Summary
Medlemmar av Burkholderia släktet är patogener av klinisk betydelse. Vi beskriver ett förfarande för att totalt bakteriellt protein extraktion, med användning av mekanisk sönderdelning och 2-D-gelelektrofores för efterföljande proteomic analys.
Abstract
Undersökningen av de intracellulära proteinnivåer av bakteriearter är av betydelse för att förstå sjukdomsframkallande mekanismerna på sjukdomar orsakade av dessa organismer. Här beskriver vi ett förfarande för proteinutvinning från Burkholderia arter baserat på mekanisk lys med användning av glaspärlor i närvaro av etylendiamintetraättiksyra och fenylmetylsulfonylfluorid i fosfatbuffrad saltlösning. Denna metod kan användas för olika Burkholderia arter, för olika tillväxtbetingelser, och det är sannolikt lämplig för användning i proteomic studier av andra bakterier. Efter proteinutvinning, är en tvådimensionell (2-D) gelelektrofores proteomik beskrivna tekniken för att studera globala förändringar i proteom av dessa organismer. Denna metod består av separation av proteiner i enlighet med deras isoelektriska punkten genom isoelektrisk fokusering i den första dimensionen, följt av separation på basis av molekylviktgenom akrylamid gelelektrofores i den andra dimensionen. Visualisering av separerade proteiner utföres genom silverfärgning.
Introduction
Släktet Burkholderia består av mer än 62 arter, gramnegativa organismer som isolerats från en mängd olika nischer, och den är uppdelad i två huvudsakliga grupper 1,2. Det första klustret ingår människa, djur och phytotrophic organismer, och de flesta studier har fokuserat på de patogena arterna i denna grupp på grund av deras kliniska betydelse. De mest patogena medlemmar är B. pseudomallei och B. mallei (som orsakar melioidosis och rots respektive) 3,4 och opportunistiska patogener (de 17 definierade arter av Burkholderia cepacia komplexa, BCC) 5, som orsakar sjukdom hos cystisk fibros (CF) och kronisk granulomatös sjukdom (CGD) 1. Det andra området, med mer än 30 icke-patogena arter, innehåller bakterier som följer med växter eller med miljön, och anses fördelaktigt för värden 2.
Många komplikationer uppstå frOM-bakteriell infektion med patogena medlemmar av Burkholderia släktet, såsom överföring av patogenen mellan patienter, spridning av sjukdomen och behandlingssvikt på grund av den inneboende eller förvärvad resistens mot antibiotika gör hårt för att utrota i de flesta fall 6-9. Därför få en tydligare förståelse för grunden för etablering av bakteriell infektion är avgörande för behandling av sjukdomar orsakade av dessa organismer. För att få insikt i etableringen av infektionen, krävs omfattande undersökningar på de bakteriella komponenterna i samband med patogenes. Studier med fokus på proteomik analys av Burkholderia organismer med hjälp av proteomik metoder beskrivna proteiner som har varit inblandade i bakteriell patogenes samt förändringar i deras proteome profiler 10-16.
Protein extraktionsmetoder som använder ultraljudsbehandling och frys tinade cykler i lyseringsbuffert innehållande höga koncentration av urea, har tiourea i kombination med diskmedel och amfolyter tillämpats i Burkholderia proteomik studier 10-13. Trots att urea är ganska effektiv för proteindenaturering, kan det skapa en jämvikt i vattenlösning med ammonium isocyanat, som kan reagera med aminosyragrupper och därigenom bilda artefakter (karbamylering reaktion) 17. Därför rekommenderas det att inkludera bäraramfolyter, som fungerar som cyanatgrupper asätare och undvika temperaturer över 37 ° C 17. Vidare, för att förhindra kemiska störningar lysbuffert med protein kvantifiering samma lysbuffert kan användas för att generera standardkurvan, så att proven och standarder har samma bakgrund 10. Andra metoder omfattar användning av alkaliska buffertar och rengöringsmedel med värme inkubationsperioder 17,18, men dessa villkor kan medföra förändringar i proteomet och vissa tvättmedel är inte kompatibla med proteomics ansökan om inte efterföljande borttagning tvättmedel steg ingår 17,18.
Efter adekvat extraktion och kvantifiering, kan studeras globala proteinuttryck i varje enskilt protein med hjälp av proteomik metoder såsom tvådimensionell (2-D) gelelektrofores. Denna teknik beskrevs först av O'Farell 19 och består i separation av proteiner i enlighet med deras isoelektriska punkten genom isoelektrisk fokusering i den första dimensionen, och sedan beroende på deras molekylvikt genom akrylamid gelelektrofores i den andra dimensionen. På grund av dess upplösning och känslighet, är denna teknik ett kraftfullt verktyg för att analysera och upptäcka proteiner från komplexa biologiska källor 19,20. Denna separationsteknik är för närvarande tillgänglig på protein-centrerad metoder med den stora fördelen av att lösa proteinisoformer orsakade av post-transkriptionella modifieringar eller proteolytisk bearbetning. Kvantitativa förändringarkan detekteras genom jämförelse med intensiteten hos den motsvarande fläcken efter färgning av gelén 20. Emellertid är denna teknik inte lämpar sig för identifiering av mycket stora proteiner, membranproteiner, extremt basiska och sura eller hydrofoba proteiner, och är en ganska arbetskrävande och tidskrävande teknik 20. Nya peptidcentrerade metoder (icke gel-baserade) som är mer robusta och objektiv blir tillgängliga och kan användas för kvantitativ jämförelse av differential stabil isotop märkningsmetoder såsom cystein märkning genom isotop-kodad affinitet taggning (ICAT) 21, och aminogrupp märkning genom isotopmärkning för relativ och absolut kvantifiering (iTRAQ) 22. Användningen av en enda proteomik teknik kan ge otillräcklig information, därför är nödvändigt att använda två kompletterande proteomik metoder för de flesta helt bedöma förändringar i proteome. Icke desto mindre är 2-D-gelelektrofores i stor utsträckning och kan tillämpas rutinmässigt för kvantitativa uttryck av flera proteiner i olika organismer.
Här beskriver vi en hel-cell protein utvinning och 2-D förfaranden gel elektrofores för Burkholderia arter som var anpassade och optimerade från GE Healthcare 2-D Elektrofores principer och metoder Handbook 80-6429-60AC 2004 ( www.amershambiosciences.com ). Extraktionen protein utfördes med användning av en vulst beater med glaspärlor i närvaro av PBS innehållande 5 mM EDTA (etylendiamintetraättiksyra) och 1 mM PMSF (fenylmetylsulfonylfluorid). Detta förfarande möjliggör kvantifiering av proteiner med minimal nedbrytning och kan ändras för proteomik metoder som tidigare rapporterats 15,23,24. 2-D gelelektrofores utfördes med användning av 24 cm långa immobiliserade pH 4-7 gradienten och proteinerna separerades enligt deras isoelektriska punkt. Då proteiner separerades enligt deras molecular vikt genom SDS-polyakrylamidgel. Dessutom har vi beskrivit en silverfärgningsmetod för visualisering av fläckproteiner och en silverfärgningsmetod som är kompatibel för masspektrometrianalys. Tillsammans dessa förfaranden kan möjliggöra identifiering av viktiga proteiner från Burkholderia arter som kan vara inblandade i patogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kultur Tillväxt (Dagar 1 2)
- Växa en startkultur: 3 ml av Luria Bertani (LB)-buljong i en snäpp topp 15 ml rör, vid 37 ° C rotator över natten. Späd natten tillväxt till en OD 600 på 0,6. Tillsätt 1 ml av denna spädning till 100 ml LB-buljong i en 250 ml-Erlenmeyerkolv. Inkubera vid 37 ° C med skakning vid 250 rpm under 16 h i stationär fas (SP), för att bättre ungefärliga, i satsvis odling, villkor infektion och för att försäkra att bakteriella virulensfaktorer under kontroll av stationära fassignal faktorer såsom rpoS och beslutförhet avkänning, uttrycks. Alternativt kan bakterierna odlas vid tidig SP eller mitten-eller sen logaritmisk fas användas för att få information om den bakteriella fas anpassning.
- Efter 16 tim mäta OD 600 och säkerställa kulturen har nått SP genom jämförelse med en tidigare konstruerad tillväxtkurva under identiska förhållanden.
2. Protein Extraction (Dag 3)
- Bered en färsk 0,1 M fenylmetansulfonylfluorid (PMSF, 174,19 g / mol) lösning i aceton genom att lösa 0,0174 g PMSF ("VARNING" PMSF är giftig och frätande, använd ansiktsskydd och handskar) i 1 ml aceton ("VARNING" aceton är giftig och brandfarlig, använd ansiktsskydd och handskar).
- Gör upp en PBS / EDTA / PMSF-lösning: 0,1 ml av 0,1 M PMSF, 0,1 ml av 0,5 M EDTA, och 9,8 ml PBS. Kontrollera OD i 16 h kultur är ungefär där det ska vara i SP.
- Ta 35 ml av bakteriekulturen och överföring till ett Oakridge centrifugrör och centrifugera kulturen vid 4500 x g under 20 min vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten till en avfallsbehållare ochTillsätt 35 ml kyld PBS och suspendera pelleten. Centrifugera igen vid 4500 x g under 20 min vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera i 1 ml kall PBS. Överför till sterilt 2 ml Eppendorf-och centrifugera 1 min på hög i mikrocentrifug vid 14.000 x g vid 4 ° C. Avlägsna och kassera supernatanten.
- Tillsätt 1 ml av PBS / EDTA / PMSF-lösning, suspendera pelleten och överför till en 2 ml skruvlock rör (med o-ring) som innehåller ~ 0,5 ml glaspärlor (försteriliserade). Lägg till det återsuspenderade pelleten till röret innehållande glaspärlorna och vulsten pucklar dem vid 4 ° C under 1 min i kallt rum. Gör detta 3x, sätta provet på is efter varje bash.
- Centrifugera vid 14.000 xg under 1 min i mikrocentrifug. Avlägsna supernatanten och lägga den i en steril 5 ml polystyren rör.
- För att öka avkastningen tillsätt 1 ml av PBS / EDTA / PMSF lösning på samma rör innehåller glaspärlor igen. Bead pucklar röret vid 4 ° C under 1 min. Gör detta 2x sätta provet på is after bash. Centrifugera vid 14000 x g under en minut på centrifugen och avlägsna supernatanten och tillsätt till supernatanten från steg 2,8. Använd en 1 ml spruta och en 0,20 | im filter supernatanten från polystyrenrör i ett annat sterilt 2 ml Eppendorf-rör.
- Vid denna punkt bör proverna analyseras med avseende på proteinkvantiteten med användning av Pierce MicroBCA proteinextraktion kit och alikvoter av 200 | j, g bör frysas vid -80 ° C tills de behövdes.
3. Provberedning (Dag 4)
- Bered 25 ml rehydrering stamlösning (8 M urea, 2% CHAPS, 2% IPG-buffert, 0,002% bromfenolblått) och lagra i 2,5 ml alikvoter vid -20 ° C. Lägg 7 mg ditiotreitol (DTT, 154,2 g / mol) precis före användning till en 2,5 ml alikvot av rehydrering stamlösning.
- Process tinade prover från steg 2,10 med hjälp av en 2-D Clean up kit med slut resuspension i 450 l av rehydrering stamlösning som framställts i steg 3.1.
4. Först-Dimension Isoelektrisk fokusering (lEF) (Dag 4)
Alla steg i detta avsnitt använder Ettan IGPhor IEF system.
- Ställ in IPG första dimensionen remsor: ren strip Hållare med band rengöringslösning och tvätta sedan med Milli-Q-vatten, låt upp och ner för att torka. Tilldela varje prov till en gel hållaren nummer.
- Ladda provet från rehydratisering steg i den andra bredare område från (-) änden. Använd rena pincett för att dra gelremsor ur förpackningen. Ta ut skyddande lager av gel remsor. Linje remsor grova sidan nedåt i en långsam, glidande rörelse för att få remsorna våta vägen från (-) slut på (+) änden.
- Sätt fuktigt läskpapper med steriliserat vatten ovanpå elektroden och under gelen remsorna för att undvika utbrändhet. Skölj pincett i-mellan rundorna med renat vatten och etanol. Ta bort alla bubblor, overlay tunt med mineralolja för att förhindra torra outs. Kantar gelremsa hållare på maskinen.
- Kör 12 h vid 20 ° C under rehydranson, 1 h vid 200 V, 1 h vid 500 V, 1 h vid 1000 V, 0,5 h vid 4000 V, 12 h vid 8000 V, 24 h uppehåll vid 300 V och kan tas ut vid denna tidpunkt.
- Efter lEF är klar, är det rekommenderat att utföra den andra dimensionen SDS-polyakrylamid-gelelektrofores, om nämnda IPG strip genom frystes vid -80 ° C i Saran Wrap belagt med mineralolja för framtida analys. Alternativt är det i syfte att undvika punkt strimmor på grund av DTT tillgång möjligt att inkludera en andra jämviktsteg av nämnda IPG-remsor innan den andra dimensionen med en buffert som innehåller jodacetamid.
5. Second dimension SDS-polyakrylamidgelelektrofores (Dag 5)
Alla steg i detta avsnitt använder Ettan DALTsix elektroforesapparat.
- För att montera gelen caster apparaten, rengör alla delar och se till att gelen caster är nivå och det grå gummi bindande smörjs med silikon gel. Sätt den svarta rubBER triangulär propp på bottnen. Därefter växelvis placera separatorn och glasplattorna med den kortare glasskiva mot framsidan. Se till separatorerna är på baksidan och framsidan. Fylla det återstående utrymmet med fyllmedel (ca 5 ark) så toppen är platt. Sätt frontpanelen på den röda spetsen på utsidan. Använd klämmor för att dra åt varje sida och dra åt de nedre skruvarna.
- Förbereda gel: Lägg 297,3 ml Duracryl, (är "SE UPP" Duracryl giftig använda ansiktsskydd och handskar), 147 ml Tris-buffert 1,5 M pH 8,8, och 143,3 ml Milli-Q-vatten i en kolv med vakuumspets som innehåller en omrörarstav. Sätt lock på toppen och blanda lösningen vid måttlig hastighet med vakuum på under 20 minuter. Det vakuum som används för att avgasa lösningen. Gör en färsk 10% ammoniumpersulfat-lösning (APS, 218,8 g / mol): 0,2 g APS till 2 ml Milli-Q-vatten.
- Lägga gelblandningen till gelén caster: När vakuum sker lägga 6 ml av 10% natriumdodecylsulfat (SDS, 228,38 g / mol)till den sida av kolven för att undvika att sätta fler bubblor i lösningen. Lägg APS, rör om, tillsätt 0,25 ml N, N, N ', N'-tetrametyletylendiamin (TEMED, 116,20 g / mol) ("VARNING" TEMED är brandfarlig använda ansiktsskydd och handskar) och rör om.
- Häll gelén blandningen i gel gjutmaskinen genom en tratt införd på baksidan av apparaten. Häll upp till en tum under kort platta. Lägg till 1,5 ml av vattenmättad butanol för att den övre delen av gelén och linda topp med saran wrap för att undvika uttorkning. Vänta en timme för att säkerställa fullständig polymerisation.
- Kontroll av gel: När gelen är klar (kolla kolven), ta isär gelen hjul med ett handfat. Kontrollera om gel integritet samtidigt skölja glasplattorna med varmt vatten, låt inte vatten komma in i plattan. Häll ut butanol och skölj toppen av gelen två gånger med vatten för att bli av butanol. Fyll toppen med vatten igen och låt sitta om gelerna inte används direkt.
- Förbereda remsorna: Bered jämviktsbuffertlösning frånfrys (6 M urea, 75 mM Tris-HCl pH 8,8, 29,9% SDS, 0,002% bromfenolblått). Detta kan vara preprepared och lagrades i 10 ml alikvoter vid -20 ° C. Lös upp 0,1 g av DTT till en 10 ml jämviktningsbuffert lösning. Ett rör kan användas för två IPG-remsorna. Placera geler av remsan sidan nedåt på buffert och låt det stå i 30 min. Kom ihåg vilken ände som är vilken.
- Förberedelse av elektroforesenheten (2-D-separationsapparat): Lägg till 4,5 L av 1x elektroforesbuffert (25 mM Tris-bas [121,1 g / mol], 192 mM glycin [288,38 g / mol] och 0,1% vikt / volym SDS [288,38 g / mol]) till bränsletanken. Denna buffert kan användas för upp till 3x. Slå på elektroforesenheten på. Kontrollera vattennivån i vatten kylmaskin och fyll den med vatten om den är låg. Sätt på maskinen trycker du på mode för att kontrollera den angivna temperaturen, som bör vara 10 ° C.
- Gör ett L av 2x löpbufferten och ett L av 1x av rinnande buffert och förvara dem vid 4 ° C. Gör agaros-tätningslösning: vikt 0,25 g agarose och lös upp i 50 ml 1x rinnande buffert. Puls för 15 sekunder vardera.
- Inställning av elektroforesenheten: Använd pincett för att ta ut varje remsa och ta bort överflödig buffert på båda sidor med ren pappershandduk. Rör INTE remsorna. Häll av vatten på toppen av gelén och rada gelén topp med 1x rinnande buffert. Använd rena pincett och placera remsorna på toppen av det långa skiv, med gelén sidan vänd mot dig. Lägg 1x buffert till remsorna för att smörja det. Glidremsor längre ner med hjälp av plastremsor. Ta bort alla bubblor i mellan remsan och gelén.
- Lägg agaros tätande lösningen till toppen av remsan för att täta den. Upprepa för resten av remsorna. Placera glasplattorna innehållande gelerna i gel vaggan och lägre i gelén tanken. Se till 1x buffertnivån i den yttre kammaren är den utsedda nedersta raden innan den övre kammaren på.
- Placera ramen för övre buffertkammare ovanpå glasplattorna och se till att det är allt way ner genom att trycka ner i botten. Använd en tratt och tillsätt 2x löpbufferten i den övre kammaren till mellersta raden. Använd en tratt och tillsätt 1x rinnande buffert till den yttre kammaren, tills den når den översta raden. Placera locket på toppen och slå på elektrofores enheten och nätdel.
- Kör över natten vid 52 V, 96 mA, 5 W. Kontrollera om strömmen går genom att leta efter bubblor på silvertråd nära toppen. Kör gelen tills den ledande linjen är en cm från botten.
- Proteiner kan också analyseras med hjälp av utrustning och reagenser från andra företag såsom BIORAD eller Hoefer, enligt tillverkarens instruktioner.
6. Silver Färgning av gelerna för Gel Visualisering (Dag 5-6)
- Bered en fix-lösning 1 (800 ml etanol, 200 ml ättiksyra och 1000 ml av Milli-Q-vatten i dragskåp i en plasthink). Lösning är bra för 6 geler. Vänd alla maskiner av och ta ut hela den mellersta delen av elektroforesenheten och pufinna den i diskhon. Sätta även den vita monter i diskhon. Dra ut det övre magasinet med 2x rinnande buffert.
- Ta isär apparaten och ta bort gelerna från glasplattorna i fix-lösning 1. Geler kan identifieras genom att skära av hörnen, när de tas bort från glasplattorna, antalet hörn skära motsvarande gelén ordning i gjutmaskinen.
- Placera behållaren med fix-lösning och gelerna på en rocker i minst 1 timme till över natten vid 4 ° C.
- Överför gelerna att fixera Lösning 2 (20 ml av 50% glutaraldehyd, 600 ml etanol, 5 g kalium tetrationat (302,46 g / mol), 136 g natriumacetat (82,03 g / mol) och Milli-Q-vatten för att 2000 ml) och placera på en vippa under 1 timme.
- Tvätta gelerna 4x för 15 min vardera i Milli-Q-vatten.
- Fläck gelerna i silvernitratlösning (4 g silvernitrat (169,87 g / mol), 500 | il av formaldehyd och Milli-Q-vatten till 2000 ml) under 30 min eller upp till 48 timmar.
- Tvätta gel för 1minuter i Milli-Q-vatten.
- Överföring till framkallningslösning (60 g natriumkarbonat (105,99 g / mol), 300 | il av formaldehyd, 15 mg natrium-tiosulfat (158,11 g / mol) och Milli-Q-vatten till 2000 ml) under 5-30 min tills Gelén färgas.
- Sätt gelerna i stopplösning (100 g Tris-bas (121,14 g / mol), 40 ml ättiksyra, och Milli-Q-vatten till 2000 ml) i 10 min.
- För lagring, överföra gel till Glycerol lösning (40 ml glycerol eller 400 ml, om långtidslagring önskas, och 1.600 ml Milli-Q-vatten) i 10 minuter och sedan torka dem med en gel torktumlare.
- Geler kan visualiseras efter färgning med hjälp av bildsystem såsom en scanner / densitometer, fotograferad med hjälp av ljus transilluminator eller gel kameran. Image Analysis såsom PDQuest 2-D-analys från BIORAD kan sedan användas för att erhålla kvantitativ och kvalitativ information från proteinerna i ett prov.
7. Gel Silver Färgning för masspektrometri analys
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Jämförande analys av proteinprofiler som extraherats från samma bakteriekultur vid två olika tillfällen visade liknande mönster banding indikerar lyckade protein extraktioner. Molekylvikts proteiner extraherade varierade från 10 till 150 kDa. Figur 1 visar representativa Coomassie blåfärgning gel av helcell-protein-extrakt från Burkholderia multivorans (en medlem av den BCC) kliniska isolat odlade i LB eller Jäst / mannitol (YEM)-buljong och skördas från stationär fas.
För 2-D-gelelektrofores-analys var 200 | j, g av totala proteiner från Burkholderia pseudomallei användas (figur 2). Eftersom denna patogen är erkänd som en B-typ biologisk krigföring agent av US Centers for Disease Control and Prevention 25, var protein alla förberedelser genomförts i Bio Safety Nivå 3 inneslutning laboratorium och följaktligen med standardrutiner.Proteiner återsuspenderades i vätskeersättning och applicerades på en 24 cm lång immobiliserade pH 4-7 gradienten och proteiner separerades enligt deras isoelektriska punkt (pl). Då remsorna placerades på en SDS-polyakrylamidgel och proteinerna separerades enligt sin molekylvikt (MW). Därefter Gelén silverfärgades för proteinet fläck visualisering. Resultat visade det överflöd av mer än 500 proteinfläckar som kan identifieras individuellt av masspektrometri.
Figur 1. SDS-PAGE-analys av proteinextraheras vid den stationära fasen från D-2214 och D-2094-isolat odlades i LB eller Jäst / mannitol (YEM)-buljong i två olika tillfällen Totala proteinprofilerna för Burkholderia multivorans isolat. (1 och 2). 4 pg av protein laddades i varje bana av en 12,5% gel och färgade with Coomassie-blått. Lane M, proteinmarkör.
Figur 2. 2-D gelelektrofores analys av Burkholderia pseudomallei 1234B isolera. Representant silver-färgade 2-D gel som visar proteinseparation i pl 4 till 7-range remsa. Hel-cellproteinextrakt (200 ^ g) vid den stationära fasen användes och separerades på en 15% SDS-PAGE-gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förfarande för proteiner framställning har beskrivits som kan extrahera de flesta av Burkholderia proteiner med god reproducerbarhet. Detta demonstreras genom att erhålla samma proteinprofilen från två oberoende beredningar som utförs på olika dagar med användning av samma bakteriekulturen odlades i LB eller YEM buljong såsom visas i fig. 1. Extraction var effektiv för bakterier som odlas i flytande medier, men vi har inte testat den här metoden för bakterier som odlas på plattor. Denna metod användes också för ytterligare proteinkarakterisering använder proteomic verktyg, vår grupp har framgångsrikt studerats Proteome ändringar med 2-D-gelelektrofores och isotopmärkningen för relativ och absolut kvantifiering (iTRAQ) proteomic tekniker 15,23,24. För de senare var proteiner utvinns i en buffert innehållande 0,5 M EDTA i PBS för att undvika eventuella störningar av PMSF med iTRAQ experimenten 15.
Det är viktigt att remarken att under proteinutvinningsprocessen och 2-D-gelelektrofores bör alla steg utföras vid 4 ° C eller i kyla med hjälp av is hinkar för att minimera proteinnedbrytning, såväl som att använda pluggade spetsar och slitage nitril och täcka alla huden för att förhindra keratin förorening av eventuella fläckar skär ut för senare identifiering av masspektrometri. När du utför protein extraktioner, är det också viktigt att beakta att PMSF har en kort halveringstid i vattenlösningar, enligt tillverkaren, därför bör den 0,1 mM stamlösning i aceton omedelbart före användning. Alternativt kan andra serin eller proteashämmare som är mer löslig och stabil och mindre toxiska användas, även om vi inte har testat dem i våra experiment.
Den lysbuffert används i detta förfarande inte innehåller urea, vilket är viktigt för solubiliseringen att extrahera både vattenhaltiga (cytosola) proteiner och mindre lösliga proteins, inklusive några membranproteiner 17. Men under provberedning för första dimensionen isoelektrisk fokusering (steg 3 i detta protokoll), prover suspenderades i rehydrering buffert som innehåller urea. Andra proteomik tekniker innebär också liknande behandling 26. Innan du följer med vätskeersättning steg, verkar det som att avlägsna störande material eller lågmolekylära föroreningar är avgörande för högupplöst, rekommenderar vi att använda 2-D Clean-up Kit i varje proteinprover som resultat förbättrades. Tidigare laddar prover för första dimensionen isoelektrisk fokusering separation, se till att ha förberedda remsor av läskpapper rätt storlek på bandhållare, eftersom det är problematiskt att klippa i rätt storlek i aseptisk mode på plats (till steg 3.4 i detta protokollet).
Innan driva ett 2-D SDS-polyakrylamid-gelelektrofores, är det nödvändigt att säkerställa att gelén procentandel passar de förväntade storlekarna av intresse (en 120,5% procentuell gel av kan lösa protein i intervallet 14-100 kDa). Efter andra dimensionen gelelektrofores är färdig, kan visualisering av proteiner uppnås genom Coomassie-blått eller silverfärgning, den senare färgning är känsligare med detektionsgränsen är så låg som 0,1 ng / protein / plats 20. Proteinfläckar visualiserades med silverfärgning är lämpliga för vidare analys med masspektrometri. Det är dock viktigt att nämna att silver fläck lösning inte bör innehålla glutaraldehyd eftersom detta medel tvärbinder med proteiner, därför är det inte förenligt med ytterligare masspektrometri analys 20. Alternativt, för att detektera och kvantifiera differentiellt uttryckta proteiner, kan användas en annan gel-baserad metod som t.ex. Two Dimensional-skillnad i gelelektrofores (2D-DIGE) tillsammans med automatiserad programvara. Detta tillvägagångssätt använder olika fluorescerande taggar (t.ex. Cy 3, 5 och 2) som används för att märka prover och en universell intern standard prior att andra dimensionen elektrofores övervinnande, till viss grad, nackdelarna med variation och reproducerbarheten hos 2-D-elektrofores 27. Dessutom kan geler färgas efter den andra dimensionen med SyproRuby, som är en organometallisk rutenium-kelat fläck utformad för proteomic tillämpningar. Den kan upptäcka proteinfläckar med liknande känslighet för den silverfärgning, men med större känslighet än Coomassieblått. Efter färgning geler kan fotograferas med laserskanner eller transilluminator 28.
Sammanfattningsvis, denna video beskriver en hel-cell bakteriellt protein extraktionsmetod och 2-D gelelektrofores metod som kan tillåta studiet av globala förändringar i proteomet i Burkholderia arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en student från University of British Columbia (BV) och bidrag från Cystisk Fibros Kanada och den kanadensiska Institutes of Health Research (till DPS). Vi tackar Jacqueline Chung för den inledande beredningen av protokoll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | Toxic, corrosive |
| Acetone | Fisher | A18-1 | Flammable |
| PBS Buffer | Bioscience | R028 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP118-500 | toxic |
| Glass beads (0.1 mm) | BioSpec Products | 11079101 | |
| Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) | VWR | 21009-342 | |
| MicroBCA protein extraction kit | Pierce | 23235 | |
| Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring | Fisher | 02-681-375 | |
| 2-D Clean-Up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| Urea | Invitrogen | 15505-050 | Irritant |
| CHAPS | Amersham Biosciences | 17-1314-01 | |
| Dithiothreitol (DTT) | MPBiomedical, LCC | 856126 | Irritant |
| Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm | Amersham Biosciences | 176002-46 | |
| Duracryl | Proteomic Solutions | 80-0148 | Very toxic, carcinogen |
| Ammonium persulfate | Fisher | BP179-100 | Flammable, toxic, corrosive |
| N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Invitrogen | 15524-010 | Flammable |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Acute toxicity, flammable |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Ethanol | Fisher | HC1100-1GL | Flammable, toxic |
| Acetic acid | Fisher | A491-212 | Flammable, corrosive |
| Glutaraldehyde | Fisher | G151-1 | Very toxic, corrosive, dangerous for the environment |
| Potassium tetrathionate | Sigma | P2926 | Irritant |
| Sodium acetate | EM Science | 7510 | |
| Silver nitrate | Sigma | 209139 | Corrosive, dangerous for the environment |
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | Toxic |
| Sodium thiosulfate | Sigma | S7026 | |
| Tris Base | EMD | 9230 | |
| Glycine | MPBiomedical, LCC | 808831 | |
| Glycerol | MPBiomedical, LCC | 800688 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Flammable, toxic, health hazard |
| Sodium carbonate anhydrous | EMD | SX0400-3 | Toxic |
| Mineral oil | ACROS | 415080010 | |
| Equipment | |||
| JA-20 ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 334831 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | 3110BX | |
| Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories | GE Healthcare | 80-6505-03 | www.amershambiosciences.com |
| Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system | GE Healthcare | 80-6485-27 | www.amershambiosciences.com |
References
- Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence. Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).
- Suarez-Moreno, Z. R., et al. Common Features of Environmental and Potentially Beneficial Plant-Associated Burkholderia. Microb. Ecol. , (2011).
- Wiersinga, W. J., van der Poll, T., White, N. J., Day, N. P., Peacock, S. J. Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei. Nat. Rev. Microbiol. 4, 272-282 (2006).
- White, N. J.
- Mahenthiralingam, E., Urban, T. A., Goldberg, J. B. The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex. Nat. Rev. Microbiol. 3, 144-156 (2005).
- Speert, D. P., Henry, D., Vandamme, P., Corey, M., Mahenthiralingam, E. Epidemiology of Burkholderia cepacia complex in patients with cystic fibrosis. Canada. Emerg. Infect. Dis. 8, 181-187 (2002).
- Dance, D. A., Wuthiekanun, V., Chaowagul, W., White, N. J. The antimicrobial susceptibility of Pseudomonas pseudomallei. Emergence of resistance in vitro and during treatment. J. Antimicrob. Chemother. 24, 295-309 (1989).
- Thibault, F. M., Hernandez, E., Vidal, D. R., Girardet, M., Cavallo, J. D. Antibiotic susceptibility of 65 isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei to 35 antimicrobial agents. J. Antimicrob. Chemother. 54, 1134-1138 (2004).
- Govan, J. R. W., et al. Evidence for transmission of Pseudomonas cepacia by social contact in cystic fibrosis. Lancet. 342, 15-19 (1993).
- Thongboonkerd, V., et al. Altered proteome in Burkholderia pseudomallei rpoE operon knockout mutant: insights into mechanisms of rpoE operon in stress tolerance, survival, and virulence. J. Proteome. Res. 6, 1334-1341 (2007).
- Park, K. H., Lipuma, J. J., Lubman, D. M. Comparative proteomic analysis of B. cenocepacia using two-dimensional liquid separations coupled with mass spectrometry. Anal Chim. Acta. 592, 91-100 (2007).
- Wongtrakoongate, P., Mongkoldhumrongkul, N., Chaijan, S., Kamchonwongpaisan, S., Tungpradabkul, S. Comparative proteomic profiles and the potential markers between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Mol. Cell Probes. 21, 81-91 (2007).
- Harding, S. V., et al. The identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei. Vaccine. 25, 2664-2672 (2007).
- Madeira, A., Santos, P. M., Coutinho, C. P., Pinto-de-Oliveira, A., Sa-Correia, I. Quantitative proteomics (2-D DIGE) reveals molecular strategies employed by Burkholderia cenocepacia to adapt to the airways of cystic fibrosis patients under antimicrobial therapy. Proteomics. 11, 1313-1328 (2011).
- Zlosnik, J. E. A., Speert, D. P. The Role of Mucoidy in Virulence of Bacteria from the Burkholderia cepacia Complex: A Systematic Proteomic and Transcriptomic Analysis. J. Infect. Dis. 202, 770-781 (2010).
- Riedel, K., Carranza, P., Gehrig, P., Potthast, F., Eberl, L. Towards the proteome of Burkholderia cenocepacia H111: setting up a 2-DE reference map. Proteomics. 6, 207-216 (2006).
- Weiss, W., Gorg, A. Sample solublization buffers for two-dimensional electrophoresis. Methods Mol. Biol. 424, 35-42 (2008).
- von der Haar, T. Optimized protein extraction for quantitative proteomics of yeasts. PLoS One. 2, e1078 (2007).
- O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250, 4007-4021 (1975).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).
- Gygi, S. P., Rist, B., Griffin, T. J., Eng, J., Aebersold, R. Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags. J. Proteome Res. 1, 47-54 (2002).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
- Velapatiño, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis. Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).
- Chung, J. W., Speert, D. P. Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host. Microbiology. 153, 206-214 (2007).
- Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. Public health assessment of potential biological terrorism agents. Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).
- Thon, J. N., et al. Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches. Transfusion. 48, 425-435 (2008).
- Wu, T. In New and Emerging Proteomic Techniques. Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).
- Lopez, M. F., et al. A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling. Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).
