Summary
ここでは、レトロウイルス形質導入およびテトラサイクリンの不存在下でレンチウイルスベクター（LV）の成分を発現できる細胞株を作成するためのコンカテマートランスフェクションを使用する。このLVは、GFPをコードし、樹状細胞上の受容体に特異的な糖タンパク質、SVGmuと偽されています。
Abstract
レンチウイルスベクター（論理ボリューム）は、多くの種類の細胞への遺伝物質を送達する強力な手段である。 LVが大量に生成し、これらのHIV-1由来のベクターに関連する安全上の懸念のためには、困難である。本稿では、自己不活性化のLVの高い力価を製造する方法を報告している。私たちは、レトロウイルス樹状細胞特異的糖タンパク質、SVGmu含むすべてのウイルス成分を、表現できる細胞株、GPRSを生成するために安定したプロデューサー細胞株GPR TET-OFF形質。その後、我々はLV転送をコードするプラスミドの選択マーカーと組み合わせてレポーター遺伝子GFPをトランスフェクトするコンカテマーDNAトランスフェクションを使用します。得られたクローンのいくつかは、我々は一過性のトランスフェクションでは達成ものより10倍高い力価でLVを生成することができます。さらに、これらのウイルスは、in vitroで効率的樹状細胞を形質導入し、我々のレポーター抗原に対する強力なT細胞免疫応答を生成する。この方法では、良いオプションのFOかもしれないrは、がんや感染症の臨床研究のための強力なLVに基づくワクチンを生産する。
Introduction
多くのベクター系は、遺伝子送達のために開発されている。レンチウイルスに基づくベクターは、最も一般的に研究ウイルスシステムの間でされています。それらは効率的に分割し、非分裂細胞1の両方を形質導入宿主ゲノムへの組込みに起因する長期発現を達成するため、2ほとんどのヒト集団における低天然の抗ベクトル耐性を示し、かつに対して低電位を有することができるので、これらのベクターは、有利で ある挿入突然変異3,4から遺伝毒性。
レンチウイルスの産生は、常に安全性の懸念に彩られています。レンチウイルスベクターは、一般に、HIV-1、AIDSの病原体から誘導される。 lentivectorの個々の成分（転写、エンベロープ、およびパッケージングプラスミド）の一過性トランスフェクション実験室の設定で遺伝物質を送達する一般的で柔軟な手段である。しかし、臨床応用のためのスケールアップ一過性トランスフェクションは、面倒でmAですyは複製能レンチウイルス5,6の開発につながる。これらのハードルを克服するために、いくつかの安定したパッケージングおよびプロデューサー細胞株は6-11開発されている。これらのいずれかの行、GPR包装ライン11は 、テトラサイクリンにより調節される魅力的な利点を有する。本稿では、特に樹状細胞（DC-のLV）12に向けて対象としている自己不活性化レンチウイルスベクターを製造するためにこのシステムを適応させる方法を示しています。
樹状細胞（DC）は、免疫システムの中で最も堅牢な抗原提示細胞である。それらは、直接、プログラムを開始し、腫瘍特異的免疫応答を調節する13ため、それらは、癌ワクチン開発に大きな関心の対象となっている。 DCは、ペプチド又はDNAワクチンよりも強い抗腫瘍免疫応答を誘発する可能性を秘めている含むようにワクチン接種プロトコルを組み込む。最近、我々はレンチウイルスベクターを開発したことspecificallyは修正されたシンドビスウイルス糖タンパク質、SVGmu 14を通じて樹状細胞をターゲットとしています。これらのベクターは、それらが樹状細胞に高い特異性を示し、非特異的、VSVG偽型ベクターより強い免疫応答を生成するという点でユニークです。
ここでは、これらのDC-標的化レンチウイルスベクターを大量に製造する方法を報告している。我々は、これらのDC-DCを論理ボリュームが感染し、強力なCD8 + T細胞免疫応答を生成することができることを実証している。動物に関わるすべての手順は、USC Intitutional動物のケアと使用委員会の承認の下に、人道的に行われた。 インビボおよび臨床実験で行うためには、高力価でウイルスを生産する細胞株を作成することが重要である。ここで説明しているとおりに伝達し、トランスフェクションの手順を実行すると、このようなクローンを生成する可能性を最大化します。
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Protocol
DC-LV安定産生細胞は、必要にレンチウイルスコンポーネントgagpol、REVおよびTETオフシステムを含むGPRパッケージングセルライン11に基づいて構築されています。まず、レトロウイルス形質導入は、テトラ依存SVGmu糖タンパク質をコードするGPRSパッケージング細胞株を生成するために使用される。その後、コンカテマーアレイトランスフェクションは、GFPのようなレンチウイルスベクターでトランスジーンGPRS細胞系をトランスフェクトするために使用される。 LV-MGFPとして指定され、この安定した産生細胞系は、GFPに対するDC-LVワクチンを産生する能力についてin vitroおよびin vivoで試験することができる。
1。テト依存SVGmu細胞株を生成する
プラスミドPRX-SVGmuは、DC特有の糖タンパク質SVGmuがレトロウイルスプラスミドpRetroX-テトオフ1（ 図1C）のTTA-高度なプロモーターの下流にクローニングされている構造です。 D10での培養293T細胞（ダルベッコ改変イーグル培地で10％ウシ胎児血清、2mMのL-グルタミン）。ドキシサイクリン（1 ngの/ ml）およびピューロマイシン（2μgの/ mL）でD10で文化GPRのパッケージング細胞株。すべての細胞は5％CO 2で加湿37℃のインキュベーターで培養する。
- 16-18時間前に一過性トランスフェクション、プレート2×10細胞は、トランスフェクション時に90％の密集度に近づくように、6 cmの組織培養皿でD10 4mlの6 293T細胞。
- レトロウイルスプラスミドのトランスフェクション ：ミックス100μlの1.25 MのCaCl 2溶液、滅菌ミリQ水と以下のプラスミド：5μgのPRX-SVGmu、2.5μgのPGAGポル、2.5μgのpVSV-G。最終容量は500μLです。 5ミリリットルポリスチレン丸底チューブに、500μlの2X HBSを液（50mM HEPES、10mMのKClを、12 mMのブドウ糖、280のNaCl、1.5mMののNa 2 HPO 4·7H 2 O、pHは7.05）を追加します。ガラスパスツールピペットを用いて精力的にバッファをバブリングしながら、2X HBSバッファーにプラスミド混合物を滴下を追加します。マイルを追加した後xtureは、別の30秒間バブリング続ける。その後、6 cmの培養皿で293T細胞上に混合物全体を追加し、37℃でインキュベート℃、
- 4時間トランスフェクション後、慎重に4ミリリットル予熱したD10と培養皿に培地を交換してください。
- 感染スピン ：トランスフェクション後48時間を、収穫SVGmuエンコード0.45μmのフィルターを通して上澄みを渡すことによって、上清中のレトロウイルス粒子を。 2×10 4細胞/ウェルで24ウェル皿にプレートGPRパッケージング細胞を。 1,050×gで90分間、25℃で皿にGPRのパッケージング細胞（2ミリリットル/ウェル）、遠心上清を細胞にフィルタ追加（2ミリリットル/ウェル）スピン感染後ドキシサイクリン（1 ngの/ ml）で新鮮なD10に培地を変更します。
- 72時間後、トランスフェクションは、ドキシサイクリン（1 ngの/ ml）およびピューロ（2 ngの/ ml）でD10で形質導入パッケージング細胞の培養を展開します。
- 48時間ドキシサイクリンずにSVGmu、文化細胞の発現を確認する。測定表面EX抗シンドビス血清を用いたフローサイトメトリーとSVGmuの下り坂。これらの細胞は、GPRSのパッケージング細胞株として指定されている。
2。コンカテマーアレイトランスフェクションによってDC-LVの産生細胞を構築
レンチウイルストランスファープラスミドTL20-GFPは自己不活性化レンチウイルストランスファーベクタープラスミドのDox-調節ウイルスRNAゲノム発現系と7 TET子（ 図1C）11とサイトメガロウイルス（CMV）エンハンサーの交換にpCL20c-MSCV-GFPに基づく、12,15。プラスミドPGK-BLEは弱いPGKプロモーター2によって駆動ブレオマイシン耐性（BLE）カセットです。
- 50で制限酵素SfiIでとダイジェスト20μgのプラスミドTL20-GFP℃まで37℃PflMIとダイジェスト20μgのプラスミドPGK-BLE℃まで
- アガロースゲル電気泳動によりDNA断片（PGK-BLEカセットが1011 bpであるとベクトルTL20-GFPは6861 bpである）浄化。
- TL20-GFPベクターおよびPGK-を連結25:1のモル比（NEB T4 DNAリガーゼ）におけるBLEカセット。室温で一晩インキュベートする。
- 一晩ライゲーション後、ライゲーション混合物（キアゲンDNeasy血液および組織キット）からDNAを精製する。精製されたDNAの量を確保するには、5μgの程度である。
- トランスフェクションの前に16〜18時間、密集度は、トランスフェクションの時点で約90％となるように6 cmの組織培養皿にプレートGPRSパッケージング細胞。
- 6 cmの組織培養皿の中のGPRSパッケージング細胞に精製コンカテマーDNA5μgのをトランスフェクトするために、ステップ1.2で説明したリン酸カルシウムトランスフェクション法を使用します。 4時間トランスフェクション後、慎重に培地を除去し、ドキシサイクリン（1 ngの/ mL）で4ミリリットル予熱されたD10と交換してください。
- トランスフェクション後48時間では、ドキシサイクリン（1 ngの/ ml）およびピューロマイシン（2μgの/ ml）をD10にメディアを変更してください。培養培地中でゼオシン（50μgの/ ml）を添加することによりトランスフェクトされたクローンを選択する。セルコローニまで約2週間培養細胞エスは、皿の底部に見ることができる。
- 皿の下部にある細胞コロニーにラベルを付けます。 、24ウェル組織培養皿を取る数井戸やmlのD10はゼオシン（50μgの/ ml）を、ドキシサイクリン（1 ngの/ ml）を、およびピューロマイシン（2μgの/ ml）を含む各ウェル2に追加。形質細胞の培地を吸引し、1分未満のためにコロニーのそれぞれにトリプシンの一滴を追加します。その後、同じコロニーにD10の一つ以上の滴を追加します。ピペットでつずつのコロニーつをピックアップし、24ウェル組織培養プレートの別々のウェルに移す。
- 文化やウイルスの産生能の評価のためにゼオシン（50μgの/ ml）を、ドキシサイクリン（1 ngの/ ml）およびピューロマイシン（2μgの/ ml）を含むD10内のすべての細胞クローンを展開します。
3。各細胞クローンのウイルス産生を評価
- コンフルエントそのようドキシサイクリンずにD10で6 cmの組織培養皿で産生細胞とプレートの周りに4×10 6個の細胞をトリプシン処理90％を超える。毎日新鮮な予備加熱D10で培地を交換し、DOXを削除した後に力価アッセイ72時間のための培地を収集します。
- 0.45μmのフィルターを用いて培地をフィルタリングすることで、ウイルス上清を収穫。
- プレート標的細胞は×10 4細胞/ウェル1、96ウェル培養皿に陰性対照としてDC-SIGN受容体（ 例えば、派生293T.hDC-SIGNまたはマウス骨髄樹状細胞16）および293Tを発現する。ウェルにウイルス上清（100μL/ウェル）の2倍連続希釈を追加します。通常、希釈液6-8は、GFP陽性細胞を添加したウイルスの量に線形の関係にある形質導入された範囲に到達するのに十分である。
- 細胞を遠心分離し、ステップ1.4で説明したように培地を交換してください。たBMDCを、10％FBSおよびGM-CSF（1時20 J558L馴化培地）を含むRPMI培地で培養されるべきである。
- フローサイトメトリー4-6日後に形質導入により形質導入細胞におけるGFPの発現を測定します。レンチウイルスvectoGFP陽性細胞とベクトル量の割合は線形関係にあるときにrの力価は、ベクターの希釈範囲で算出される。その後のアプリケーションのための最高のウイルス産生と細胞クローンを選択してください。
4。レンチウイルスベクターを生産し、集中
- 15cmの組織培養皿で培養プロデューサー細胞株（LV-MGFP参照）。
- ドキシサイクリンなし新鮮D10において密集度90％以上で15cmの組織培養皿に産生細胞とプレート細胞をトリプシン処理。毎日新鮮な、予備加熱D10と培地を変更します。
- ピークウイルス産生（ユーザによって決定される）の時点で、ウイルス上清を採取し、0.45μmのフィルターを使用して、それをフィルタリングします。 90分間50,000 xgでパラフィルムと遠心、4℃で密閉し、厚い壁32.5ミリリットルの遠心チューブにフィルター上清をロードします。徹底的に50μlのか、アプリケーションに応じて、PBSまたはHBSSの適切な音量でペレットを再懸濁します。</李>
5。 インビボでマウスを免疫化し、抗原特異的免疫応答の分析
- セクション4で説明されているように高力価のウイルスを生成します。
- ベクター懸濁液（蹠あたり25μL）と蹠経路を介してBALB / cマウス（メス、古い6-8週）を注入する。
- 2週間の免疫後、脾臓や収穫脾細胞を分離する。 GFPエピトープペプチドで培養脾細胞とGFP特異的CD8 +の存在下予め17（ 図3B）に記載のように、細胞内サイトカイン染色法を用いてT細胞を分析する。
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Representative Results
この方法で説明した安定な細胞系は、特に樹状細胞を標的とするレンチウイルスベクターを大量に製造することができる。 図1Bに示すように、個々のクローンの単離質12が変化する安定な細胞株を得た。テストした26クローンのうち、8は、一過性トランスフェクションによって生成されたSVG偽型レンチウイルスベクターのための典型的なベンチマークであるミリリットル（TU / ml）を、当たり以上10 6形質導入単位の力価でレンチウイルス粒子を産生した。同時に、いくつかのクローンが10未満4 TU / mlに製造、それは強力なプロデューサを得るために、複数のクローンを単離することが重要である。
一つのクローンは、確実に10 7 TU / mlを超える力価で、レンチウイルスベクターを産生した。このクローンのさらなる検査はウイルス産生のこのレベルは、培地中の血清の存在/不在の影響を受け、複数の日のための安定した、とあったことを実証3ヶ月以上（ 図2）12のために培養した細胞でchievable。
これらのウイルスは、in vitroにおいてのみ有効ではなかったことを確認するために、彼らはまた、マウスを免疫するために使用された。細胞内サイトカイン染色によるGFP特異的免疫応答の分析は安定して生産されたDC-LVは、すべてのCD8 +の脾細胞の約4％（ 図3）12にGFP特異的CD8の拡大+ T細胞を刺激することがわかった。
図1。テトラサイクリン調節レンチウイルスベクター産生細胞の生成。（）レトロウイルスベクターCONTとGRPラインの伝達を含めDC標的化レンチウイルスベクター産生細胞を作るための手順の概略外形コンカテマートランスフェクションにより、目的の遺伝子（ウイルスベクター）のSVGmuエンベロープ遺伝子のトランスフェクションをaining。（B）ゼオシン処理により選択された単一クローン1-2週間にわたって展開され、ウイルス上清の力価は、3日の除去後に測定した。ドキシサイクリンの。としてクローンによって大きく変動ウイルス力価、示す。（C）プラスミドマップ。プラスミド、ウイルスベクター、TL20-GFPは、マウス幹細胞ウイルスプロモーターおよびテトラサイクリン抑制性プロモーターの制御下にベクターゲノムの制御下で緑色蛍光タンパク質をコードする。 PGK-BLEは、構成ホスホグリセリン酸キナーゼ1プロモーター（PGK）の下ゼオシン耐性遺伝子（SH BLE）をコードする。レトロSVGmuは、P タイト TET応答要素下SVGmu糖タンパク質が含まれています。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。ウイルスベクターの生産の特徴は、（A）DOXの除去後、培養上清のウイルスベクターの力価を7日間毎日測定した。 72時間後に誘導 - ウイルス産生は、48との間にピークに達した。無血清培地で培養した細胞を10％FBSで培養したものとほぼ同じくらいのウイルスを生産した。（B）プロデューサー細胞は3ヶ月にわたって培養し、アリコートを、ウイルス生産のために定期的に試験した。ウイルス産生の有意な損失は観察されなかった。
図3。安定したDC-標的細胞系によって産生さレンチウイルスベクターは、in vitroで選択的樹状細胞を形質導入し、in vivoで免疫応答を生成することができる。<強い>（A）のマウスの骨髄由来樹状細胞は、LV-GFPおよびGFPの発現は、フローサイトメトリーで測定した感染させた。 GFPの発現は、樹状細胞を含むたCD11c +細胞に特異的であった。（B）マウスを精製し、濃縮LV-GFPの2×10 7個のTUで免疫した。二週間後、全てのCD8 + T細胞の約4％がGFP支配的なペプチドの提示に応答してIFNγを活性化し、発現させた。
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Discussion
ここでは、安定して規制システムオフテトラ下にあるすべてのコンポーネントレンチウイルスで形質導入された293T細胞を用いたレンチウイルスベクターを大量に製造する方法を概説している。現在までに、レンチウイルスベクターを製造するためのほとんどのプロトコル（たとえば、18を参照）は、標準リン酸カルシウム一過性トランスフェクションに依存している。このアプローチは、臨床的規模で成功しているが、それは安定した細胞株から製造スケールアップ中に存在する可能性はなく、いくつかの制限を受けることができる。例えば、LVプラスミドの大量との共トランスフェクションは、理論的に複製コンピテントレンチ19の開発のための可能性を高めることができる。また、一過性トランスフェクション12が必要DNA入力の大量による安定した生産ラインを利用したより大規模に変数結果を生成する可能性が高い。適切な条件の下で、このような生産ラインは、他のγ-レトロを生成するために使用されている大スケールでウイルスベクター20,21。しかし、レンチウイルス生産ラインを利用した研究は限られているので、複製コンピテントレンチウイルスを検出するための堅牢なアッセイの包含22は、臨床使用のためのあらゆる細胞株を開発する上で重要であろう。
他のグループはレンチウイルス産生安定細胞株6-11,23の説明を公開しています。しかし、これらのレポートの一般的な制限は、それらの多くは臨床使用のために、その安全性を減らすことができ、目的の遺伝子をコードするレンチウイルスベクターでプロデューサー細胞を形質導入に頼っている。ここでは、自己不活性化レンチウイルスを生産する細胞を形質導入するためのコンカテマーアレイトランスフェクション法11を利用する。さらに、TETオフシステムの私たちの使用が臨床使用に方法の適合性を向上させます。この規制システムは、細胞培養メンテナンス中SVGmuから毒性を防止し、antibiotでレンチウイルスベクターの収集を可能にするICフリー条件。
手順の中で、それは、レンチウイルスベクターを取り扱うときは研究室の労働者は、適切な予防策を使用することが重要です。レンチウイルスベクターは、HIV-1、ヒト病原体に由来しており、すべての手順は、機関バイオセーフティ委員会の指導の下で行われるべきである。 NIH、BL2の封じ込めによると、一般的にこのような実験は、臨床実践のために24にスケールアップされている場合、強化されたBL2の封じ込めが示されているかもしれないが、ここで説明したものなどの高度なレンチウイルスシステムでの作業に適しています。
特別なケアを必要とする手順にはいくつかの重要なステップがあります。まず、細胞培養は、細部に大きな注意を払って行う必要があります。我々は、プロデューサー細胞を24時間毎に継代されていない場合、ウイルス力価が著しく低下することを見出した。同様に、FBSのいくつかの多くは、ウイルスの生産の大幅な減少につながることができますので、FBS BEFの複数の多くをテストすることが重要である鉱石実験をスケールアップ。高いウイルス力価を作り出すことができるクローンの選択は、下流のアプリケーションのために不可欠です。前作25と一致して、我々はより急速に分裂するように見えるクローンがよりウイルスを生成する傾向があることを見出した。一度高力価のクローンが見出された、これらの細胞を等分しFBS中で凍結+、10％DMSO、できるだけ早くする必要がある。その後、新たに解凍したアリコートを使用することは可能な最高の力価を生成するのに役立ちます。親指のこのルールに従うことで、私たちは、一過性トランスフェクションを通してウイルスを生産する最も成功を収めている、と我々は同じような細胞株の維持、安定したウイルス産生細胞の利益になることを期待しています。
この方法の主な制限は、安定した生産ラインを生成するようにフロント多大な労力を必要とすることである。これにより、レンチウイルスベクター、複数のタイプがテストされる状況で適切である可能性はない。一過性トランスフェクションは、テサロニケのためのより便利かもしれないアプリケーションのEタイプ。我々は一般的にベクトルが既に小さいフォーマットで試験された後、ウイルスベクターを大量に生成するためにこの方法を使用して予測する。私たちの特定の細胞株の別の制限は、エンベロープタンパク質、SVGmuは、この受容体に結合するので、GPRS細胞により産生さベクトルのみDC-SIGNを発現する細胞に特異的であることである。他の細胞受容体を標的とする、手順は元のGPR細胞株に他の糖タンパク質のプラスミドを導入することによって改変することができる。同様に、関心のある他の遺伝子がレンチウイルスベクターは、GFPよりも関連するタンパク質を送達することができるようにプロデューサー細胞株にトランスフェクトすることができる。
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Acknowledgments
著者は、この原稿のデータを貢献するためのマイケル·チョウ、ビンビン大、そして梁暁を確認したいと思います。また、本研究で使用した試薬の寛大な贈り物のためにドクタージョングレイを認める。 PBは、国立がんセンターからポスドクでサポートされています。この研究は、国立衛生研究所（R01AI68978、P01CA132681とRCA170820A）、ビル＆メリンダ·ゲイツ財団、トランスレーショナル医学とカリフォルニアHIV / AIDSからの助成金のための共同センターから並進加速助成金からの助成金からの補助金によって支えられて研究プログラム。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
References
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