Summary
أداء المقايسات ثقافة الخلية عن التحقيق في التصاق البكتيريا وغزو تحت الظروف الهوائية عادة ما يكون غير ممثل لل
Abstract
وقد تم التحقيق في التفاعلات من مسببات الأمراض البكتيرية مع الخلايا المضيفة على نطاق واسع باستخدام طرق زراعة الخلايا في المختبر. ولكن كما يتم تنفيذ مثل هذه المقايسات ثقافة الخلية تحت الظروف الهوائية، وهذه نماذج في المختبر قد لا تمثل بدقة في بيئة الجسم الحي الذي تفاعلات المضيف الممرض تأخذ مكان. لقد قمنا بتطوير نموذج المختبر في العدوى التي تسمح للcoculture من البكتيريا والخلايا المضيفة في ظل ظروف مختلفة والغاز المتوسطة. الدائرة إنتشار عمودي (VDC) نموذج يحاكي ظروف في أمعاء الإنسان حيث البكتيريا سيكون تحت ظروف انخفاض الأكسجين جدا في حين سيتم تزويد الأنسجة بالأوكسجين من مجرى الدم. وضع الاستقطاب الخلية (IEC) الطبقات الوحيدة الظهارية في الأمعاء نمت في إدراج Snapwell إلى VDC يخلق مقصورات قمية وbasolateral منفصلة. يتم تعبئة مقصورة basolateral مع مستنبت الخلية، ومختومة مع perfused ث الأكسجينhilst المقصورة قمية يتم تعبئة مع مرق، تبقى مفتوحة وحضنت تحت ظروف microaerobic. يمكن الحفاظ على حد سواء كاتشو-2 و T84 IECS في VDC في ظل هذه الظروف من دون أي آثار ضارة واضحة على بقاء الخلية أو سلامة أحادي الطبقة. تجارب Coculturing يؤديها مع مختلف C. الصائمية السلالات البرية من نوع وخطوط IEC مختلفة في نموذج VDC مع ظروف microaerobic في المقصورة القمي يؤدي بتكاثر إلى زيادة في عدد التفاعل (ما يقرب من 10 أضعاف) وبين الخلايا (ما يقرب من 100 أضعاف) البكتيريا مقارنة مع الظروف الثقافة الهوائية 1. البيئة التي تم إنشاؤها في نموذج VDC يحاكي بشكل وثيق على البيئة من خلال C. اجه الصائمية في أمعاء الإنسان، ويسلط الضوء على أهمية أداء في فحوصات المختبر تحت ظروف العدوى التي تحاكي بشكل وثيق في الواقع الجسم الحي. نقترح سوف أن استخدام نموذج VDC تسمح تفسيرات جديدة للتفاعلات الرهانوين مسببات الأمراض البكتيرية والخلايا المضيفة.
Introduction
وقد تم التحقيق في التفاعلات من مسببات الأمراض البكتيرية مع الخلايا المضيفة على نطاق واسع باستخدام طرق زراعة الخلايا في المختبر. استخدام مثل هذه المقايسات ثقافة الخلية، التصاق البكتيريا إلى الخلايا المضيفة، تحديد مستقبلات الخلية المضيفة، الخلية المضيفة مسارات إشارات والغزو الجرثومي للخلايا المضيفة كلها قد درس بالتفصيل، مما أدى في كثير من الملاحظات الهامة. ومع ذلك يتم تنفيذ مثل هذه المقايسات ثقافة الخلية تحت الظروف الهوائية التي قد لا تكون ممثلة للبيئة في الجسم الحي. وجود قيود كبيرة من نماذج في المختبر تستخدم لدراسة التهابات الجهاز الهضمي هو أن الظروف الثقافة بما في ذلك مستويات الاوكسجين عالية يفضلون عموما بقاء الخلية حقيقية النواة. لكن الظروف في لمعة الأمعاء سيكون اللاهوائية تقريبا. مسببات الأمراض المعوية في بيئة منخفضة الأوكسجين جدا التعبير عن الجينات الفوعة التي التعبير التغيرات في الظروف الهوائية 2. على هذا النحو، الحصول على بيانات باستخدام معيار خلية ثقافة نماذج مAY تعطي مؤشرا غير دقيق من التفاعلات البكتيرية مع الخلايا المضيفة.
العطيفة الصائمية هو العامل المسبب الرئيسي لالتهاب المعدة والأمعاء الحاد الجرثومي في جميع أنحاء العالم، مع الأعراض التي تتراوح من إسهال خفيف إلى الأمعاء الالتهابية الحادة. غالبية C. الصائمية العدوى نتيجة في التهاب المعدة والأمعاء غير معقدة، لكن C. الصائمية هو أيضا وكيل المعدية الأكثر شيوعا التي تم تحديدها في اعتلال الأعصاب المحيطية بما في ذلك متلازمة غيان باريه (GBS). في المملكة المتحدة، تشير التقديرات إلى أن هناك أكثر من 500،000 حالة من حالات التهاب الأمعاء الناجم عن C. عدوى الصائمية كل عام بتكلفة يتوقع أن اقتصاد المملكة المتحدة من 580 مليون جنيه إسترليني. في العالم النامي، C. الصائمية هو السبب الرئيسي للوفيات بين الأطفال. وعلى الرغم من الأهمية التي لا جدال من عدوى العطيفة وعقود من البحث، بما في ذلك التحليل القائم على علم الجينوم شامل، C. الصائمية المرضية لا تزال تفهم سيئةالعود، وعلى النقيض من مسببات الأمراض المعوية الأخرى مثل السالمونيلا، كولاي، الشغيلة، وضمة الكوليرا. عدم وجود نموذج حيواني صغيرة مريحة هو أحد الأسباب الرئيسية لهذا 3. كما تستخدم على نطاق واسع في نماذج العدوى المختبر هي أكثر مناسبة لدراسة microaerophilic C. الصائمية من مسببات الأمراض المعوية عن الأخرى التي هي اللاهوائيات اختياري. في حين C. ومن المسلم به الصائمية كأحد العوامل الممرضة الغازية، وآليات C. غزو الصائمية من الخلايا الظهارية في الأمعاء (IECS) لا تزال غير واضحة 4،5. C. وقد تبين غزو الصائمية أن تعتمد على إما microfilaments، الأنابيب الدقيقة، مزيج من الاثنين معا أو لا 5. اللبس في هذا المجال هو على الارجح بسبب استخدام غير مناسب في الظروف فحص المختبر.
وقد استخدمت عدد من مختلف المقايسات ثقافة الخلية للتحقيق في تفاعلات C. الصائميةمع الخلايا المضيفة. كاتشو-2 6، وكانت جميعها تستخدم INT 407 7، وT84 8 خطوط الخلايا لدراسة التصاق وغزو قدرات مختلفة C. سلالات الصائمية. ومع ذلك، فإن مستويات التصاق البكتيريا وغزو لC. الصائمية مع IECS هي أقل بشكل كبير من مسببات الأمراض المعوية الأخرى ل9. وcoculturing من C. الصائمية مع IECS يتم تنفيذ عادة في حاضنة CO 2 في ظل ظروف قريبة من مستويات الأوكسجين في الغلاف الجوي، اللازمة لبقاء IECS. C. سوف الصائمية التعبير الجيني تكون مختلفة جدا في بيئة منخفضة الأوكسجين من تجويف الأمعاء بالمقارنة مع ظروف الأوكسجين في الغلاف الجوي.
وقد تم تطوير استخدام غرفة (VDC) نظام إنتشار عمودي الذي يسمح coculture من البكتيريا والخلايا المضيفة في ظل ظروف الغاز 1،10،11 مختلف المتوسطة و. هذا النظام يحاكي ظروف في أمعاء الإنسان حيث البكتيريا ستكون الأمم المتحدةوسيتم تزويد ظروف دير منخفض جدا من الأوكسجين، بينما الأنسجة مع الأوكسجين من مجرى الدم. وضعت الطبقات الوحيدة IEC الاستقطاب نمت في الخاص 0.4 ميكرون مرشحات في VDC خلق مقصورة قمية وbasolateral، التي امتلأت بشكل فردي مع مرق البكتيرية والخلية مستنبت على التوالي (الشكل 1). وضعت VDC في الجو المتغير الحاضنة تحتوي على 85٪ N 2، 5٪ O 2، و 10٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية، وهو ما يمثل الظروف المثلى لC. الصائمية. وقد غادر مقصورة قمية مفتوحة ومعرضة للجو microaerobic داخل الغلاف الجوي حاضنة متغير، في حين أن المقصورة basolateral مختومة تم توفيرها مع الأوكسجين من قبل الإدارة المستمر لل5٪ CO 2/95٪ O 2 خليط الغاز مع أنبوب منفذ منع تراكم الضغط . وتأكدت كاتشو-2 بقاء الخلية وسلامة أحادي الطبقة في ظل هذه الظروف من خلال رصد ايلى بطريق الظهارةالمقاومة ctrical (طير) عبر أحادي الطبقة أكثر من 24 ساعة لإثبات بقاء كاتشو-2 أحادي الطبقة الخلية الجسدية والفصل بين المقصورات قمية وbasolateral في ظل ظروف انخفاض الأكسجين في مقصورة القمي. أظهرت طير من الطبقات الوحيدة في لجان التنمية القروية المحافظة في الغلاف الجوي حاضنة متغير (شروط microaerobic) وفي ثقافة الخلية القياسية CO 2 الحاضنة (الظروف الهوائية) توجد فروق ذات دلالة، مما يدل على سلامة أحادي الطبقة الخلية تحت الظروف الجوية المختلفة 1. في ظل ظروف microaerobic، ظلت منعطفات ضيقة الحاضر وزعت بالتساوي بين حدود الخلية ونمط تلطيخ occludin مماثلة لخلايا حافظت تحت الظروف الهوائية 1.
تفاعلات C. الصائمية مع كاتشو-2 و T84 الخلايا في VDC تم التحقيق من خلال تقييم التفاعل البكتيري (التصاق والغزو) والغزو. اثنين C. مختلفة الصائمية البرية من نوع straiواستخدمت NS 1. C. الصائمية 11168H هو مشتق مفرط التحرك من سلالة تسلسل الأصلي NCTC11168. يظهر سلالة 11168H مستويات أعلى بكثير الاستعمار في نموذج الاستعمار كتكوت وبالتالي تعتبر سلالة مناسبة للاستخدام للدراسات التفاعل المضيف الممرض. 81-176 هو الإنسان وعزل هي واحدة من سلالات مختبر درس على نطاق واسع معظم الغازية. C. أضيفت سلالات الصائمية إلى المقصورة قمية من VDC تحت أي ظروف microaerobic أو الهوائية. لاحظنا سجلت معدلات أعلى لكلا التفاعل وغزو لC. الصائمية في ظل ظروف microaerobic 1. زيادة C. كانت التفاعلات الصائمية لا يرجع إلى زيادة في أعداد البكتيريا في ظل ظروف microaerobic 1. تدعم هذه البيانات فرضيتنا بأن البيئة منخفضة الأوكسجين في مقصورة قمية من VDC يعزز التفاعلات البكتيريا المضيفة ويشير إلى أن خصائص الغازية من C. الصائمية هي incrخفت في ظل هذه الظروف. كان هذا هو التقرير الأول عن استخدام نموذج VDC لدراسة العوامل المسببة للأمراض البكتيرية الغازية ويسلط الضوء على أهمية أداء في فحوصات المختبر تحت ظروف العدوى التي تحاكي بشكل وثيق الوضع في الجسم الحي. نموذج VDC يمكن أن تستخدم لدراسة التفاعلات المضيف الممرض للعديد من الأنواع البكتيرية المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. نمو الطبقات الوحيدة IEC على الخاص 0.4 ميكرون مرشحات
- ثقافة كاتشو-2 الخلايا في وسائل الإعلام ضروري تعديل Dulbecco ل(DMEM) تستكمل مع 10٪ (V / V) مصل العجل الجنين، و 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، و 1٪ (V / V) الأحماض الأمينية غير الأساسية في الأنسجة مستوى ثقافة حاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 و 95٪ هواء. البذور 4 × 10 5 كاتشو-2 IECS في 0.4 ميكرون فلتر وتنمو لاستقطاب أكثر من 21 أيام، وتغيير وسائل الاعلام كل 2-3 أيام.
- قياس طير لتأكيد حالة استقطاب أحادي الطبقة باستخدام المقاومة فولت أوم متر. في دراساتنا، وطير من 21 يوم كاتشو-2 الخلايا المزروعة في هذه الفلاتر ميكرون 0.4 هو 700-800 Ωcm 2.
2. إعداد C. الصائمية ومتوسطة الجرثومي للمقايسة Coculturing
- 24 ساعة قبل المرجوة نقطة انطلاق للمقايسة coculturing VDC، وإعداد طازجة لوحة آغار الدم من C. الصائمية واحتضان عند 37 درجة مئوية تحت ظروف microaerobic (85٪ N 2، 5٪ O 2، و 10٪ CO 2) في الغلاف الجوي حاضنة متغير.
- في نفس الوقت، يحضن مسبقا 30 مل من مرق البروسيلا عند 37 درجة مئوية تحت ظروف microaerobic في جو الحاضنة متغير.
3. إعداد والتعقيم من نصف الدوائر VDC قبل الفحص
- تزج تماما نصف الدوائر VDC فضلا عن O-الخواتم والمقابس في حل التعقيم.
- استخدام معقم 20 مل حقنة، تدفق الحل التعقيم من خلال مداخل الغاز في كلا المجلسين نصف. قد يؤدي عدم القيام بذلك يؤدي إلى تلوث العينات خلال coculturing.
- ترك كل مكونات مغمورة في محلول التعقيم ل> 1 ساعة.
- شطف جميع المكونات مع الماء المعقم الطازجة، وذلك باستخدام آخر معقم 20 مل حقنة لطرد مداخل الغاز.
4. إعدادمن اللقاح البكتيري
- حصاد نصف طبق من C. أعدت نمو الصائمية من لوحة آغار الدم في اليوم السابق إلى 1 مل من مرق البروسيلا preincubated. هذا ينبغي أن تسفر ~ 10 10 وت م / مل.
- قياس الكثافة البصرية للتعليق البكتيرية في 600 نانومتر إلى semiquantify مستعمرة بكتيرية (CFUs).
- ضبط تعليق البكتيرية إلى المستوى المطلوب اللقاح في 4 مل من مرق البروسيلا preincubated.
- إجراء التخفيف المتسلسل من هذا تعليق البكتيرية النهائي تليها الطلاء من التخفيفات المناسبة على لوحات أجار الدم في ثلاث نسخ، ثم احتضان عند 37 درجة مئوية في جو الحاضنة متغير لمدة 48 ساعة لقياس عدد من CFUs البكتيرية الموجودة في اللقاح.
5. إعداد VDC
- وضع النصف السفلي غرفة شقة VDC على مقاعد البدلاء. يصلح يا الدائري على نصف الدائرة السفلي.
- فصل مرشح واحد يحمل IECS من tانه الناقل ويغسل ثلاث مرات مع 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة. وضع مرشح على نصف مجلس النواب، والتأكد من يبقى يا الدائري في المكان.
- خفض بلطف النصف الغرفة العليا في مكانها. وحالما يتم تجميعها لمدة نصف الدوائر، المشبك معا باستخدام المشابك حلقة. وضع VDC أفقيا على أعلى مقاعد البدلاء، مع اثنين من فتحات متجهة لأعلى.
- إضافة مل 4 من اللقاح البكتيري في نصف الدائرة القمي.
- إضافة 4 مل من مستنبت الخلية من بداية الشوط غرفة basolateral.
- ضع القطع في نهاية فتحات في كلا المجلسين نصف.
6. ربط VDC إلى مشعب الغاز داخل حاضنة الجو متغير
- وضع VDC في الغلاف الجوي حاضنة متغير على مقربة من مشعب الغاز.
- فتح منظم امدادات الغاز متصلا مشعب الغاز. نعلق الأنبوب من مشعب في مدخل الغاز على نصف غرفة basolateral من VDC. إرفاق GAق الأنابيب منفذ المؤدية للخروج من متغير جو الحاضنة إلى واحدة من منافذ في قطعة وتنتهي في نصف غرفة basolateral.
- إغلاق منفذ الأخرى في قطعة وتنتهي في نصف غرفة basolateral. فتح تدفق الغاز في مشعب الغاز، مع الحرص على فتحه ببطء شديد لتجنب ضغط الغاز الزائد، وهذا يمكن أن يؤدي إلى طرد المتوسطة basolateral.
- والهدف هو تدفق الغاز من 1 فقاعة كل 2-5 ثوانى. دوري اطمئنان على تدفق الغاز خلال التجربة وتعديل إذا لزم الأمر.
7. تفكيك VDC بعد Coculture
- بعد فترة coculture المناسبة، إغلاق منظم امدادات الغاز متصلا مشعب الغاز. إغلاق تدفق الغاز في VDC في مشعب. فصل مدخل الغاز، ومنفذ الغاز وسدادة من VDC.
- إزالة VDC من جو الحاضنة متغير. إزالة supernatants قمية وbasolateral وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة subsequenتحليل ر.
- إزالة المشابك خاتم واتخاذ بلطف بعيدا عن VDC. إزالة عامل التصفية من نصف الدائرة ونقل إلى 6 جيدا طبق خلية ثقافة عقيمة. غسل IECS ثلاث مرات مع 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة.
- لتعداد العدد الكلي للبكتيريا التفاعل، إضافة 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة التي تحتوي على 0.1٪ (V / V) تريتون X-100 إلى IECS واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لليز IEC. إجراء التخفيف المتسلسل من هذه الخلايا المحللة تليها الطلاء من التخفيفات المناسبة على لوحات أجار الدم في ثلاث نسخ، ثم احتضان عند 37 درجة مئوية في جو الحاضنة متغير لمدة 48 ساعة لقياس عدد من التفاعل CFUs البكتيرية.
- لتعداد العدد الكلي للبكتيريا الغازية، إضافة 400 ميكرولتر من DMEM خلية ثقافة المتوسط تحتوي على 150 ميكروغرام / مل جنتاميسين إلى IECS واحتضان لمدة 2 ساعة في نسيج الثقافة حاضنة قياسية بلغت 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 و 95٪ الهواء لقتل البكتيريا خارج الخلية،ثم اتبع أما الخطوة 7.4 أعلاه.
8. تنظيف VDC بعد Coculture
غسل VDC مع الماء المعقم ومخزن للجولة المقبلة من التجارب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تجارب Coculturing يؤديها مع C. وقد أثبتت الصائمية البرية من نوع السلالة وIECS في نموذج VDC مع ظروف microaerobic في المقصورة القمي زيادة في عدد من التفاعل (ما يقرب من 10 أضعاف) وبين الخلايا (ما يقرب من 100 أضعاف) البكتيريا مقارنة مع الظروف الثقافة الهوائية في وقت واحد تعتمد الطريقة 1. وكانت هذه الملاحظة استنساخه باستخدام اثنين C. مختلفة الصائمية السلالات البرية من نوع (11168H و81-176) وخطين IEC مختلفة (كاتشو-2 و T84)، وتسليط الضوء على صلاحية النموذج VDC 1.
نتائج ممثل المطروحة هنا هي مقارنة بين عدد من C. الصائمية التفاعل مع أو غزو كاتشو-2 الخلايا بعد 3 أو 6 أو 24 ساعة من coculture تحت أي ظروف خلية ثقافة الفحص القياسية في حاضنة CO 2 (أرقام 2A و B) أو في نموذج VDC مع ظروف microaerobic في كوم قميةالمصدر: إدارة (أرقام 2C و D). البيانات لمدة C. مختلفة يتم عرض الصائمية السلالات البرية من نوع (11168H و81-176). في ظل الظروف ثقافة الخلية القياسية المستخدمة في الغالبية العظمى من الدراسات في الأدب العلمي، وقد لوحظت <10 7 كفو التفاعل مع كاتشو-2 الخلايا (الشكل 2A) مقارنة ~ 10 8 احظ كفو التفاعل مع كاتشو-2 الخلايا في VDC نموذج (الشكل 2C) بعد 24 ساعة. بعد coculture في نموذج VDC، و~ 10 7 كفو داخل الخلايا المعزولة من كاتشو-2 الخلايا (الشكل 2D)، مقارنة فقط ~ 10 5 الخلايا كفو معزولة عن كاتشو-2 الخلايا (الشكل 2B) بعد coculture في ظل ظروف ثقافة الخلية القياسية لل على مدار 24 ساعة.
مقارنة مباشرة بين عدد من C. الصائمية التفاعل مع أو غزو IECS بعد coculture في نموذج VDC مع إما microaerobic أو الهوائية كوندي وقد تم تنفيذ ستعقد في المقصورة قمية سابقا 1. استخدام نتائجها في نموذج VDC زيادة في التفاعل C. الصائمية من ما يقرب من 10 أضعاف، وزيادة في الخلايا C. الصائمية من ما يقرب من 100 أضعاف بعد 24 ساعة coculture 1.
الشكل 1. تزرع التخطيطي للدائرة إنتشار عمودي (VDC) نموذج. الخلايا الظهارية في الأمعاء (IECS) على نفاذية 0.4 ميكرون يدعم مرشح وإدراجه ضمن VDC، وبالتالي خلق قمية وحجرة basolateral. ويمكن بعد هذه المقصورات تعديلها بشكل فردي فيما يتعلق المتوسطة وتكوين الغاز للسماح للcoculturing من IECS مع C. الصائمية مع ظروف microaerobic على السطح القمي من IECS والظروف الهوائية على السطح basolateral من IECS.
FO: المحافظة على together.within الصفحات = "دائما"> 
الشكل 2. ممثل النتائج مقارنة أعداد C. الصائمية 11168H أو 81-176 السلالات البرية من نوع التفاعل مع (A و C) أو الغازية (B و D) كاتشو-2 الخلايا بعد 3 أو 6 أو 24 ساعة عندما تم إجراء فحص coculture تحت أي ظروف ثقافة الخلية القياسية في CO 2 الحاضنة (A و B) أو في نموذج VDC مع ظروف microaerobic في المقصورة القمي (C و D). جميع التجارب تمثل ما لا يقل عن ثلاثة مكررات البيولوجية التي أجريت في مكررة في كل تجربة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
استخدام في طرق زراعة الخلايا في المختبر لدراسة التفاعلات من مسببات الأمراض البكتيرية مع الخلايا المضيفة هي تقنية تستخدم على نطاق واسع في العديد من المختبرات البحثية. ولكن كما يتم تنفيذ مثل هذه المقايسات ثقافة الخلية تحت الظروف الهوائية، وهذه نماذج في المختبر قد لا تمثل بدقة في بيئة الجسم الحي الذي تفاعلات المضيف الممرض تأخذ مكان. وتستخدم على نطاق واسع في نماذج العدوى المختبر غير ملائمة خاصة لدراسة microaerophilic C. الصائمية مقارنة لمسببات الأمراض المعوية الأخرى التي هي اللاهوائيات اختياري. هناك خلط كبير في الأدبيات بشأن آليات غزو IECS الإنسان من قبل C. الصائمية 4،5. نقترح أن السبب آليات الغزو مفهومة حتى سيئة لأن نماذج في المختبر المستخدمة في هذه الدراسات لا تعكس بدقة الوضع في الجسم الحي. باستخدام معيار المقايسات خلية ثقافة، ومستوىمن C. غزو الصائمية من IECS هو دائما منخفضة جدا 9. كان وضع النموذج VDC استجابتنا لمعالجة هذه المسألة.
أنشأنا أن اثنين من خطوط IEC مختلفة لا يمكن الحفاظ عليه في VDC مع ظروف microaerobic على السطح القمي دون أي آثار غير مواتية لوحظ على مدى فترة 24 ساعة 1. بزيادة تعتمد على الوقت من أعداد كل من التفاعل والخلايا C. ولوحظ الصائمية 11168H البرية من نوع البكتيريا سلالة بعد coculturing مع كاتشو-2 IECS في VDC مع ظروف microaerobic في المقصورة القمي 1. وتأكدت هذه الملاحظات مزيد باستخدام خط IEC الثاني (T84) فضلا عن C. الثاني الصائمية السلالة البرية من نوع (81-176)، مما يدل على عدم خط الخلية البكتيرية أو سلالة آثار محددة 1. وأسفرت هذه زيادة مستويات التفاعل البكتيرية والغزو في زيادة، الاستقطاب الاستجابة المناعية الفطرية من IECS 1. HIGتم الكشف عن مستويات لها من IL-8 بعد coculturing microaerobic، مشيرا إلى أن التحدي المتزايد الجرثومي هو يقابله زيادة استجابة المضيف. تم الكشف عن مستويات أعلى من IL-8 في supernatants basolateral مقارنة supernatants القمي، مشيرا إلى أن IL-8 إفراز من قبل IECS يحدث في الغالب من سطح IEC basolateral. IL-8 هو بمثابة جاذب العدلة، التي من شأنها أن تكون ذات فائدة محدودة في لمعة الأمعاء. يوضح هذه البيانات أن الإعداد لمدة المجزئ من VDC يسمح أيضا لتحديد كفاءة استجابة المضيف الاستقطاب.
العديد من الميزات بخصوص الجانب التقني / الإعداد للنموذج VDC يجب النظر قبل تطبيق نموذج لدراسة أي الكائنات المسببة للأمراض. أولا، يجب أن تزرع في IECS لتشكيل أحادي الطبقة غير منفذة على 0.4 الفلاتر الخاصة ميكرون. هذا يستغرق ما بين 14-21 يوما اعتمادا على خط الخلية المستخدمة ويجعل تجارب طويلة إلى حد ما مقارنة الكلاسيكية cocultuالتجارب التي أجريت في حلقة لوحات زراعة الخلايا واستخدام IECS نمت لمدة تتراوح بين 1-7 أيام. من ناحية أخرى، إلا بعد هذه الفترة الطويلة من النمو وقد أظهرت IECS لتشكيل أحادي الطبقة المستقطبة بشكل كامل. هذه الطبقات الوحيدة الاستقطاب تحاكي الوضع في الجسم الحي في ظهارة الأمعاء الإنسان أكثر من ذلك بكثير عن كثب من خطوط nonpolarized، nonconfluent IEC المستخدمة في بعض الدراسات وعلى هذا النحو توفير ميزة أخرى من طراز VDC. ثانيا، خاصة 0.4 ميكرون مرشحات بشكل ملحوظ أكثر تكلفة من ال 24 جيدا لوحة الثقافة الخلية القياسية. القيد الرئيسي للVDC هو الإنتاجية المنخفضة نسبيا. ويرجع ذلك أساسا إلى توافر VDC الدوائر والإعداد التي تتطلب مشعب الغاز هذا. أرقام فقط منخفضة نسبيا من موازية مكررات لا يمكن أن يؤديها في وقت واحد، وعلى النقيض من أسلوب زراعة الخلايا الكلاسيكية. وبالتالي فإن نموذج VDC هو أقل ملاءمة للتجارب الفرز على نطاق واسع أو التجارب التي تتطلب عددا كبيرا من طبق الاصلقسم التدريب والامتحانات. وثمة عامل آخر للنظر هو أن تأثير الجاذبية على أداء المقايسات coculture في نموذج VDC يعني أن أكثر من البكتيريا الوقت سوف تبدأ تجميع في الجزء السفلي من المقصورة القمي مما أدى إلى انخفاض فرصة للتفاعل مع أحادي الطبقة IEC. ومع ذلك باستخدام نموذج VDC، لقد أظهرنا أن التفاعلات من امتحرك، nonaggregating 11168H rpoN متحولة وخفضت بشكل كبير مقارنة متحركة، تجميع 11168H سلالة من النوع البري بعد 6 ساعة 1. ونحن نعمل حاليا على إدخال تعديلات على نموذج VDC التي من شأنها أن تسمح بعض الخلط في المقصورة قمية التي من شأنها أن تحاكي بشكل وثيق التمعج في لمعة الأمعاء. لذلك، في حين أن نموذج VDC هو أفضل من الكلاسيكية، الهوائية طرق زراعة الخلايا نظرا لمحاكاة أكثر عن كثب الوضع في الجسم الحي، وخاصة بالنسبة للبكتيريا مثل C. الصائمية التي لديها متطلبات صارمة في الغلاف الجوي، ونموذج VDC لا يزال لديه بعض القيود التي يجب أن تؤخذفي الاعتبار عند تصميم التجارب.
البيانات المتوفرة لدينا تدعم النتائج الواردة في التقرير لنموذج VDC مماثلة تستخدم لدراسة الإنسان الممرض المعدة هيليكوباكتر بيلوري، التي أظهرت زيادة التصاق البكتيريا لاستضافة الخلايا، وزيادة توليف عوامل الفوعة الجرثومية فضلا عن زيادة الاستجابة المناعية الفطرية المضيفة عندما H. تم cocultured بيلوري مع الخلايا الظهارية تحت microaerobic مقارنة الظروف الهوائية 11. لأن كلا من H. بيلوري وC. الصائمية تتطلب ظروف microaerobic للنمو، والنتيجة أن الأوضاع microaerobic تعزيز التفاعل بين الكائنات مع الخلايا المضيفة غير المستغرب. ومع ذلك، أظهرت دراسة أخرى باستخدام نظام VDC لتحليل التفاعلات بين اهوائي مخير enterohemorrhagic القولونية مع IECS زيادة مستويات التفاعل البكتيرية اللاهوائية تحت / microaerobic ظروف coculture في المقصورة VDC القمي 10. Tله يشير إلى أن سلوك البكتيريا القادرة على التكاثر في ظل ظروف الأوكسجين في الغلاف الجوي وتغير أيضا عندما cocultured مع IECS تحت الظروف اللاهوائية / microaerobic. وهذا يشير إلى أن هذا النموذج هو نموذج VDC محسنة وذات قيمة لتحليل التفاعلات المضيف الممرض العديد من البكتيريا المسببة للأمراض المختلفة تحت ظروف تشبه أكثر بأمانة الوضع في الجسم الحي في تجويف الأمعاء البشرية.
من منظور نموذج، وقد أثبت هذا النموذج VDC لامتلاك بعض مزايا واضحة على مدى الهوائية في المختبر C. نماذج coculturing الصائمية-IEC. البيئة التي تم إنشاؤها في نموذج VDC يحاكي بشكل وثيق بالبيئة في أمعاء الإنسان أثناء C. عدوى الصائمية، مما يؤدي إلى زيادة كبيرة للغاية في أعداد البكتيريا والتفاعل مع غزو IECS. نموذج VDC في هذا الشكل الحالي يعتبر مثاليا لدراسة التفاعلات بين البكتيريا المعوية مع المعدة أو الأمعاءالخلايا الظهارية، ولكن هناك احتمال لتكييف نموذج VDC لدراسة اللاهوائيات صارمة من عينات البراز أو عن طريق الفم الميكروبيولوجية للعينات، كما مثالين فقط. مبدأ مهم ينبغي دائما أن يكون لهدف لتنفيذ هذه التجارب في ظل ظروف coculture التي تحاكي بشكل وثيق الوضع في الجسم الحي. فإن نموذج VDC يكون أداة هامة لإجراء المزيد من الدراسات من C. يجب الصائمية التفاعلات المضيف الممرض وتكون قابلة للتطبيق لدراسة آليات المسببة للأمراض من العديد من أنواع البكتيريا المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
وأيد دومينيك ميلز من قبل دار بلومزبري كليات دراسية لدرجة الدكتوراة (2007-2010). فإن الكتاب أود أن أشكر كل من أوزان Gundogdu وعبدي علمي لمساعدتهم في تطوير نموذج VDC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
| Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
| O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
| Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
| Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
References
- Mills, D. C., et al. Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment. Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).
- Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465, 355-358 (2010).
- Dorrell, N., Wren, B. W. The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems. Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).
- Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis. Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).
- Hu, L., Kopecko, D. J. Chapter 17. Campylobacter. Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. , ASM Press. 297-313 (2008).
- Everest, P. H., et al. Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli. J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).
- Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures. Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).
- Monteville, M. R., Konkel, M. E. Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface. Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).
- Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms. J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).
- Schuller, S., Phillips, A. D. Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells. Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).
- Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling. J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).
