Summary
在这段视频中，我们将演示多孔金属植入物的改性技术，以提高它们的功能和控制细胞迁移。这些技术包括孔梯度发展，控制细胞的移动3D和生产基底膜模仿在2-D控制细胞运动。此外，描述一个基于HPLC的监测方法，通过分析血液中的蛋白质被检体内的植入物的整合。
Abstract
金属植入物，特别是钛植入物，在临床应用中被广泛使用。这些植入物在组织中的组织生长和集成是成功的临床结果的重要参数。为了提高组织整合，多孔金属植入物已被开发出来。开口孔隙率的泡沫金属是非常有利的，因为可官能化的孔区域，而不会影响整个结构的机械性能。在这里，我们描述了这样的修改，使用基于钛微球多孔钛种植体。通过使用固有的物理特性，如疏水性的钛，未能取得基于微珠的金属植入物内，并在同一时间有基底膜模仿基于亲水性的，天然的聚合物的疏水性的孔隙梯度。三维孔隙梯度形成的合成聚合物，例如聚-L-乳酸（PLLA）冷冻提取方法。 2D nanofibrillar河畔面形成有通过使用胶原/藻酸盐，然后用天然的交联剂交联步骤（京尼平）。此nanofibrillar电影始建层层沉积法（LBL）两种带相反电荷的分子，胶原蛋白和海藻酸。最后，在不同的区域可以容纳不同类型的细胞，因为这是所必需的许多多细胞组织的植入物，可以通过以下方式获得。通过，这样一来，可以控制由不同的细胞类型的细胞在不同方向的运动。气管再生为特定的情况下，描述了这样的系统，但它可以被修改为其它靶器官。细胞迁移和可能的方法来创建不同孔径梯度分析阐述。这种植入物的分析的下一个步骤是在植入后的表征。然而，金属植入物的组织学分析是一个漫长而繁琐的过程，从而为监控主机的金属植入物的反应在体内是一个基于CGA和不同血液中的蛋白质监测延误保障的方法也作了说明。这些方法可以用于开发量身定制在体外迁移和定植测试的，也可用于官能化的金属植入物在体内无组织学分析。
Introduction
目前可用的金属植入物是适合承载的应用程序，但他们的非降解必须设计保证了强劲的接口与周围组织的其中1个。通过提供结构，促进细胞生长和定植在体内的金属植入物的寿命可以延长。公开多孔金属植入物有前途的组织界面工程材料，也为确保良好的殖民化的植入物。他们一直在积极作为骨科植入物及气管植入3-5。但是，仍然存在一些问题需要解决，如细胞的运动精确地控制孔隙区域。不控制这个过程可能会导致不完全的殖民统治，在一端，并在其他的再狭窄。这些植入物的进一步官能化是必要的，为实现更高的功能，如生长因子，送货，直接血管和不同的细胞类型6-8的同步运动。对于气管植入物，植入血管组织的殖民化是可取的，这一点是至关重要的。然而，不受控制的组织内生长气管管腔是不希望的，因为它降低植入物通畅。
控制细胞运动的可能性之一是尺寸排阻。知道的靶细胞和与一个给定的合成聚合物的能力的大小，有可能开发的孔可有效地确定细胞运动的深度的梯度。例如，通过创建一个孔结构是足够大，可以实现结缔组织细胞如成纤维细胞腔外，但足够小（小于10μm），以防止其移动腔内定植的管状植入物有效控制有关条目。
从可用孔隙创建方法，如冷冻dryi纳克，颗粒浸出，气体发泡9,10;最简单的方法以适应快速形成的孔隙梯度少量必要的设备是冷冻萃取11。在该方法中，聚合物溶液的有机溶剂和水的二元混合物中冻结。之后，将溶剂交换通过预冷的可混溶的液体（如乙醇）萃取。冻结和提取条件确定的孔的形状和大小，和如果提取的提取液的运动可控制的方式进行的，孔的大小和形状可以是定向调制。
第二步是多细胞组织形成不同类型的细胞，以控制它们的相互作用多孔之间的壁垒。不同的细胞类型，根据他们的要求12,13不同的微环境的可用性，这也是必要的。气管是一个管状器官连接喉与支气管（一）它有一个内在的假复层纤毛上皮衬里interdispersed产生粘液的杯状细胞。的三维结构和气管稳定保持在C环的形状的软骨。因此，在一个人工气管内，应该有一个定义的结缔组织和睫状体上皮细胞层之间的交界处。的结缔组织部分的三维结构是必要的，上皮细胞的迁移需要基底膜状的表面，以实现定向运动和关闭伤口。聚电解质多层膜（PEM）等是一个可能的选项来获得基底膜模仿。层 - 层的方法（层层）是一种多功能的过程中获得薄的和功能性的表面涂层。它是基于静电相互作用的两个带相反电荷的聚电解质和积聚在以连续的方式，获得纳米级的表面涂层，其属性可以是多种多样的，通过简单地改变的变量，如聚电解质的种类，pH值，层的数目，此外，覆盖层，交联等，其中的LbL方法的主要优点是它能够以符合下面的衬底的地形。因此，在受控的条件下，该方法也可以被用来获得多孔结构的表面覆盖率。如果胶原被用作聚电解质，它有可能取得的nanofibrillar结构，可以模仿基膜的表面。钛的疏水性使这种结构的发展和fibrillarity可以保存在厚厚的涂料14。这种方式附着和细胞的表面上的运动也可以被控制。通过依次使用冷冻提取和层层薄膜包衣，在细胞的运动，可以控制横向，纵向和圆周方向的结构，可以通过以下方式获得15。
这里，我们描述了两个新的修改的方法，利用其疏水性的行为，它可以是钛种植体扩展到修改的各种多孔植入物：ⅰ）形成的微孔梯度内的大孔与疏水性的，合成的聚合物，ⅱ）形成一个厚厚的支持细胞生长和聚电解质多层膜的衣料形成的植入物表面上的聚合物薄膜层的钛植入物。这些方法可以顺序地或单独地使用。他们提供结构确保控制迁移和空间组织的多细胞组织不同类型的细胞16,17。气管的具体情况下，植入物所期望的结果将是由纤维血管组织内没有再狭窄和纤毛上皮细胞上的聚电解质多层膜的内衬形成微孔梯度定植。
控制整合植入的方法之一是做小的外科手术期间，他们的主机集成在原地 。为了能够吨ö决定干预的定时，重要的是有信息的植入物上的全身效应。 C-反应蛋白（CRP）已被用于监测感染和炎症反应在临床设置。嗜铬粒蛋白A（CGA）也可以以类似的方式使用，并可能提供更准确的结果，观察到的水平，炎症18。观察金属植入物在体内的集成作为一种可能的方式中，我们提出了一种植入物的全身效应的表征动物的血液样品，用高压液相色谱法（HPLC）和随后的蛋白质测序连续监测过程。拟订这种方法可以用来逃避定期终点组织学分析。金属植入物的组织学切割是一个长期的，繁琐的和昂贵的过程，可以只在特定时间点进行。因为这个原因，精心设计提供强大的信息植入健康的血液测试最近的欧盟关于动物实验的规则所规定的，是可能的路由，以减少动物实验。
这里介绍的方法可用于提高性能的金属植入物，通过官能化或监测现有的植入物的另一种方式。
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Protocol
1。在孔的金属植入物的制备微孔梯度
- 清洁植入物（如医用级钛有孔玻璃珠的大小范围为400-500微米，法国Neyco SAS，制成的植入物）的乙醇中，然后在丙酮中超声处理15分钟。
- 根据植入物的大小和形状（对于标准的实验中，使用2厘米高度1.5厘米直径的圆筒状的模具）的设计和制造聚四氟乙烯模具。模具应该是模块化的，因此在提取过程中的某些部分可以被删除。这种模具的设计确保在提取过程中的控制，通过强制的提取液中的运动以定向的方式。
- 管形植入物的设计，以取代气管的结构应该是由三件：ⅰ）的底部部分的大小来决定的植入物，ⅱ）的心轴以及iii）一个外芯，这是可移动的。通过这种方式，可以形成孔径梯度从外部向内侧。 <LI>准备合成聚合物（PLLA）解决方案：对于需要准备冻结/提取聚乳酸溶液在二恶烷和水（87:13，V：V）的二元混合物。
- 把混合物加热到60℃，以便获得均匀的溶液。 60℃的选择，因为它是为精密玻璃注射器的溶液引入到植入物已被使用的耐温性更高的极限。
- 如果高浓度（≥6％），高分子量的聚乳酸的解决方案的使用，引入该溶液，立即加热后进入植入物。否则凝胶溶液发生不充分浸泡。
- 计算所需的聚合物溶液的体积相对于植入物的孔隙度，在冷冻溶液的体积的准确度变化可以被考虑在内。
- 到0.1μL精度的精密玻璃注射器植入介绍的解决方案。的聚合物浓度的下限值是孔梯度形成重复性的3％，而变得难以得到均匀分布在6％以上的厚的样品。然而，对于特定的应用程序，可以使用其它浓度。
- 冻结的样品可直接在-80℃或30分钟，在室温下与现有的潜伏期。冷冻条件确定部分的孔形成的，因而冷冻的条件下可以进行调整的孔隙率，旨在保持在-80℃下的样品过夜
- 提取：80％预冷的乙醇浸泡植入。在-20°C进行提取过夜。要获得孔隙率梯度，删除所有模具零件的管状植入物和所有的部件，除了底部圆盘形植入芯棒除外。使用预冷的手术刀的模具，以方便分离。
- 萃取后在-20℃下保温过夜19，除去剩余的模具部件和空气干燥的植入物。为表征的的结构压汞仪分析的整体的孔隙率是必要的。汞孔度计测量表现出明显的峰值对应的植入物和的小interdispersed的毛孔的两面上的孔。然而，是较为重要的数据是腔内表面和腔外表面，可以分析图像J的孔径分布用扫描电子显微镜（SEM）20的孔隙率之间的差异。为了核实孔梯度，冷冻断裂样品，并用SEM观察横截面。
- 由于开放的多孔性质，所用的植入物，和乙酸的光反射能力，这是可以做到的z轴堆栈的标记细胞在多孔植入物。标记细胞与PKH26或钙黄绿素-AM和可视化的激光共聚焦显微镜植入。
2。表面涂层与胶原/海藻酸钠多层的多孔金属植入物
- 对于建立多层，最高的可重复性浸渍机器人。但是，如果浸渍机器人，不提供这些步骤可以手动完成。
- 使用医疗级胶原蛋白I型和海藻酸钠。的优化浓度0.5 g / L的150 mM氯化钠在pH 3.8的柠檬酸盐缓冲液中的每个。
- 溶解胶原溶液过夜，以确保溶液的均匀性。为3.8的酸性pH值是必要的稳定的积聚层，在中性pH条件下的交联前的结构是不稳定的。
- 植入胶原蛋白和海藻酸钠溶液交替浸泡，浸渍机器人系统的沉积层。每个后续层沉积时间为15分钟。冲洗5分钟用150 mM氯化钠在pH 3.8的沉积步骤之间的结构。
- 设计特定的人利用植入物浸渍聚电解质多层生产中使用的机器人。沉积层，无论是钛的表面只有IMPLANTS或植入修改，如第1节所述。
- 基底膜的镇定模仿与京尼平：准备交联溶液中的二甲亚砜（DMSO）/柠檬酸盐缓冲液（150mM的氯化钠，pH值3.8）在1:4 v：V比。宽的浓度范围内，可以使用，和100mM是足够的交联。溶解京尼平首先在二甲基亚砜组件，稍后加水成分，以避免结块。
- 交联样品的交联溶液中浸泡12-24小时之间。之后用清水冲洗以大量的柠檬酸缓冲液（pH值3.8）。
- 洗涤步骤后，使用UV处理（30分钟）或抗生素/抗真菌浴（青霉素/链霉素，两性霉素B）灭菌样品。
- 确定基底膜模仿的质量的主要参数是它的厚度和纤维的直径。计算纤维直径，利用原子力显微镜（AFM）在接触模式下获得的图像。干燥样品的成像前的氮气流量。量化的每幅图像中的至少10根纤维的厚度，以确定原纤维的平均厚度的Image J软件。
- 薄膜的厚度可以通过原子力显微镜（AFM）的划痕试验。干（COL / ALG）24 / COL多层的薄膜。用注射器针头划伤膜。经过本地化的划伤用光学显微镜，获得10×10微米的表面划痕的边界与AFM图像。计算的高度，用AFM软件，它提供的薄膜层的厚度得到的档案。
3。 在体内植入集成间接监测血浆分析
- 所有的，应当采取必要的委员会的批准用于动物实验，根据每个国家的21对管限规则。在我们的情况下，指南的保养和使用实验动物（国家研究委员会，2010）其次是和日ê斯特拉斯堡大学伦理委员会的批准。
- 在目标站点植入。被用于新西兰大白兔15毫米气管切除气管置换协议，这里给出的血液监测。
- 植入后每天随访是必要的，如监控中一般动物的福祉（愈合的手术部位，呼吸速率），并记录他们的体重左右。
- 为了验证血液测试，使用一套行之有效的方法，如酶联免疫吸附试验血CRP水平。许多动物的CRP测试可用于兔特定的测试列于表1。同样，使用免疫印迹CGA水平的决心。这个协议被用于单克隆抗的CGA抗体（抗-CGA 47-68）。
- 等离子体特性，获得兔耳缘静脉血液样本。在5,000 rpm离心20分钟，在4°; C.使用得到的上清液进行分析。在我们的程序中，这些测试是每周的基础上完成的，但也可以更频繁的测试。
- 反相HPLC纯化的血浆蛋白含量：提取兔血浆中，用0.1％三氟乙酸（1:1，体积比）。纯化的提取物，通过在Dionex HPLC系统（终极3000;美国加利福尼亚州森尼韦尔）上的的反向NUCLEOSIL相300-5C18柱（4×250毫米，颗粒大小为5μm;孔隙度，300）。
- 记录在214和280 nm处的吸光度。所用的溶剂体系是ⅰ）溶剂A：0.1％（体积/体积）三氟乙酸（TFA）在水和ii）溶剂B：0.09％（体积/体积）TFA的70％（体积/体积）的乙腈 - 水。
- 使用流速为700微升/分钟，使用梯度洗脱。收集高峰组分。集中零碎蒸发速度真空应用。重要的是要完全干燥之前停止速度的真空。
- 在不同的时间点通过合作获得相关峰植入期URSE。使用纯化的肽，示出一致的趋势，在植入过程中，通过自动Edman测序鉴定。
- 自动Edman测序的肽：确定通过自动Edman降解法使用PROCISE微定的纯化的肽的N-末端序列。加载样品，聚凝胺处理的玻璃纤维过滤器。下一个步骤是通过色谱法在一个用C 18柱（PTH C-18，2.1×200毫米）22识别酰苯硫脲氨基酸（PTH的Xaa）。后得到的序列，它可以被识别由高炉软件使用SWISS-Prot数据库。
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Representative Results
孔梯度的形成
通过改变聚乳酸溶液的浓度，它是可能的植入物上的腔外侧的孔的大小来控制。孔隙的大小和形状显着影响的钛植入物的存在下（ 图1a和1b）。孔径大小范围为40-100微米，利用较低的浓度导致在更小的孔隙。然而，在所述管腔内侧面孔径大小是受限制的提取，约9微米23，成纤维细胞的平均尺寸小于。通过添加，在室温下温育步骤的双重孔隙结构，其中的大孔隙的孔壁上有他们自己的孔隙度可以得到。此功能是很重要为厚的植入物，因为这将促进气体和营养物的运动（ 图1c）。
Nanofibrillar基底膜模仿形成
图2）。此薄膜层之上的聚乳酸发泡体，是稳定的，它也可以被保持在表面上的泡沫的情况下（ 图3a和3b）。纳米级的胶原纤维形成作为薄膜层的增长（ 图3c）。膜的生长指数，从而几百纳米厚的膜，可以通过以下方式获得（ 图3d）。
用高效液相色谱法分析血浆和随后的测序植入后
多孔钛植入物与宿主组织整合的和在体内 4-6周之间（ 图4）被完全填充。然而，继续在此过程中可导致再狭窄，由于PLLA结构的孔隙梯度的存在下，没有观察到成纤维细胞的存在折后6周的植入20。在此期间，HPLC分析显示明显的峰，在时间过程中植入波动。所感兴趣的馏分峰值测序，并确定为α和β血红蛋白½链（ 图5），表现出了类似的趋势，与CRP读数。
图1。孔隙梯度的形成方法，通过冷冻提取方法的多孔聚乳酸发泡体的制备SEM照片（A）无孔钛种植体（外）（B）与孔钛种植体（外）（C）与孔钛种植体（内部）。植入物的存在下，改变了孔的形态，（C，D）相同的过程可以是APPL IED管状结构，以获得在管状植入物的孔梯度点击这里查看大图 。
图2。多功能的植入物开发计划。从开始基于微珠的多孔植入物，此外，可以得到孔径梯度的合成聚合物基泡沫。孔隙梯度的形状的控制部分的结构的模具。在此结构中除一个基底膜样结构，可以添加，这将提供一个合适的表面细胞附着和衣料形成在2D。
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图3。 Nanofibrillar多层形成基底膜模拟天生钛植入物上 。具体可以形成厚的胶原/海藻酸钠多层膜（A）仅乙酸植入物（珠的平均大小为400-500微米）（B）的乙酸/ PLLA杂交泡沫的表面上。 （C）上 nanofibrillar性质的多层膜的AFM分析（扫描范围：30微米×30微米）（D）的厚度，其特征在于，该表面（约1μm厚）提供的底物的附着和增殖的内皮细胞多层膜是由划痕试验。 点击这里查看大图 。
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图4。 在兔体内的多孔钛植入物的整合 。 haemotoxylin精-伊红染色的取出的植入物的横截面（A）的多孔区域可以完全填充在体内的4-6周的期间内（B）的孔隙内的组织是一个成熟结缔组织与血管形成一个良好的水平。
图5。监测血浆中的蛋白质含量超过通过HPLC注入的过程中和随后的测序。代表高效液相色谱的曲线显示从动物的血液样本得到的峰，3，4和6周后，分别植入（左上，右上，左下方）。每个峰对应于一个特定的蛋白质。的差异在高峰对应于给定的蛋白质，它可以由测序（如α，β-血红蛋白½链）的相对丰度。 点击这里查看大图 。
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Discussion
孔隙梯度接口组织工程中是重要的工具，这里描述的系统可以单独使用，或与金属植入物一起使用，以形成孔梯度，来研究细胞迁移。该系统并不需要任何额外的设置或除了化学通风柜处理有机溶剂的以外的额外的设备，因此它可以被应用在生物实验室中。可以使用类似的聚合物，如聚（乙醇酸）（PGA），聚（乳酸 - 乙醇酸）共聚物（PLGA），聚（己内酯）（PCL），有轻微的修改。也可以用其他的大孔结构，将不溶于有机溶剂。为了获得较小的孔体积（纳米级）的一个表面上，一个额外的薄膜纳米多孔膜层形成也是可能的。这可以通过以下方式获得的结构的顶部上，首先把该聚合物的稀溶液（1％），在高挥发性溶剂（如氯仿），然后立即浸渍在ap中引起相分离URE乙醇溶液。以此方式，共培养体系中，可以得到仅是基于一种材料。
作为提取液的运动，是由这个聚四氟乙烯模具设计的细孔径的控制是至关重要的。萃取，萃取液和萃取，萃取液和溶剂的影响形成气孔率之间交换的移动。由应用程序通过植入物的萃取流体的层流的控制，可以进一步提高。提取液的量是一个重要的参数，它相对于所用的聚合物的量，相对于植入物的大小也应安排。对于2mm厚和11毫米直径为500μm的医用级钛珠形成的圆筒形植入物与200毫升萃取浴是必要的。为了研究细胞迁移，PKH26长期迁移研究是一个更好的选择，而钙黄绿素-AM提供了一个更好的观察细胞形态。第四纪细胞ntification在z方向上的运动是一种间接的体外测量的控制通过蜂窝移动。此外，此系统可用于与内皮细胞在体外血管化的植入物的定量，可以通过直接播种，或使用标准的血管生成的检测，使用硅胶封装24。
有几个可用的纳米纤维的形成方法，如静电或相分离，但通常被认为是静电纺丝的胶原蛋白，胶原纤维变性。利用基于聚电解质的结构，确保变性的预防，同时提供必要的纤维状结构的高精确度。层层方法是复杂的植入物的形状更容易适应。多孔结构的薄膜层是简单的的transwell小像检测方法来开发更多的控制权的细胞成分之间的相互作用。这是可能的与confoca观察升显微镜顶层植入。这可以被用来观察与多层膜的上皮细胞或血管内皮细胞的植入物，如在接触相关的原代细胞的相互作用。无论是分离的25或市售的细胞都可以使用。此薄膜层提供了一个表面，其中可开发的管状器官的内衣料。例如，在这种特定的情况下，其目的是开发一种人造气管的膜，这种结构被证明是适用于呼吸道上皮细胞23。
该层的厚度被设定在一定的水平，其中膜是足够厚，以作为一个屏障（24双向层）。在这两种钛和钛/ PLLA植入物，由于基板的一个相对平坦的薄膜层的疏水性，可以形成上的植入物，其中的孔的结构和新形成的薄膜层之间的界面的稳定性。我在现有的交联thods，京尼平交联是最合适的动物试验。其他如戊二醛交联方法，EDC / NHS也可以使用，但它们一般会导致较少的细胞附着。另一种可能性是使用光致交联的胶原蛋白26。
蛋白质测序是一种很有前途的方法，植入的监视，因为它可能提供更深入的了解。根据获得的蛋白质的性质，它是可能推断出注入的全身效应，并密切监测可能的感染，这是特别重要的情况下，植入物是在一个密封的区域，如在气管内植入物的情况下。早期发现的感染可导致感染相关并发症，及时预防。 HPLC图谱可以提供更多的信息相比单表征一个给定的蛋白质如CRP或CGA几座山峰几种蛋白质的利益可以得到用这种方法。例如，α和β血红蛋白链半气管植入兔已显示出类似的趋势，与CRP读数全气管换代车型。这样的多功能性，将提供场地测定分钟的全身效果非常准确地描述的技术与改善。
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Disclosures
NE弗拉纳雇员的Protip SAS。
Acknowledgments
作者想感谢安德烈沃尔德博士和尼古拉斯·佩兰制造钛种植体，K. Benmlih为积聚的聚四氟乙烯模具和G.普雷沃博士对他的帮助与动物实验。我们也承认本地区阿尔萨斯和PMNA的（极MATERIAUX等纳米科学阿尔萨斯）的财务贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 360481 | Toxic material, Strictly under chemical hood |
| PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g |
Sigma-Aldrich | 94829, 81273 | The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent. |
| PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate) | Novamatrix | 4200006 | Low viscosity(20-200 mPa.s) |
| Collagen type I (Bovine) | Symatese | CBPE2US100 | |
| Pen/Strep, Fungizone | Promocell | C42020 | |
| Genipin | Wako | 0703021 | |
| Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. | Bruker | MSCT | |
| Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0% | Sigma-Aldrich | 302031 | Hazardous Material, Please follow MSDS carefully |
| Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9% | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | C3100MP | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit | Genway Bio | GWB-9BF960 | |
| DMSO, Bioreagent, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Equipment | |||
| Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope | Bruker | ||
| Procise microsequencer | Applied Biosystems | ||
| Ultima 3000 HPLC system | Dionex | ||
| Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100 | Hitachi | ||
| Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 | Zeiss | ||
Table 1. List of Materials and Reagents. |
|||
References
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