Summary
כאן, אנו משתמשים התמרה retroviral וtransfection concatemeric כדי ליצור שורת תאים שיכולים לבטא את הרכיבים של וקטור lentiviral (LV) בהיעדר טטרציקלין. זה LV מקודד GFP וPseudotyped עם גליקופרוטאין, SVGmu, שהוא ספציפי לקולטן על תאים דנדריטים.
Abstract
וקטורי lentiviral (LVS) הם אמצעי רב עוצמה להעברת חומר גנטי לסוגים רבים של תאים. בגלל חששות בטיחות הקשורות לוקטורי HIV-1 הנגזרים אלה, מפרישים כמויות גדולות של LVS הוא מאתגר. במאמר זה, אנו מדווחים על שיטה לייצור titers גבוהה של LVS עצמי inactivating. אנו retrovirally transduce ט פעמי היציב מפיק תא הקו GPR כדי ליצור שורת תאים, GPRS, שיכול לבטא את כל המרכיבים הנגיפיים, כולל גליקופרוטאין תא ספציפי הדנדריטים, SVGmu. לאחר מכן, אנו משתמשים transfection DNA concatemeric לtransfect קידוד פלסמיד העברת LV GFP גן כתב בשילוב עם סמן לבחירה. כמה משיבוטי כתוצאה מכך יכול לייצר LV בכייל פי 10 יותר ממה שנשיג עם transfection חולף. בנוסף, וירוסים אלה ביעילות transduce תאים דנדריטים במבחנה וליצור תגובה חיסונית חזקה תא T לאנטיגן הכתב שלנו. שיטה זו עשויה להיות אפשרות טובה עבורr ייצור חיסונים מבוססי LV חזקים למחקרים קליניים של סרטן או מחלות זיהומיות.
Introduction
מערכות וקטור רבות פותחו למסירת גן. וקטורים המבוססים על lentiviruses היו בין המערכת נגיפית למדה הנפוץ ביותר. וקטורים אלה הם יתרון משום שהם יכולים ביעילות transduce גם החלוקה ולא חלוקת תאי 1, להשיג ביטוי לטווח ארוך בשל אינטגרציה לתוך הגנום המארח, מפגין חסינות נגד וקטור טבעי נמוכה ברוב האוכלוסיות אנושיות 2, ויש להם פוטנציאל נמוך ל genotoxicity מmutagenesis insertional 3,4.
ייצור של lentiviruses מאז ומתמיד שנצבעה על ידי חששות בטיחות. וקטורי lentiviral בדרך כלל נגזרים מHIV-1, הסוכן האטיולוגי של איידס. transfection חולף של רכיבים בודדים של Lentivector (העברה, מעטפה, ופלסמידים אריזה) הוא אמצעי נפוץ וגמיש להעברת חומר גנטי בהגדרות מעבדה. עם זאת, דרוג-up transfections חולף ליישומים קליניים הוא מסורבל ואמאy להוביל להתפתחות של lentivirus שכפול מוסמך 5,6. כדי להתגבר על המכשולים הללו, שורות תאים המפיקים כמה אריזות ויציבים פותחו 6-11. יש לאחד את השורות האלה, קו אריזת GPR 11, היתרון האטרקטיבי של להיות מוסדר על ידי טטרציקלין. במאמר זה, אנו מדגימים כיצד להתאים את המערכת הזו כדי לייצר וקטורי inactivating עצמי lentiviral המיועדים באופן ספציפי לתאים דנדריטים (DC-LVS) 12.
תאים דנדריטים (DCS) הם תאי מציגי אנטיגן החזקים ביותר של המערכת החיסונית. הם היו הנושא של עניין רב בפיתוח חיסון לסרטן משום שהם מפעילים ישירות, תכנית, ולווסת תגובות חיסוניות ספציפיות לגידול 13. שילוב פרוטוקול חיסון לכלול DCs יש פוטנציאל לעורר תגובה חיסונית חזקה יותר מאשר חיסוני antitumor פפטיד או ה-DNA. לאחרונה, פיתחנו וקטור lentiviral שspecifically מטרות תאים דנדריטיים באמצעות שינוי גליקופרוטאין וירוס sindbis, SVGmu 14. וקטורים אלה הם ייחודיים בכך שהם מראים סגוליות גבוהים לתאים דנדריטים ולייצר תגובה חיסונית חזקה יותר מאשר וקטורים ספציפיים, VSVg-Pseudotyped.
כאן, אנו מדווחים על שיטה להפקת כמויות גדולות של וקטורי lentiviral DC במיקוד אלה. אנו מראים כי אלה DC-LVS יכול להדביק DCs וליצור CD8 + T תגובות תא חיסוניים חזקות. כל ההליכים כרוכים בבעלי חיים בוצעו אנושי, תחת האישור של הטיפול בבעלי חי Intitutional USC ועדת שימוש. על מנת לבצע בניסויי vivo וקליניים, זה קריטי כדי ליצור שורת תאים שיכולים לייצר נגיף בכייל גבוה. ביצוע ההתמרה וtransfection הצעדים בדיוק כפי שתוארו יהיה למקסם את הסיכויים ליצירת שיבוט כזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
תאי מפיק יציבים DC-LV בנויים על בסיס 11 שורת תאי אריזת GPR המכיל את הרכיבים הדרושים lentiviral מערכת ט את gagpol, מתניע ו. ראשית, הוא משמש התמרה retroviral כדי ליצור שורת תאי אריזת GPRS המקודדת גליקופרוטאין SVGmu ט תלוי. לאחר מכן, משמשת transfection מערך concatemer לtransfect קו הסלולרי GPRS עם transgene וקטור lentiviral כגון ה-GFP. הקו הזה יציב מפיק התא, המיועד כLV-MGFP, ניתן לבדוק במבחנה in vivo ליכולת שלה לייצר חיסון DC-LV כנגד ה-GFP.
1. יצירת שורת תאי SVGmu ט תלויה
פלסמיד PRX-SVGmu הוא מבנה שבו SVGmu גליקופרוטאין DC הספציפי הוא משובט מורד הזרם של אמרגן TTA-המתקדם של retroviral פלסמיד pRetroX-ט-off 1 (איור 1 ג). 293T תרבות תאי D10 (המדיום השונה Dulbecco של הנשר עם10% בסרום שור עוברי, 2 מ"מ L-גלוטמין). קו תרבות GPR אריזה בתא D10 עם דוקסיציקלין (1 ng / ml) וpuromycin (2 מיקרוגרם / מ"ל). כל התאים בתרבית humidified 37 ° C חממה עם 5% CO 2.
- 16-18 שעות לפני transfection החולף, צלחת 2 x 10 6 תאים ב293T 4 מ"ל של D10 בצלחת תרבית רקמה של 6 ס"מ כך שהתאים מתקרבים 90% confluency בזמן של transfection.
- Transfection של פלסמידים retroviral: לערבב 100 μl CaCl פתרון, מים 1.25 מ '2 סטרילי מילי-Q ואת פלסמידים הבאים: 5 מיקרוגרם PRX-SVGmu, 2.5 מיקרוגרם pGag-Pol, 2.5 מיקרוגרם pVSV-G. הנפח הסופי הוא 500 μl. לצינור קלקר מסביב לתחתית 5 מ"ל, להוסיף 500 2X בהרוורד μl (50 HEPES מ"מ, 10 מ"מ KCl, 12 מ"מ, 280 מ"מ דקסטרוז NaCl, 1.5 מ"מ Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, pH 7.05). הוסף dropwise תערובת פלסמיד לתוך מאגר HBS 2X תוך מבעבע החיץ נמרצות עם זכוכית פיפטה פסטר. לאחר הוספת מיילxture, ימשיך מבעבע לשנייה עוד 30. לאחר מכן, מוסיף את כל התערובת על גבי תאי 293T במנת התרבות של 6 ס"מ, ולדגור על 37 ° C.
- 4 שעות לאחר transfection, להחליף בזהירות בינונית בצלחת התרבות עם 4 D10 מחומם מראש מ"ל.
- ספין זיהום: 48 שעות לאחר transfection, קציר SVGmu-קידוד חלקיקי retroviral בsupernatant על ידי העברת supernatant דרך מסנן 0.45 מיקרומטר. צלחת תאי אריזת GPR בצלחת 24 גם ב2 x 10 4 תאים / היטב. הוסף מסונן supernatant לתאי GPR אריזה בצלחת (2 מ"ל גם /) ותאי צנטריפוגות במשך 90 דקות ב 1050 XG ו25 ° C. שנה בינונית לD10 הטרי עם דוקסיציקלין (1 ננוגרם / מ"ל) אחרי ספין זיהום (2 מ"ל גם /).
- 72 שעות לאחר transfection, להרחיב את התרבות של תאי transduced אריזה בD10 עם דוקסיציקלין (1 ng / ml) וpuromycin (2 ng / ml).
- כדי לאשר את הביטוי של SVGmu, תרבות התאים ללא דוקסיציקלין עבור 48 שעות. מדוד משטח לשעברpression של SVGmu עם cytometry הזרימה באמצעות סרום אנטי Sindbis. תאים אלה מיועדים כקו סלולרי GPRS אריזה.
2. לבנות תאי יצרן DC-LV על ידי Transfection מערך Concatemer
Lentiviral ההעברה פלסמיד TL20-GFP הוא inactivating עצמי lentiviral העברת וקטור פלסמיד המבוסס על pCL20c-MSCV-GFP עם מערכת ויסות Dox-RNA נגיפי הגנום ביטוי והחלפה של ציטומגלווירוס (CMV) משפר עם 7 ט מפעילים (איור 1 ג) 11 , 12,15. פלסמיד PGK-ble הוא קלטת (ble) עמידה bleomycin מונעת על ידי אמרגן PGK חלש 2.
- מיקרוגרם TL20-GFP דייג'סט 20 פלסמיד עם הגבלת האנזים SfiI ב 50 ° C. מיקרוגרם PGK-ble דייג'סט 20 פלסמיד עם PflMI על 37 ° C.
- לטהר את שברי ה-DNA (קלטת PGK-ble היא 1011 נ"ב וקטורית TL20-GFP הוא 6861 נ"ב) על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose.
- לקשור את וקטור TL20-GFP וPGK-קלטת ble ביחס טוחנת של 25:1 (אנזים T4 DNA חוד). דגירה הלילה בטמפרטורת חדר.
- לאחר קשירת הלילה, לטהר את ה-DNA מתערובת קשירה (דם Qiagen DNeasy וערכת רקמה). להבטיח את כמות ה-DNA המטוהר הוא בסביבות 5 מיקרוגרם.
- 16-18 שעות לפני transfection, תאי אריזת GPRS צלחת בצלחת תרבית רקמה של 6 ס"מ כך שconfluency יהיה כ -90% בזמן של transfection.
- השתמש בשיטת transfection סידן פוספט המתוארת בשלב 1.2 לtransfect 5 מיקרוגרם של ה-DNA concatemeric מטוהר לתוך תאי אריזת GPRS בצלחת תרבית הרקמה של 6 ס"מ. 4 שעות לאחר transfection, להסיר בזהירות את המדיום ולהחליף עם D10 4 מ"ל מחומם מראש עם דוקסיציקלין (1 ng / ml).
- 48 שעות לאחר transfection, לשנות את המדיום לD10 עם דוקסיציקלין (1 ng / ml) וpuromycin (2 מיקרוגרם / מ"ל). בחר לשיבוטי transfected ידי הוספת Zeocin (50 מיקרוגרם / מ"ל) במדיום לתרבות. תרבות התאים לכ -2 שבועות עד התא coloniניתן לראות es בתחתית את הכלים.
- תווית מושבות התאים בחלק התחתון של הכלים. קח את המנות בתרבית רקמת 24 גם, מספר הבארות ולהוסיף לכל אחד גם 2 מ"ל D10 המכיל Zeocin (50 מיקרוגרם / מ"ל), דוקסיציקלין (1 ננוגרם / מ"ל), וpuromycin (2 מיקרוגרם / מ"ל). לשאוב את המדיום של תאי transduced, ואז להוסיף טיפה אחת של טריפסין על כל אחת מהמושבות לפחות מדקה אחת. לאחר מכן, להוסיף אחד או יותר טיפות של D10 באותן מושבות. תרים מושבות בזה אחר זה עם טפטפת ולהעביר אותם לתוך בארות נפרדות של צלחת תרבית רקמת 24 גם.
- תרבות ולהרחיב את כל השיבוטים תא D10 המכיל בZeocin (50 מיקרוגרם / מ"ל), דוקסיציקלין (1 ng / ml) וpuromycin (2 מיקרוגרם / מ"ל) לצורך ההערכה של יכולת ייצור נגיפית.
3. להעריך הפקת ויראלי של שיבוט כל סלולרי
- Trypsinize תאי המפיק והצלחת סביב 4x10 6 תאים בתרבית רקמת מנה של 6 ס"מ בD10 בלי דוקסיציקלין כזה שconfluencyעולה על 90%. החלף את המדיום עם D10 מחומם מראש טרי מדי יום ולאסוף את המדיום לשעת כייל assay 72 לאחר הסרת DOX.
- לקצור את supernatant הנגיפי על ידי סינון הבינוני עם מסנן 0.45 מיקרומטר.
- תאי יעד פלייט מבטאים את הקולטן DC-Sign (293T.hDC-סימן או מח עצם עכבר נגזר תאים דנדריטים 16 למשל) ו293T כביקורת שלילית בתרבות מנות 96, גם, 1 x 10 4 תאים / היטב. הוסף דילולים סדרתי פי 2 supernatant ויראלי לבארות (100 μl / טוב). בדרך כלל, 6-8 דילולים מספיקים כדי להגיע לטווח שבו transduced GFP חיובי תאים נמצאים במערכת יחסים ליניארי לכמות הנגיף הוסיפה.
- צנטריפוגה תאים ולהחליף את המדיום כמתואר בשלב 1.4. BMDCs צריך להיות תרבותי במדיום RPMI עם FBS 10% ו-GM-CSF (01:20 בינונית מותנה J558L).
- מדוד את הביטוי של GFP בtransduced תאים על ידי זרימת cytometry 4-6 ימים לאחר תמרה. Vecto lentiviralr כייל מחושב בטווח דילול הווקטור כאשר אחוז תאי GFP החיוביים ואת סכום וקטור נמצא במערכת יחסים ליניארי. בחר את התא עם שיבוט הייצור הנגיפי הגבוה ביותר עבור יישומים שלאחר מכן.
4. לייצר ותתרכז וקטורי lentiviral
- תרבות שורת תאי המפיק (LV-MGFP) במנות בתרבית רקמת 15 ס"מ.
- Trypsinize תאי המפיק ופלייט התאים בצלחות תרבית רקמת 15 סנטימטר בגדול יותר מ -90% בconfluency D10 הטרי ללא דוקסיציקלין. שנה בינונית עם D10 טרי, מחומם מראש יומית.
- בזמן ייצור נגיפי שיא (כפי שנקבע על ידי המשתמש), למסוק את supernatant ויראלי ולסנן אותו באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר. טען את supernatant המסונן לתוך צינורות ultracentrifuge 32.5 מ"ל קיר עבה, לאטום עם parafilm צנטריפוגות ב 50,000 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. יסודיות resuspend גלולה ב50 μl או נפח מתאים של PBS או HBSS בהתאם ליישום. </ P>
5. לחסן עכברים in vivo וניתוח תגובה חיסונית אנטיגן ספציפית
- לייצר וירוס כייל גבוה כאמור בסעיף 4.
- הזרק BALB / C (6-8 בשבוע ישן, נקבה) דרך מסלול שודד עם ההשעיה הווקטור (25 μl לשודד דרכים).
- 2 שבועות לאחר חיסון, לבודד טחול וsplenocytes קציר. splenocytes תרבות עם פפטידים epitope GFP ולנתח את נוכחותו של ה-GFP-CD8 + T התאים ספציפי באמצעות מכתים ציטוקינים תאי, כפי שתואר 17 (איור 3) בעבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שורת התאים היציבה שתוארה בשיטה זו ניתן לייצר כמויות גדולות של וקטורי lentiviral המיועדים באופן ספציפי לתאים דנדריטים. כפי שניתן לראות באיור 1, בידוד של שיבוטים בודדים הניב שורות תאי יציבות באיכות משתנה 12. בין 26 שיבוטים שנבדקו, 8 מיוצרים חלקיקי lentiviral בכייל של יותר מ -10 התמר 6 יחידות למ"ל (TU / מ"ל), שהוא אמת מידה אופיינית לוקטורי lentiviral SVG-Pseudotyped המיוצרים על ידי transfection חולף. באותו הזמן, כמה שיבוטים מיוצרים פחות מ 10 TU 4 / מ"ל, חשוב לבודד שיבוטים מרובים על מנת לקבל מפיק חזק.
שיבוט אחד מיוצר וקטורי lentiviral מהימן בכייל של יותר מ 10 TU 7 / מ"ל. בדיקות נוספות על שיבוט זה הראתה כי רמה זו של ייצור הנגיפי הייתה יציבה במשך ימים רבים, לא מושפע מהנוכחות / היעדרות של סרום במדיום התרבות, וchievable בתאים בתרבית במשך יותר מ -3 חודשים (איור 2) 12.
כדי לוודא שוירוסים אלה רק לא היו יעילים במבחנה, הם משמשים גם כדי לחסן את העכברים. ניתוח של התגובה החיסונית GFP הספציפית על ידי צביעת ציטוקינים תאית מצא כי יציבות בייצור DC-LV יכול לעורר את הרחבת CD8 GFP הספציפי + T תאים לכמעט 4% מכל CD8 + Splenocytes (איור 3) 12.
איור 1. דור של תאי מפיק וקטור lentiviral טטרציקלין מוסדרים. () מתווה סכמטי של ההליך להכנת תאי DC במיקוד lentiviral וקטור מפיק, כוללים התמרה של קווי GRP עם המשך וקטור retroviralaining גן מעטפת SVGmu וtransfection של הגן של עניין (וקטור ויראלי) על ידי transfection concatemeric. (ב ') יחיד שיבוטים שנבחרו על ידי טיפול Zeocin הורחבו על 1-2 שבועות, וכייל של supernatant הנגיפי נמדד 3 ימים לאחר ההסרה של דוקסיציקלין. כפי שניתן לראות, titers ויראלי מגוון נרחב על ידי שיבוט. (ג) מפות פלסמיד. וקטור ויראלי פלסמיד, TL20-GFP, מקודד חלבון פלואורסצנטי ירוק תחת השליטה של אמרגן תאי גזע עכברי וירוס והגנום הווקטור תחת השליטה של אמרגן טטרציקלין-repressible. PGK-ble מקודד גן התנגדות Zeocin (SH ble) תחת אמרגן 1 המכונן phosphoglycerate קינאז (PGK). רטרו SVGmu מכיל גליקופרוטאין SVGmu תחת אלמנט ט מגיב חזק P. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. המאפיינים של ייצור וקטור ויראלי. () לאחר הסרת DOX, כייל וקטור ויראלי של supernatants התרבות נמדדו בכל יום למשך 7 ימים. ייצור הווירוס הגיע לשיאו בין 48-72 שעות לאחר אינדוקציה. תאים בתרבית בסרום ללא מדיה מיוצרים כמעט באותה המידה כמו אלה נגיף בתרבית עם FBS 10%. (ב) היו בתרבית תאי יצרן מעל 3 חודשים וaliquots נבדקו מעת לעת לייצור וירוס. אין אובדן משמעותי של ייצור נגיף נצפה.
איור 3. וקטורי lentiviral המיוצרים על ידי שורות תאי DC במיקוד יציבות יכולים סלקטיבי transduce DCs במבחנה ולייצר תגובה חיסונית בגוף חי. <חזק> () תאים דנדריטים שמקורם במח עצם עכבר נדבקו LV-GFP והביטוי של GFP נמדד עם cytometry הזרימה. הביטוי של GFP היה ספציפי לCD11c + תאים, הכוללים תאים דנדריטים. (ב) היו עכברים שחוסנו עם 2 x 10 7 TuS של מטוהרים ומרוכזים LV-GFP. שבועיים לאחר מכן, כמעט 4% מכל CD8 + T תאים הופעלו והביעו IFNγ בתגובה למצגת של הפפטיד הדומיננטי GFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הנה, יש לנו התווינו שיטה להפקת כמויות גדולות של וקטורי lentiviral באמצעות 293T תאים ביציבות transduced עם כל רכיבי lentiviral תחת ט 'את המערכת הרגולטורית. נכון להיום, רוב הפרוטוקולים לייצר וקטורי lentiviral להסתמך על transfection פוספט סידן חולפת הסטנדרטית (ראה 18, לדוגמה). גישה זו הייתה מוצלחת בקנה מידה קליני, אבל זה עלול לסבול מכמה מגבלות לא צפוי להיות נוכח בדרוג את ייצור משורות תאי יציבות. לדוגמה, שיתוף transfection עם כמויות גדולות של פלסמידים LV יכול תיאורטית להגדיל את הסיכוי להתפתחות של השכפול lentivirus המוסמך 19. יתר על כן, transfections חולף נוטים יותר כדי להפיק תוצאות משתנות בקנה מידה גדול יותר מאשר ניצול קו מפיק יציב בשל כמויות הגדולות של DNA הנדרשות תשומות 12. בתנאים המתאימים, היו בשימוש מפיק קווים כאלה כדי ליצור אחרים γ-רטרווקטורים ויראליים בקשקשים גדולים 20,21. עם זאת, מחקרי ניצול קווי מפיק lentiviral מוגבלים, ולכן ההכללה של מבחני חזקים 22 כדי לזהות lentivirus מוסמך השכפול תהיה קריטית בפיתוח קו תא כלשהו לשימוש קליני.
קבוצות אחרות לא פורסמו תיאורים לשורות תאי יציבות lentivirus לייצור 6-11,23. עם זאת, מגבלה משותפת של דיווחים אלה היא כי רבים מהם מסתמכים על transducing התאים מפיקים עם וקטורי lentiviral קידוד הגן של עניין, מה שעשוי להפחית את בטיחותם לשימוש קליני. כאן, אנו מנצלים את שיטת transfection מערך concatemeric 11 לtransduce תאים שיכולים לייצר lentivirus עצמי inactivating. יתר על כן, השימוש במערכת משפר את ט ההתאמה של השיטה לשימוש קליני. מערכת רגולציה זו מונעת מרעילות SVGmu במהלך תחזוקת תרבית תאים ומאפשרת לאוסף של וקטורי lentiviral תחת antibiotללא תנאים IC.
במהלך ההליך, חשוב שעובדי מעבדה להשתמש באמצעי זהירות מתאים בעת טיפול בוקטורי lentiviral. וקטורי lentiviral נגזרים מHIV-1, הפתוגן אנושי, וכל ההליכים צריכים להתבצע תחת הדרכתו של biosafety ועדת מוסד. לדברי ה-NIH, בלימת BL2 היא בדרך כלל מתאימה לעבודה עם מערכות מתקדמות lentiviral כגון זה שתואר כאן, למרות בלימת BL2 משופרת ניתן לציין אם ניסויים הם מדורגים עד לפרקטיקה קלינית 24.
ישנם מספר שלבים קריטיים בהליך שדורשים טיפול מיוחד. ראשית, יש לבצע תרבית תאים עם תשומת לב רבה לפרטים. מצאנו כי titers הווירוס לרדת באופן ניכר, אם תאים אינם מפיק passaged כל 24 שעות. כמו כן, כמה הרבה FBS יכול להוביל לירידה משמעותית בייצור נגיף, ולכן חשוב לבדוק מספר רב של המון הנץ FBSעפרות דרוג את ניסוי. הבחירה של שיבוט שיכול לייצר titers וירוס גבוה היא חיונית עבור יישומים במורד הזרם. בהסכם עם עבודה קודמת 25, מצאנו ששיבוטים המופיעים לחלק במהירות רבה יותר נוטים לייצר יותר וירוס. ברגע ששיבוט גבוה כייל כבר נמצא, צריכים להיות aliquoted תאים אלה וקפוא בFBS + DMSO 10% בהקדם האפשרי. לאחר מכן, באמצעות aliquots טרי מופשר עוזר ליצור כייל הגבוה ביותר האפשרי. על ידי ביצוע כלל אצבע, יש לנו את ההצלחה הרבה ביותר לייצר נגיפים דרך transfections חולף, ואנו מצפים כי תחזוקת קו תא דומה תיהנה תאים לייצור וירוס יציבים.
המגבלה העיקרית של שיטה זו היא שהיא דורשת כמות משמעותית של מאמץ מלפנים כדי ליצור קו מפיק יציב. לכן, זה לא צפוי להיות מתאים במצבים שבם סוגים שונים של וקטורי lentiviral ייבחנו. transfections חולף עשוי להיות נוח יותר עבור thesסוגי דואר של יישומים. בדרך כלל אנחנו צופים בשיטה זו כדי לייצר כמויות גדולות של וקטור ויראלי לאחר הווקטור כבר נוסה בפורמט קטן. מגבלה נוספת של שורת התאים הספציפית שלנו היא שוקטורים המיוצרים על ידי תאי GPRS יהיו ספציפיים לתאים המבטאים DC-סימן היחיד בגלל חלבון המעטפה, SVGmu, נקשר לקולטן זה. כדי למקד קולטני תאי אחרות, ניתן לשנות את ההליך על ידי החדרת פלסמידים גליקופרוטאין אחרים לתוך שורת תאי GPR המקורית. כמו כן, הגנים אחרים של עניין יכולים להיות transfected לתוך שורות תאי המפיק כך שוקטורי lentiviral יכולים לספק חלבונים רלוונטיים יותר מ-GFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות מייקל צ'ו, Bingbing דאי, וליאנג שיאו על תרומת הנתונים לכתב היד הזה. אנחנו גם מכירים ד"ר ג'ון גריי על המתנות הנדיבות של חומרים כימיים המשמשות במחקר זה. PB נתמך על ידי מלגת דוקטורט מהמרכז הלאומי לסרטן. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות (R01AI68978, P01CA132681 וRCA170820A), מענק של ביל ומלינדה גייטס הקרן, מענק האצת translational מהמרכז המשותף לרפואת Translational ומענק מהאיידס / HIV קליפורניה תכנית מחקר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
References
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene therapy with viral vectors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).
- Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).
- Hu, B., Tai, A., Wang, P. Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases. Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).
- Broussau, S., et al. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).
- Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).
- Ikeda, Y., et al. Continuous high-titer HIV-1 vector production. Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).
- Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. A packaging cell line for lentivirus vectors. Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).
- Strang, B. L., et al. Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells. Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).
- Throm, R. E., et al. Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection. Blood. 113, 5104-5110 (2009).
- Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination. Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449, 419-426 (2007).
- Yang, L., et al. Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization. Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).
- Hanawa, H., et al. Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system. Blood. 103, 4062-4069 (2004).
- Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).
- Dai, B., et al. HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).
- Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K.
- Loew, R., et al. A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration. Gene Ther. 17, 272-280 (2010).
- Gaspar, H. B., et al. Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector. Lancet. 364, 2181-2187 (2004).
- Cornetta, K., et al. Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).
- Stewart, H. J., et al. A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson's disease. Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).
- Biosafety Considerations for Research with Lentiviral Vectors [Internet]. , National Institute of Health Recombinant DNA Advisory Committee. Available from: http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidance/LentiVirus_Containment/pdf/Lenti_Containment_Guidance.pdf (2006).
- Coroadinha, A. S., et al. Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).
