Summary
In questo articolo descriviamo la procedura sperimentale piena di ricostruire, con alta risoluzione, l'anatomia del cervello multa di cervello di topo fluorescente. Il protocollo descritto prevede la preparazione del campione e di compensazione, il campione di montaggio per l'imaging, i dati post-processing e la visualizzazione multi-scala.
Abstract
Capire l'architettura del cervello dei mammiferi a risoluzione singola cellula è uno dei temi chiave delle neuroscienze. Tuttavia, la mappatura soma neuronale e proiezioni in tutto il cervello è ancora difficile per le tecnologie di imaging e gestione dei dati. Infatti, i volumi macroscopici devono essere ricostruito con alta risoluzione e contrasto in un tempo ragionevole, producendo set di dati della gamma TeraByte. Abbiamo recentemente dimostrato un metodo ottico (microscopio confocale foglio leggero, CLSM) in grado di ottenere la ricostruzione micron scala di interi cervelli di topo marcate con la proteina fluorescente verde (EGFP). La combinazione di illuminazione foglio leggero e rilevazione confocale, CLSM permette l'imaging in profondità esemplari eliminato macroscopiche con elevato contrasto e velocità. Qui si descrive il gasdotto sperimentale completa per ottenere immagini complete e leggibili di interi cervelli di topo marcate con proteine fluorescenti. La compensazione e il p di montaggioROCEDURE sono descritte, insieme con la procedura per eseguire una tomografia ottica su tutto il suo volume acquisendo molti stack paralleli adiacenti. Abbiamo mostrato l'utilizzo di open-source strumenti software personalizzati che consentono cuciture dei più stack e la navigazione dei dati multi-risoluzione. Infine, abbiamo illustrato alcuni esempi di mappe cerebrali: il cervelletto di un topo transgenico L7-GFP, in cui tutte le cellule di Purkinje sono selettivamente etichettati, e tutto il cervello di un topo Thy1-GFP-M, caratterizzato da un casuale etichettatura neuronale sparse.
Introduction
Rispetto alla nostra comprensione della funzione del cervello sottostante meccanismi molecolari e cellulari, la nostra conoscenza della neuroanatomia ammenda appare ancora nella sua infanzia 1. In realtà, ci manca ancora mappe complete della posizione di somata neuronale o di proiezioni a lungo raggio in tutto il cervello. In realtà, molti sforzi tecnologici sono dedicati a ricostruire il cervello di topo con una risoluzione microscopica. Metodi ottici basati sulla sezionamento seriale di campioni di resina-embedded, come la scansione Knife-Edge Microscopy (KESM) 2, Micro-Ottica Sezioni Tomografia (MOST) 3 e fluorescenza-MOST (fMOST) 4, in grado di fornire sub-micron di risoluzione tridimensionale immagini di interi cervelli del mouse. Tuttavia, il tempo totale necessario per la preparazione e l'imaging di un singolo campione è dell'ordine di diverse settimane, limitando l'applicazione pratica di tali metodi. Un'altra tecnica basata sulla sezionamento seriale (ma senza resina incasso), Serial Two-Fotone tomografia (STP) 5, permette alta risoluzione imaging tridimensionale. Tuttavia, questa tecnica è stata dimostrata in tutto il cervello di topo solo con un campionamento molto scarsa, la raccolta di 1 punto ogni 50 micron 5, e la nostra conoscenza STP non hanno ancora prodotto una ricostruzione completa campionamento di un cervello murino.
Un metodo ottico all'avanguardia per ricostruire esemplari interi in tre dimensioni ad alta velocità è luce microscopia foglio 6. In questo schema ottico il campione viene illuminato con un sottile foglio di luce e l'emissione di fluorescenza viene raccolto lungo un asse perpendicolare al piano di illuminazione. In questo modo solo i fluorofori a fuoco sono eccitati ed è possibile raggiungere sezionamento ottico in configurazione a grande campo, garantendo elevati frame rate. Quando accoppiato alla compensazione protocolli basati sulla sostituzione di acqua con un indice di rifrazione corrispondente liquido 7, microscopia foglio leggero è stato applicato aI campioni macroscopici, come interi del mouse cervelli 8. Tuttavia, campione indotta dispersione della luce che colpisce esemplari anche eliminato, degrada il foglio leggero porta alla eccitazione di out-of-focus fluorofori che aggiunge una generale sfocatura alle immagini acquisite.
Per raccogliere in modo selettivo solo i fotoni in-focus, abbiamo recentemente accoppiati luce di illuminazione foglio ad una schema di rilevamento confocale 9. In confocale microscopia ottica foglio (CLSM), out-of-focus e fotoni dispersi sono respinti da un filtro spaziale lineare (fessura) prima rilevazione (Figura 1). Per ottenere un funzionamento confocale in architettura foglio leggero, l'illuminazione è prodotta per mezzo di una linea di scansione, e un sistema di de-scansione nel percorso di rilevamento crea un'immagine statica della linea di scansione di eccitazione nella posizione della fessura. Un terzo sistema di scansione ricostruisce una immagine bidimensionale sul sensore fotocamera. CLSM offre un miglioramento del contrasto al 100% nel topo eliminatocervelli rispetto alla microscopia convenzionale foglio leggero, pur mantenendo una frequenza 10 Hz telaio. Con CLSM è possibile ricostruire interi cervelli di topi con risoluzione di 2 micron di XY e 9 micron di Z, e con un contrasto sufficiente per discernere neuroni singolo fluorescente.
In questo articolo descriviamo il gasdotto sperimentale per ricostruire un cervello di topo con CLSM. Mouse cervello aldeide-fisso sono disidratati in una serie graduata di tetraidrofurano senza perossido e successivamente abilitati senza perossido dibenzil etere (Figura 2), seguendo il protocollo sviluppato da Becker et al. 10 Il campione viene poi accuratamente eliminato montato su un capovolto piatto e posizionato nella camera di imaging di un microscopio confocale foglio leggero su misura. Il campione può essere montato direttamente immergendolo su una punta della piastra (figura 3a), in alternativa può essere incollato su un disco di gel di agarosio eliminato (Figura3b) o posto nella cavità di un becher in gel di agarosio eliminato (figura 3c). Viene quindi eseguita una tomografia ottica dell'intero cervello, come molti stack paralleli adiacenti sono acquisiti a coprire tutto il volume del cervello (Figura 4). Un campione pre-tomografia, che produce una mappa approssimativa del posto del campione e la forma, garantisce che l'imaging viene eseguita solo nel volume occupato dal campione. Gli stack di tomografia vengono successivamente cuciti insieme con un software su misura e salvati in un multi-risoluzione schema gerarchico 11. Cervelli del mouse possono eventualmente essere esplorate con prototipale software multi-risoluzione di visualizzazione di Google Maps-like. Entrambi questi strumenti software sono integrati come plugin nella piattaforma open-source Vaa3D 12.
Mostriamo infine immagini rappresentative di cervello di topo per dimostrare le capacità del gasdotto sperimentale descritto nello studio di multa neuroanatom murinoy.
Protocol
1. Tissue Preparazione e conservazione
- Fix cervello di topo mediante perfusione transcardial serie 13 con 20 ml di 0,01 M tampone fosfato isotonico (PBS), seguita da 100 ml di paraformaldeide 4% in PBS 0,01 M. Regolare accuratamente il pH di entrambe le soluzioni a 7.6: valori leggermente inferiori del pH possono estinguere la fluorescenza EGFP.
- Post-fissare i cervelli asportati durante la notte in paraformaldeide 4% a 4 ° C.
- Risciacquare due volte (30 min ciascuna) in 0,01 M PBS e conservare in 0.01 M PBS a 4 ° C.
2. Disidratazione e Clearing
Nota: il protocollo per la disidratazione e compensazione ricalca quella descritta da Becker et al 10.
- Per rimuovere perossidi dal solvente disidratazione (tetraidrofurano, THF), che quench fortemente XFP fluorescenza, filtro THF con ossido basico di alluminio attivato (grado di attività I Brockman, circa 250 g / L di THF) utilizzando un chromaTOGRAPHY colonna. Evitare la rottura della colonna, che ridurrebbe rimozione perossido.
- Aggiungere stabilizzatore (butilidrossitoluolo, 250 mg / L) alla soluzione finale, anche se il THF è stato già stabilizzato prima della filtrazione. Stabilizzatore è infatti trattenuto da ossido di alluminio: THF senza stabilizzatore può sviluppare grandi quantità di perossidi e può essere esplosivo e pericoloso.
- Disidratare l'intero cervello di topo in una serie graduata di THF in acqua pura: 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 1 ora ciascuno, poi 100% di notte. Posizionare il flaconcino con il campione su una ruota girevole. Per evitare l'esposizione alla luce, avvolgere le fiale con un foglio di alluminio.
- Filtrare il solvente di compensazione (dibenzil etere, DBE) con ossido di alluminio (attivato di base, grado di attività Brockman I, circa 250 g / L di DBE) usando un imbuto filtrante.
- Cancellare il campione in 100% DBE. Cambiare la soluzione dopo 3 e 6 ore.
3. Specimen di montaggio
- Quando il cervello sembra trasparente dell'occhio (tipicacamente 1 ora dopo la seconda modifica DBE), montato a fosfori capovolto da uno dei seguenti metodi:
- Montaggio diretto - immergersi delicatamente il campione su una delle punte (Figura 3a).
- Disco agarosio - Immergere un disco fatto di 6% gel di agarosio sulle punte. Fissare delicatamente il campione sul disco agarosio con colla acrilica (Figura 3b). Attendere circa 1 min per la cura.
- Bicchiere agarosio - Immergere un bicchiere fatto di 3% gel di agarosio sulle punte. Posizionare delicatamente il campione sul fondo del bicchiere (figura 3c).
Nota 1: montaggio in coppa agarosio dovrebbe essere preferito quando è importante l'imaging del campione nel suo complesso, tuttavia, il gel di agarosio che circonda il campione dà luogo alla dispersione della luce supplementare che potrebbe essere dannosa per la qualità dell'immagine. Se una piccola parte del campione potrebbe essere escluso dalle immagini, è preferibile montare la specImen sul disco agarosio o direttamente sulla punta. Il primo metodo è più adatto per mantenere il cervello orizzontale (escluso Dall'imaging una porzione ventrale o dorsale del cervello), quest'ultimo per mantenere il cervello verticale (escludendo Dall'imaging una parte di bulbi olfattivi o del midollo spinale).
Nota 2: il gel di agarosio deve essere preparata in acqua, poi disidratato con THF (50% e 100% 4 ore ciascuno) e controllata in DBE 100% per 4 ore o fino a quando appare chiaramente trasparente.
- Dopo il montaggio del campione seguendo uno dei metodi precedenti, posizionare la piastra di imaging nella camera campione usando pinzette. Riempire la camera di compensazione soluzione.
4. Tomografia Preparazione
- Rimuovere la fessura di raccogliere più fluorescenza possibile.
- Illuminare il campione con potenza del laser basso per evitare photobleaching.
- Spostare il campione in tre direzioni utilizzando il microposiziona syste software-drivenm. Identificare per ciascuna direzione minimi e massimi coordinate per cui il campione è illuminato ed è all'interno del campo visivo della telecamera (figura 4a).
- Inserire le coordinate di cui sopra come parametri per la subroutine 'Pre-tomografia'. Specificare anche la distanza tra le pile adiacenti da utilizzare nella tomografia, e il passo di campionamento pre-tomografia in direzione z.
- Avviare il pre-tomografia, che raccoglie le immagini di ogni pila con il campionamento z specificato (4.4).
Nota: Le immagini raccolte sono utilizzati da un programma per preparare una mappa approssimativa di forma e posizione del campione (figura 4b), che permette di restringere acquisizione tomografia solo al volume effettivamente occupato dal campione, riducendo il tempo di imaging e photobleaching così.
5. Tomografia Acquisition
- Spostare il campione di fuori del foglio leggero utilizzando il sistema microposiziona.
- Incpotenza del laser rease e fermare il movimento di tutti i sistemi di scansione, in modo da illuminare solo una linea fissa al centro del campo visivo.
- Montare la fessura e allinearlo con segnale di autofluorescenza dalla soluzione di compensazione. Si dovrebbe vedere chiaramente la linea fessura al centro del campo visivo.
- Riattivare il sistema di scansione, riducendo la potenza del laser e spostare il campione all'interno del foglio leggero utilizzando il sistema microposiziona. Si noti che la potenza del laser utilizzato con la fessura sarà superiore a quello utilizzato senza di essa, poiché i blocchi filtro spaziale una frazione non trascurabile della luce.
- Regolare l'ampiezza e l'offset dei sistemi di scansione e di de-scansione con il software di controllo, fino a quando le immagini sembrano chiare e luminose.
- Eseguire il software di acquisizione tomografia, dopo aver impostato il passo z appropriato per l'esperimento. Il volume sarà ripreso in molti parallelo, parzialmente pile sovrapposte (Figura 5a), e le immagini verranno salvate inuna struttura di cartelle gerarchiche.
6. Cuciture e visualizzazione
- Completa il volume acquisito con le immagini in bianco sintetici (cioè immagini dello stesso tipo e le dimensioni dei raccolti quelli-, ma con intensità pari a zero) utilizzando un software automatizzato (Figura 4c). Questo passo è obbligatorio in modo che il software cuciture per affrontare un volume cubico completo.
- Avviare il software Vaa3D (scaricabile gratuitamente da http://www.vaa3d.org/ ) con i plugin TeraStitcher e TeraManager installati.
- Caricare il plugin TeraStitcher. Selezionare la directory che contiene il volume illustrato, indicare i relativi orientamenti degli assi (rispetto ad un riferimento di mano destra sistema di coordinate) e le dimensioni voxel.
- Avviare la prima parte della cucitura. Il software calcolerà lo spostamento relativo tra le coppie di pile e trovare una collocam ottimale globaleent per tutte le pile insieme (Figura 5b).
- Selezionare per salvare il volume cucita in single-risoluzione o in formato multi-risoluzione. Quest'ultimo consente per la visualizzazione multi-risoluzione con il plugin TeraManager. In entrambi i casi, se l'immagine è più grande risoluzione maggiore di qualche gigabyte, seleziona anche multi-stack Language modalità e specificare la dimensione dei singoli substacks. Ciò consentirà un accesso efficiente ai dati memorizzati.
- Lanciare la seconda parte della cucitura. Il software unire le pile allineate, e salvarli in modalità-stack multi-singola o (Figure 5c e 5d). Alla fine chiudere il plugin TeraStitcher.
- Caricare il plugin TeraManager. Selezionare la cartella con il volume multi-risoluzione multi-stacked, e indicano le dimensioni voxel e assi orientamenti. Il volume viene caricato ad una risoluzione minima.
- Per eseguire lo zoom di una risoluzione più alta, selezionare un punto di riferimento con il pulsante destro del mouse modality di Vaa3D, poi zoomare usando mouse. In alternativa è possibile selezionare direttamente il ROI per zoomare con il tasto destro del mouse, o specificare le coordinate del volume di interesse.
- Per ripristinare risoluzione più bassa, è sufficiente utilizzare lo scroll del mouse.
Representative Results
Il protocollo descritto può essere utilizzato per ricostruire con micron scala risoluzione sia interi cervelli del mouse o parti asportate, senza la necessità di sezionamento fisico. Come risultato rappresentativo, in figura 6 è mostrato l'intero cervelletto di un mouse L7-GFP (giorno postnatale 10). In questo animale tutti i neuroni di Purkinje sono etichettati con EGFP. Se si ingrandisce, la tipica struttura lamellare della corteccia cerebellare può essere visto (Figura 7). Ulteriore zoom consente di distinguere chiaramente ogni soma delle cellule di Purkinje (Figura 8). Il protocollo descritto può quindi essere usata per selezionare organizzazione spaziale neuronale in vari studi sviluppo neurologico.
Come secondo risultato rappresentativo, vi presentiamo le immagini dal cervello non sezionato di un adulto Thy1-GFP-M mouse. In questo animale transgenico EGFP è espresso in un sottoinsieme casuale neuronale sparse. La metà destra del cervello viene mostrato nella Figura 9. Come noizoom-in ulteriormente e in seguito (figure 10 e 11), processi neuronali diventano distinguibili. Questo risultato dimostra che il protocollo descritto permette la risoluzione micron scala imaging intere cervello di topo adulto, aprendo la possibilità di studiare anatomia tutto il cervello a risoluzione cellulare in modelli murini di malattie neurodegenerative.
Figura 1. Schema ottico del microscopio confocale luce foglio (CLSM). (A) Vista superiore dell'apparecchio, mostrando il percorso di eccitazione. Emissione laser da uno stato solido (DPSS) laser a diodo pompato 488 nm, dopo l'espansione e la collimazione da un primo telescopio, entra in un filtro accordabile acustoottico (AOTF) che regola l'intensità del fascio. Poi, un secondo telescopio espande ulteriormente il fascio. Uno specchio galvo verticale (lungo y) esegue la scansione sia am, che viene focalizzata da una lente all'interno della camera campione. (b) vista laterale dell'apparecchiatura, che mostra il percorso di rilevamento. Luce raccolta dall'obiettivo rilevamento è verticalmente descanned da uno specchio galvo e focalizzata da una lente, producendo un'immagine fissa della linea di eccitazione movimento. Alla posizione dell'immagine fissa un filtro spaziale lineare (fessura) è collocato. Dopo la fessura, uno specchio galvo posta all'interno di un sistema di lenti 4f ricostruisce un'immagine 2-dimensionale sul chip di un dispositivo ad accoppiamento di carica-elettroni moltiplicando (EM-CCD). Un filtro passa-banda fluorescenza rimuovere tutta la luce di eccitazione diffusa prima del rilevamento. I raggi rappresentativi di eccitazione, rilevazione e luce di rilevamento banda passante filtrata sono raffigurati dai, raggi di luce blu e verde blu, rispettivamente. Sono indicate le lunghezze focali di tutti gli obiettivi effettivamente utilizzati nel microscopio. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Compensazione dei campioni. Cervelli del mouse formaldeide-fisso, che sono memorizzati in PBS 0,1 M a 4 ° C (a), sono disidratati in una serie graduata di tetraidrofurano (THF, b) e successivamente controllata in 100% dibenzil etere (DBE , c). La fase di disidratazione provoca anche qualche restringimento dei tessuti.
Figura 3. Montaggio del campione per l'imaging CLSM. Il cervello azzerato può essere immerso direttamente sulla piastra di montaggio capovolto (a), incollato su un disco agarosio eliminato (b), o inserita in un becher eliminato agarosio (c).
Figura 4. Acquisizione tomografia. I pre-tomografia campioni di routine un parallelepipedo contenente il cervello (a) definire il numero e la lunghezza delle pile adiacenti paralleli necessari per vedere tutto il campione (b). Dopo tomografia, immagini nere vengono generate per completare il volume virtuale acquisito ad un parallelepipedo (c).
Figura 5. Volume cuciture. L'immagine raccolti impila sovrappongono parzialmente tra loro (a), permettendo loro allineamento preciso con il plug TeraStitcher (b). Il plugin poi unisce le pile allineate in un unico stack (c) o multi-stacked (d) la rappresentazione multi-risoluzione.
Figura 6. Tutta cervelletto di un topo P10 L7-GFP, in cui tutti i neuroni di Purkinje sono etichettati con EGFP. Bar Scala, 1 mm.
Figura 7. Zoom-in di una porzione del cervelletto mostrato in Figura 6, che mostra la tipica struttura lamellare della corteccia cerebellare. Bar Scale, 500 pm.
Figura 8. Ulteriore zoom-in di una porzione del cervelletto mostrato in Figura 6. Purkinje cellule soma può essere chiaramente distinguereed. Barra della scala, 200 micron.
Figura 9. La metà destra del cervello di un topo adulto Thy1-GFP-M, caratterizzato da una scarsa aspecifica etichettatura EGFP neuronale. Bar Scala, 1 mm.
Figura 10. Zoom-in di una porzione del mezzo cervello mostrato in Figura 9, che mostra parte dell'ippocampo e della corteccia. Bar Scale, 200 micron.
Figura 11. Ulteriori zoom-in di una porzione del mezzo cervello illustrato nella Figura 9. Diversi neuriti nella corteccia possono essere chiaramente distinti. Barra della scala, 50 pm.
Discussion
CLSM accoppiato con compensazione chimica rappresenta un potente strumento per studiare la neuroanatomia di interi cervelli di topo marcate con sonde fluorescenti, sia proteine o coloranti sintetici. Dato che la luce emessa al di fuori del piano focale è bloccato da un filtro spaziale fisica, imaging a contrasto elevato è possibile anche in campioni di spessore, mantenendo gli elevati tassi di frame tipici dell'architettura foglio leggero.
Il problema principale da affrontare quando usando i metodi descritti è la massimizzazione del contrasto. Infatti, il segnale disponibile è ridotto sia da fattori chimici e ottici. Dal punto di vista chimico, le procedure di compensazione sulla base solvente organico possono saziare emissione da proteine fluorescenti ed altri coloranti fluorescenti 7. Filtrazione del solvente per rimuovere perossidi, come descritto da Becker et al. 10, consente di mantenere un buon livello di fluorescenza anche in tessuti solvente eliminato. PubblicareED all'acqua metodi di compensazione 14 non riducono l'efficienza di fluorescenza, ma causare un deterioramento della trasparenza quando si tratta di interi cervelli murini, almeno con tecniche ottiche lineari.
D'altra parte, al momento non sono presenti obiettivi commerciali con lunga distanza di lavoro corretti per l'elevato indice di rifrazione (n ≈ 1,56) compensazione soluzioni utilizzate. Pertanto, la mancata corrispondenza tra indice di rifrazione del mezzo in cui il campione viene immerso e la progettazione uno degli obiettivi consente una forte aberrazioni sferiche. Oltre a ridurre la risoluzione del microscopio, tali aberrazioni determinano una goccia di intensità dell'immagine e contrasto, poiché la luce viene diffusa su un'area più ampia. Le possibili soluzioni a questo problema includono l'uso di ottiche adattive 15 e / o correttori asferiche statiche.
Qualsiasi miglioramento del contrasto dell'immagine e l'intensità colpisce facilmente anche velocità di esposizione, da una breve neitempo grazione per immagine può essere scelto. Al momento CLSM può permettersi una velocità di esposizione di circa 10 6 micron 3 / sec, con un tempo di esposizione di fotocamera 100 msec 9. A questa velocità richiede da 1-3 giorni a immagine di un intero cervello di topo, a seconda delle dimensioni del campione. Anche se nessun degrado significativo della qualità dell'immagine è osservato nel corso di tale lunga sessione di imaging, soprattutto a causa della bassa photobleaching intrinseca della luce di illuminazione foglio 6, il tempo necessario per una singola immagine di cervello di topo potrebbe in pratica ridurre l'applicabilità del CLSM. Un aumento di 10 volte in efficienza del sistema, accoppiato con l'uso di una telecamera ad alta velocità per il rilevamento, ridurrà tempi imaging per diverse ore, consentendo un uso di routine del protocollo descritto.
Nonostante tutti i limiti sopra indicati, CLSM immagini accoppiato alla compensazione chimica di tessuti permette di ricostruire interi cervelli di topi con risoluzione micron scala in meno di unsettimana. Altri metodi ottici per tutta imaging cerebrale permettersi risoluzione superiore rispetto CLSM, ma al prezzo di preparazione e / o al tempo di imaging 2-4, o di un z campionamento ridotto 5.
I metodi descritti in questo articolo possono essere utilizzati in combinazione con diverse strategie per l'etichettatura fluorescente: animali transgenici che esprimono proteine fluorescenti in sottogruppi selezionati neuronali, trasfezione virale, iniezione colorante intraparenchimale, ecc In pratica, tutte le strategie di colorazione precedenti sacrificio animale sono compatibili con CLSM . Infatti, marcatura fluorescente post-mortem di intere cervello di topo non è stata dimostrata fino ad ora, in ogni caso, se tale genere di colorazione sarebbe possibile in un prossimo futuro, il numero di campioni che possono essere ricostruite con CLSM diventerà molto più grande, potenzialmente comprese tessuto cerebrale umano.
In conclusione, la microscopia confocale foglio leggero usato in combinazione con tiscompensazione Sue e la gestione dei dati multi-risoluzione possono consentire ai ricercatori di ricostruire e analizzare campioni macroscopici con una risoluzione nella scala micron, con gli sforzi tecnologici che sono ben al lato della maggior parte dei laboratori. Le applicazioni potenziali di CLSM sono naturalmente non limitato alle neuroscienze, ma si estende tutti i campi di ricerca in cui è già stato utilizzato la microscopia foglio leggero, come l'embriogenesi 16,17 e anatomia degli animali di piccola taglia 18.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Settimo programma quadro dell'Unione europea (FP7/2007-2013) nell'ambito di accordi di sovvenzione n. 228.334 e 241.526. Questo progetto di ricerca è stata sostenuta anche dalla borsa di ricerca Human Frontier Science Program (RGP0027/2009), e dal Ministero italiano dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca nell'ambito del Flagship Progetto Nanomax e dal Ministero della Salute italiano nel quadro della "Cellule staminali Invito a presentare proposte". Questa ricerca è stata svolta nel quadro delle attività di ricerca del ICON fondazione supportate da "Ente Cassa di Risparmio di Firenze".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Sigma-Aldrich | P4417_100TAB | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Peroxide-free Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 186562 | |
| Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
| Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| Butylated hydroxytoluene | Sigma-Aldrich | W218405 | |
| Agarose Type III-A, High EEO | Sigma-Aldrich | A9793 | |
| Acrylic glue | Bostik | D2498 | |
| Vaa3D software | open source | freely downloadable from http://www.vaa3d.org/ |
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