pH van 3,8 nodig voor stabiele opbouw van de lagen zoals de structuur instabiel voor verknoping in neutrale pH.
- Stort de lagen door een dompelen robotsysteem door onderdompeling van de implantaten in collageen en alginaat oplossingen alternatief. Depositie is 15 minuten voor elke volgende laag. Spoel de structuur tussen depositiestappen met 150 mM NaCl bij pH 3,8 gedurende 5 minuten.
- Ontwerp specifieke houder voor gebruik van de implantaten met dompelen robots gebruikt in polyelectrolyt meerlaagse productie. Stort de lagen op het oppervlak van hetzij titaan alleen Implagen of implantaten gewijzigd zoals beschreven in paragraaf 1.
- Stabilisatie van de basaalmembraan bootsen met genipin: Bereid de verknopingsoplossing in dimethylsulfoxide (DMSO) / citraat buffer (150 mM NaCl, pH 3,8) en 01:04 v: v-verhouding. Een breed scala aan concentraties worden gebruikt en 100 mM is geschikt voor verknoping. Ontbinden eerste genipin in de component DMSO en de component water later toe te voegen aan klonteren voorkomen.
- Verknopen van de monsters door de onderdompeling in de verknoping oplossing tussen 12-24 uur. Daarna spoelen met ruime hoeveelheid citraat-buffer (pH 3,8).
- Na het wassen stappen, steriliseren van de monsters, hetzij met UV-behandeling (30 min.) of een antibioticum / antifungale bad (penicilline / streptomycine, Fungizone).
- De belangrijkste parameters die de kwaliteit van de basaalmembraan nabootsen bepalen, zijn de dikte en de diameter van de vezels. Bereken de vezeldiameters met Atomic Force Microscopy (AFM) verkregen beelden in contact modus. De monsters met eenstikstofstroom voor de beeldvorming. Kwantificeer de dikte van ten minste 10 vezels per beeld de gemiddelde fibril dikte Image J software bepalen.
- De dikte van de folies kan worden bepaald door krastest met AFM. Droge (COL / ALG) 24 / COL meerlaagsfilms. Gebruik een spuit naald te krabben van de film. Na lokalisatie van de kras met een lichtmicroscoop, beelden te verkrijgen met AFM op 10 x 10 micrometer 2 vlakken op de grens van de scratch. Bereken de grootte van de profielen verkregen met de AFM software, waarbij de dikte van de filmlaag verschaft.
3. Indirecte monitoring van Implant Integratie In vivo door Analyse van Blood Plasma
- Alle noodzakelijke goedkeuringen comite moet worden genomen voor dierproeven volgens de betreffende regels voor elk land 21. In ons geval is de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren (National Research Council, 2010) wordt gevolgd en The goedkeuring van de universiteit van Straatsburg ethiek commissie wordt verkregen.
- Het uitvoeren van de inplanting op de doellocatie. Het bloed monitoringprotocol hier gegeven werd gebruikt voor tracheale vervanging in Nieuw-Zeeland witte konijnen van een 15 mm tracheale resectie.
- Na implantatie dagelijks follow-up nodig zoals montioring het algemene welzijn van de dieren (genezing rond de chirurgische plaatsen, snelheid van de ademhaling) en registratie van hun gewicht.
- Om de bloedtest te valideren, gebruik dan een bekende methode zoals ELISA tests voor bloed CRP niveaus. CRP tests voor veel dieren beschikbaar en specifieke test voor konijnen, zijn in tabel 1. Ook gebruiken western blotting voor de bepaling van CGA niveaus. Monoklonale anti-CGA-antilichamen (anti-CGA 47-68) werden gebruikt in dit protocol.
- Voor plasma karakterisering, krijgen bloedmonsters van de auricular aderen van de konijnen. Centrifugeer bij 5000 rpm gedurende 20 min bij 4 °; C. Gebruik de supernatant verkregen voor analyse. In onze procedure, zijn deze tests uitgevoerd op een wekelijkse basis, maar vaker testen zijn mogelijk.
- Omgekeerde fase HPLC zuivering van de plasma-eiwitgehalte: Pak het konijn plasma met 0,1% trifluorazijnzuur (01:01; v: v). Zuiver het extract met behulp van een Dionex HPLC-systeem (Ultimate 3000, Sunnyvale, CA USA) op een NUCLEOSIL tegenfase 300-5C18-kolom (4 x 250 mm; deeltjesgrootte 5 micrometer; porositeit, 300 Å).
- Registreer de absorptie bij 214 en 280 nm. Het oplosmiddelsysteem gebruikt wordt i) Oplosmiddel A: 0,1% (v / v) trifluorazijnzuur (TFA) in water en ii) Oplosmiddel B: 0,09% (v / v) TFA in 70% (v / v) acetonitril-water.
- Met een stroomsnelheid van 700 pl / min gradiënten voor eluties. Verzamel de piekfracties. Concentreer de fracties door verdamping door de snelheid-vacuüm toepassing. Het is belangrijk om de snelheid vacuüm stoppen voordat volledig droog.
- Correleren van de verkregen pieken op verschillende tijdstippen over de coUrse van de implantatie periode. Gebruik de gezuiverde peptiden die worden weergegeven consistente trends tijdens implantatie voor de identificatie van geautomatiseerde Edman sequencing.
- Automatische Edman sequencing van peptiden: Bepaal de N-terminale sequentie van de gezuiverde peptiden van geautomatiseerde Edman degradatie met een Procise microsequencer. Laad het monster te polybreen behandelde glasvezel filters. De volgende stap is het identificeren van fenylthiohydantoïne-aminozuren (Pth-Xaa) door chromatografie over een C 18 kolom (PTH C-18, 2,1 x 200 mm) 22. Nadat de sequentie is verkregen, kan worden geïdentificeerd met behulp van Blast software SWISS-Prot database.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vorming van poriën gradiënten
Door de concentratie van de PLLA oplossing is het mogelijk om de grootte van de poriën op het extraluminale zijde van de implantaten te controleren. Poriegrootte en vorm sterk beïnvloed door de aanwezigheid van titaan implantaten (figuren 1a en 1b). Poriegrootten variëren 40-100 urn en gebruik van lagere concentraties resulteerde in kleinere poriën. Overwegende dat in de intraluminale kant poriegrootte werd beheerst door de beperkte extractie en was rond 9 micrometer 23, minder dan de gemiddelde grootte van de fibroblasten. Door toevoeging van een incubatiestap bij kamertemperatuur een dubbele poreuze structuur waarin de poriën wanden van de grotere poriën hebben hun eigen poreusheid verkregen. Deze functie is van belang voor dikke implantaten, als het de gas-en voedingsstoffen beweging (figuur 1c) zou vergemakkelijken.
Nanofibrillar basaal membraan-mimische formatie
(figuur 2) toe. Deze filmlaag is stabiel boven de PLLA schuim en kan worden gehandhaafd op het oppervlak in de afwezigheid van het schuim (figuren 3a en 3b). Nanoschaal collageenvezels te vormen als de filmlaag groeit (figuur 3c). De groei van de film exponentieel, waardoor een dikke film van enkele honderden nanometers kan worden verkregen (figuur 3d).
Analyse van bloedplasma met HPLC en daaropvolgende sequencing na implantatie
Poreus titanium implantaten integreren met de gastheerweefsel en worden volledig gevuld tussen 4-6 weken in vivo (figuur 4). Echter, voortzetting van dit proces leidt tot restenose en in aanwezigheid van de porie verloop vanwege de PLLA structuur werd geen fibroblast aanwezigheid waargenomen van eenN a 6 weken na implantatie 20. Gedurende deze periode toonde HPLC-analyse verschillende pieken die fluctueren gedurende het tijdsverloop van de implantatie. De piek fracties van belang worden gesequenced en bepaald als alfa-en beta hemoglobine ½ ketens (fig. 5), die een soortgelijke trend met CRP metingen was gebleken.
Figuur 1. Werkwijze volgens poriën gradiënt vorming. Bereiding van poreuze schuimen PLLA via freeze-extractiemethode. SEM microfoto's (A) zonder macroporeus titanium implantaten (buitenste) (B) met macroporeus titanium implantaten (buitenste) (C) met macroporeus titanium implantaten (binnen). Aanwezigheid van de implantaten veranderde de poriën morfologie. (C, D) Hetzelfde proces kan appl ied om buisvormige structuren te porie gradiënten te verkrijgen in buisvormige implantaten. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Schema van de multifunctionele ontwikkeling implantaat. Vanaf microbead gebaseerde poreuze implantaten, door toevoeging van een synthetisch polymeer schuim op basis van een porieafmeting gradiënt kan worden verkregen. Vorm van de porie gradiënt gedeeltelijk geregeld door de structuur van de matrijzen. Bovenop deze structuur een kelder membraan-structuur kan worden toegevoegd, dat een geschikt oppervlak voor celhechting en voering vorming in 2D zou bieden.
pload/50533/50533fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50533/50533fig3.jpg "/>
Figuur 3. Nanofibrillar Multilayer formatie op titanium implantaten als een basaal membraan na te spelen. Dikke collageen / alginaat meerdere lagen kan specifiek worden gevormd op het oppervlak (A) Titanium alleen implantaten (gemiddelde korrelgrootte van 400-500 urn) (B) Titanium / PLLA foam hybriden. Dit oppervlak (~ 1 urn dik) een substraat voor de hechting en proliferatie van endotheelcellen (C) De nanofibrillar aard van de multilagen wordt gekenmerkt door AFM analyse (Scangebied: 30 urn x 30 urn) (D) de dikte van de multilagen wordt bepaald door krastest. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
jpg "/>
Figuur 4. Integratie van poreus titaan implantaten in vivo in konijnen. Haemotoxylin en eosine kleuring van de geëxplanteerde implantaten dwarsdoorsneden (A) De poreuze gebieden kunnen geheel gevuld binnen 4-6 weken in vivo (B) Het weefsel in de poriën is een volwassen bindweefsel met een goed niveau van vascularisatie .
Figuur 5. Monitoring van het eiwitgehalte van het plasma in de loop van een implantatie met behulp van HPLC en de daaropvolgende sequencing. De vertegenwoordiger HPLC curves tonen de pieken verkregen uit bloedmonsters van dieren na respectievelijk 3, 4 en 6 weken na implantatie (linksboven, rechtsboven, linksonder ). Elke piek overeenkomt met een specifiek eiwit. De verschillenin de piek overeenkomt met de relatieve abundantie van een bepaald eiwit, kan worden bepaald door sequentie (zoals α-en ß-ketens hemoglobine ½). hier grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Porie gradiënten zijn belangrijke hulpmiddelen in de interface tissue engineering en het hier beschreven systeem kan alleen of in combinatie met metalen implantaten worden gebruikt om porie gradiënt te vormen tot cel migratie te bestuderen. Het systeem heeft geen extra instelling of extra apparatuur, behalve een zuurkast aan organische oplosmiddelen hanteren niet noodzakelijk, waardoor het kan worden toegepast in biologische laboratoria. Vergelijkbare polymeren zoals poly (glycolzuur) (PGA), poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) en poly (caprolacton) (PCL) kan worden gebruikt met kleine modificaties. Andere macroporeuze structuren die niet zou oplossen in organische oplosmiddelen kunnen ook worden gebruikt. Voor het verkrijgen van kleinere poriegrootten (op nanoschaal) op een oppervlak een extra dunne filmlaag nanoporeuze vorming mogelijk. Dit kan worden verkregen door eerst een verdunde oplossing (1%) van het polymeer aantrekken van de top van de structuur in een zeer vluchtig oplosmiddel (bijvoorbeeld chloroform) en vervolgens onmiddellijk fasescheiding veroorzaken door onderdompeling in apure ethanol oplossing. Zo een co-kweeksysteem dat gebaseerd op een materiaal kan worden verkregen.
De teflon vormontwerp is cruciaal voor de controle van de poriegrootte de beweging van de extractievloeistof wordt hierdoor bepaald. De beweging van de extractievloeistof en de wisselkoers tussen de extractie-vloeistof en het oplosmiddel van invloed op de vorming van de poriën. De besturing kan verder worden verbeterd door toepassing van laminaire stroming van de extractievloeistof door het implantaat. De hoeveelheid extractievloeistof is een belangrijke parameter en moet worden opgesteld ten opzichte van de hoeveelheid polymeer en ook met betrekking tot de grootte van het implantaat. Voor cilindrische implantaten met 2 mm dikte en 11 mm diameter van 500 urn gevormd medische kwaliteit titaankralen een extractiebad van 200 ml nodig. Voor het bestuderen van cel migratie, PKH26 is een betere optie voor de lange termijn migratie studies terwijl Calcein-AM zorgt voor een betere waarneming van de cel morfologie. Quantification van cel beweging in de z-richting is een indirecte in vitro meting van de controle over cellulaire beweging. Ook dit systeem kan worden gebruikt voor kwantificering endotheelcellen in vitro vascularisatie van de implantaten, hetzij door directe zaaien als standaardsystemen angiogenese assays middels gel inkapseling 24.
Er zijn verschillende beschikbare nanovezel vormingsmethoden zoals electrospinning of fasescheiding, maar elektrospinning van collageen wordt algemeen beschouwd als collageenvezels denatureren. Gebruik van een poly-elektrolyt gebaseerde structuur zorgt voor het voorkomen van denaturatie, terwijl de nodige fibrillaire structuur met een hoge mate van precisie. Ook LbL methoden zijn makkelijker aan te passen voor complexe implantaat vormen. Film lagen op poreuze structuren zijn eenvoudige methoden om transwell-achtige assays te ontwikkelen met meer controle over de interactie tussen de cellulaire componenten. Het is mogelijk om, met confocal microscopie de bovenste laag op het implantaat. Dit kan worden gebruikt om de interactie van de desbetreffende primaire cellen met de multilagen in contact met het implantaat zoals epitheelcellen en endotheelcellen observeren. Ofwel geïsoleerde 25 of commercieel verkrijgbare cellen kunnen worden gebruikt. Deze filmlaag zorgt voor een oppervlak waar een binnenvoering voor een buisvormig orgaan kan worden ontwikkeld. Bijvoorbeeld, in dit specifieke geval was het de bedoeling om een kunstmatige membraan trachea ontwikkelen, en deze structuur is getoond voor ademhalingsepitheel 23 zijn.
Dikte van de laag is vastgesteld op een niveau waar de film is dik genoeg om op te treden als een barrière (24 bi-lagen). Zowel titanium en titanium alleen / PLLA implantaten vanwege de hydrofobiciteit van het substraat een relatief vlakke filmlaag kan worden gevormd op de implantaten, waarbij de poriën bijdragen aan de stabiliteit van het grensvlak tussen de structuur en de nieuw gevormde folielaag. Onder de beschikbare verknoping methods, genipin verknoping is het meest geschikt voor dierlijke experimenten. Andere verknopende werkwijzen zoals glutaraldehyde, EDC / NHS kunnen ook worden gebruikt, maar meestal tot minder celhechting. Een andere mogelijkheid is fotoverknoopbare collageen gebruiken 26.
Eiwitsequentiebepaling is een veelbelovende methode voor het bewaken implantaat, omdat het meer zou kunnen bieden diepgaand inzicht. Volgens de aard van de eiwitten verkregen, is het mogelijk om de systemische effecten van de implantatie afleiden alsmede nauwlettend mogelijke infecties die bijzonder belangrijk zijn voor gevallen waarin het implantaat niet in een afgesloten ruimte, zoals in het geval van tracheale implantaten . Vroege opsporing van infecties kan leiden tot preventie van infectie-gerelateerde complicaties in een tijdige wijze. De HPLC-profiel kan meer informatie in vergelijking met enkele karakterisering van een bepaald eiwit, zoals CRP of CGA als meerdere pieken met verschillende eiwitten van belang te voorzien kan verkrijgened met deze methode. Bijvoorbeeld, alfa-en bèta-hemoglobine ½ kettingen voor konijnen met tracheale implantaten hebben aangetoond soortgelijke trends met CRP waarden in onze volledige tracheale vervangende model. Dergelijke flexibiliteit zou te verlenen voor bepaling van minuten systemisch effect zeer nauwkeurig met de verbetering van de beschreven technieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
NE Vrana is een medewerker van Protip SAS.
Acknowledgments
Auteurs willen graag Dr Andre Walder en Nicolas Perrin voor het vervaardigen van titanium implantaten, K. Benmlih bedanken voor de opbouw van de Teflon matrijzen en dr. G. Prevost voor zijn hulp bij dierproeven. Wij erkennen ook de regio Elzas en PMNA (Pole Materiaux et nanowetenschappen d'Alsace) voor de financiële bijdrage.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 360481 | Toxic material, Strictly under chemical hood |
| PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g |
Sigma-Aldrich | 94829, 81273 | The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent. |
| PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate) | Novamatrix | 4200006 | Low viscosity(20-200 mPa.s) |
| Collagen type I (Bovine) | Symatese | CBPE2US100 | |
| Pen/Strep, Fungizone | Promocell | C42020 | |
| Genipin | Wako | 0703021 | |
| Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. | Bruker | MSCT | |
| Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0% | Sigma-Aldrich | 302031 | Hazardous Material, Please follow MSDS carefully |
| Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9% | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | C3100MP | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit | Genway Bio | GWB-9BF960 | |
| DMSO, Bioreagent, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Equipment | |||
| Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope | Bruker | ||
| Procise microsequencer | Applied Biosystems | ||
| Ultima 3000 HPLC system | Dionex | ||
| Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100 | Hitachi | ||
| Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 | Zeiss | ||
Table 1. List of Materials and Reagents. |
|||
References
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat. Mater. 4, 518-524 (2005).
- Ryan, G., Pandit, A., Apatsidis, D. P. Fabrication methods of porous metals for use in orthopaedic applications. Biomaterials. 27, 2651-2670 (2006).
- Schultz, P., Vautier, D., Charpiot, A., Lavalle, P., Debry, C. Development of tracheal prostheses made of porous titanium: a study on sheep. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 264, 433-438 (2007).
- Janssen, L. M., et al. Laryngotracheal reconstruction with porous titanium in rabbits: are vascular carriers and mucosal grafts really necessary. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 4, 395-403 (2010).
- Li, J. P., et al. Bone ingrowth in porous titanium implants produced by 3D fiber deposition. Biomaterials. 28, 2810-2820 (2007).
- Schultz, P., et al. Polyelectrolyte multilayers functionalized by a synthetic analogue of an anti-inflammatory peptide, alpha-MSH, for coating a tracheal prosthesis. Biomaterials. 26, 2621-2630 (2005).
- Müller, S., et al. VEGF-Functionalized Polyelectrolyte Multilayers as Proangiogenic Prosthetic Coatings. Advanced Functional Materials. 18, 1767-1775 (2008).
- Mills, R. J., Frith, J. E., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J. Effect of Geometric Challenges on Cell Migration. Tissue Engineering Part C-Methods. 17, 999-1010 (2011).
- O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 26, 433-441 (2005).
- Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26, 5474-5491 (2005).
- Budyanto, L., Goh, Y. Q., Ooi, C. P. Fabrication of porous poly(L-lactide) (PLLA) scaffolds for tissue engineering using liquid - liquid phase separation and freeze extraction. J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, 105-111 (2009).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
- Chaubaroux, C., et al. Collagen-Based Fibrillar Multilayer Films Cross-Linked by a Natural Agent. Biomacromolecules. 13, 2128-2135 (2012).
- Huang, Y., Siewe, M., Madihally, S. V. Effect of spatial architecture on cellular colonization. Biotechnology and Bioengineering. 93, 64-75 (2006).
- Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Unger, R. E. Co-culture systems for vascularization - Learning from nature. Advanced Drug Delivery Reviews. 63, 291-299 (2011).
- Lavalle, P., et al. Dynamic Aspects of Films Prepared by a Sequential Deposition of Species: Perspectives for Smart and Responsive Materials. Advanced Materials. 23, 1191-1221 (2011).
- Zhang, D., et al. Serum concentration of chromogranin A at admission: An early biomarker of severity in critically ill patients. Annals of Medicine. 41, 38-44 (2009).
- Goh, Y., Ooi, C. Fabrication and characterization of porous poly(l -lactide) scaffolds using solid - liquid phase separation. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, 2445-2452 (2008).
- Vrana, N. E., et al. Modification of macroporous titanium tracheal implants with biodegradable structures: Tracking in vivo integration for determination of optimal in situ epithelialization conditions. Biotechnology and Bioengineering. 109, 2134-2146 (2012).
- Dupret-Bories, A., et al. Development of surgical protocol for implantation of tracheal prostheses in sheep. J. Rehabil. Res. Dev. 48, 851-864 (2011).
- Gasnier, C. Characterization and location of post-translational modifications on chromogranin B from bovine adrenal medullary chromaffin granules. Proteomics. 4, 1789-1801 (2004).
- Vrana, N. E. Hybrid Titanium/Biodegradable Polymer Implants with an Hierarchical Pore Structure as a Means to Control Selective Cell Movement. PLoS ONE. 6, e20480 (2011).
- Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. W. Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032 (2012).
- Dong, C. -M., et al. Photomediated crosslinking of C6-cinnamate derivatized type I collagen. Biomaterials. 26, 4041-4049 (2005).
