Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Anticancer Metal Komplekser: Syntese og Cytotoksisitet Evaluering av MTT analysen

Published: November 10, 2013 doi: 10.3791/50767
Automatic Translation
*1, *1, *1, *1, 1
1Institute of Chemistry, The Hebrew University of Jerusalem
* These authors contributed equally

Summary

En fremgangsmåte for syntese av luftfølsomme titan og vanadium anticancermidler er beskrevet, sammen med evalueringen av deres cytotoksiske aktivitet overfor human kreft-cellelinje ved MTT-analysen.

Abstract

Titanium (IV) og vanadium (V)-komplekser er meget potente anticancermidler. En utfordring i deres syntese refererer til deres hydrolytiske ustabilitet, og derfor deres fremstilling bør bli utført under en inert atmosfære. Evaluering av anticancer aktivitet av disse komplekser kan oppnås ved MTT-assay.

Det MTT-analysen er en kolorimetrisk assay levedyktighet basert på enzymatisk reduksjon av MTT til formazan-molekylet når det er utsatt for levedyktige celler. Utfallet av reduksjonen er en fargeendring i MTT molekylet. Absorbans målinger i forhold til en kontroll bestemme prosentandelen av gjenværende levedyktige kreftceller etter deres behandling med varierende konsentrasjoner av en testet forbindelse, som er oversatt til forbindelsen anticancer aktivitet og dets IC50-verdier. MTT-analysen er allment vanlig i cytotoksisitetstester studiene på grunn av sin nøyaktighet, hurtighet, og relativ enkelhet.

Heri vi presendes en detaljert protokoll for syntese av luftfølsomme metallbaserte medikamenter og celleviabilitet målinger, inkludert fremstilling av celleplatene, inkubering av forbindelsene med cellene, levedyktighet målingene ved anvendelse av MTT-analysen, og bestemmelse av IC-50 verdier.

Introduction

Kjemoterapi er fortsatt en av de hovedretter av behandlinger ansatt i klinikken for ulike kreftsykdommer, og dermed enorme mengden av forskning er gjennomført på verdensbasis med sikte på å utvikle nye og forbedrede kreft narkotika. Slike studier stort sett begynner ved den kjemiske nivå, med utforming og fremstilling av forbindelser, etterfulgt av biologisk evaluering av de cytotoksiske egenskaper in vitro. Cell levedyktighet kan bli vurdert av ulike analyser som gir informasjon om cellulær aktivitet 1-2.

Cisplatin er et eksempel på en platina kompleks som er mye brukt som et kjemoterapeutisk stoff, som regnes som en effektiv behandling hovedsakelig for testikkelkreft og eggstokkreft 3-4. Imidlertid dens smale aktivitet rekkevidde og alvorlige bivirkninger utløse studier av andre potente overgangsmetallkomplekser 5-8. Blant annet, titan (IV) og vanadium (V)-komplekser viste lovende resultater med høy aktivitet og redusertetoksisitet 9-16. Ti (IV) komplekser var de første til å gå inn kliniske studier etter cisplatin på grunn av disse egenskapene, men har de mislyktes forsøkene på grunn av formuleringsvansker og hydrolyttisk ustabilitet. Det er derfor et aktuelt behov for å utvikle forbedrede derivater av disse metallkomplekser som kan kombinere høy anticancer aktivitet med vann motstand 15,17-21.

En utfordring ved fremstilling av Ti (IV) og V (V)-komplekser viser til hydrolytisk ustabilitet av forløper-reagensene, og derfor bør den inerte atmosfære opprettholdes. Fremstillingen av Ti (IV) og V (V)-forbindelser er utført under N2 eller Ar forhold i en hanskeboks eller ved hjelp av Schlenk linjeteknikker.

En vanlig metode for evaluering av anti-cancer-aktivitet er basert på MTT (3 - (4,5-dimethylthiazolyl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) assay. Denne analysen er en kolo levedyktighet analysen som ble presentert i 1983 av Mosmann22. Det er meget godt studert og karakterisert, og det anses svært effektiv ved vurdering av effektiviteten av nye cytotoksiske forbindelser på grunn av sin presisjon, hurtighet, og dens evne til å bli anvendt på forskjellige cellelinjer. Denne levedyktighet assay er basert på fargeforandring av MTT-molekylet når det er utsatt for levedyktige celler. Måling av absorbansen, som er proporsjonal med antall levedyktige celler, og sammenlignet med ubehandlede kontroller, muliggjør vurdering av celleveksthemmende egenskapene til den testede forbindelse.

Det MTT kolorimetrisk analyse blir gjennomført i en 96-brønn plate-format 23. Cellene kan kreve preinkubering i brønner før tilsetningen av den testede medikament. Forinkuberingen Tiden kan variere 0-24 timer i henhold til cellelinje egenskaper. Celler blir vanligvis utsatt for medikament for 24 til 96 timer, avhengig av legemiddel-aktivitet. MTT-løsning blir deretter tilsatt til de behandlede celler, der kjefteow MTT er redusert til fiolett formazan av en rekke mitokondrielle og cytosoliske enzymer som er i drift i levedyktige celler (figur 1) 24. Det MTT-molekylet blir ikke redusert av døde celler eller røde blodceller (metabilsk inaktive celler), miltceller (hvile celler) og Con A-stimulerte lymfocytter (aktiverte celler) 22. Etter 3-4 timer med inkubasjon med MTT formazangruppen utfellinger. Dannelsen av formazan begynner etter 0,5 timer med inkubasjon men for optimale resultater er det best å eksponere cellene til MTT i minst 3 timer 22. Følgelig er den voksende medium fjernet og formazan ble oppløst i et organisk oppløsningsmiddel, fortrinnsvis isopropanol, 25, selv om DMSO kan også anvendes 26. Elimineringen av mediet er avgjørende for å oppnå nøyaktige resultater, siden fenolrødt, som er vidt utbredt i vekstmedium, og utfelling av proteiner kan interferere med målingen absorbans 25.. Når formazan-løsning når homogen, absorbansen av oppløsningen måles ved hjelp av en mikroplateleser spektrofotometer. Absorbansen ved 550 nm er direkte proporsjonal med antallet celler i rekke 200-50,000 celler per brønn, og dermed meget små mengder av celler kan bli detektert 22.. Absorbansen indikerer mengden av levedyktige celler som var tilbake etter behandling med medikamentet, og er i forhold til absorbansen for kontrollceller som ikke var utsatt for medikamentet. Analyse av resultater ved riktig programvare gir IC50 (inhibering konsentrasjon, 50%) verdier og deres statistiske feil basert på flere gjentakelser av målingen.

MTT analysen er allment vanlig i cytotoksisitetstester studier for screening nye kreft forbindelser, på grunn av sin nøyaktighet og relativ enkelhet. Imidlertid, ved bruk av MTT-analysen, som er avhengig av enzymatisk reaksjon, må man tenke på at forskjellige enzyminhibitorer kan påvirke reduksjonen av MTT end føre til falske resultater 27. I tillegg vil MTT analysen ikke gi noen opplysninger om den molekylære mekanismen for den cytotoksiske aktiviteten til stoffet to.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

  1. Utarbeidelse av V (V) kompleks (figur 2), 18 oppførsel trinn 01.01 til 01.04 i en hanske-box, hvis en hanske-boksen ikke er tilgjengelig, kan du hoppe til den alternative trinn 2 (02.01-02.06).
    1. Oppløs 0,42 mmol av ligandene H 2 L i tørr THF og tilsett den til en omrørt oppløsning av ekvivalente mengder av VO (O-i Pr) 3 i THF.
    2. Omrør reaksjonsblandingen ved romtemperatur i 15 min, og fjerner de flyktige bestanddeler under vakuum.
    3. Legg kald heksan og fjerne den under vakuum. En mørk fiolett pulver bør oppnådd i et kvantitativt utbytte.
    4. Vei 8 mg av den oppnådde forbindelse i en Eppendorf ampullen. Gå til trinn tre.
  2. Forbered V (V) kompleks ved hjelp av en Schlenck linje.
    1. Oppløs 0,42 mmol av liganden H 2 L i tørr THF i en tørr Schlenk-kolbe med et septum hetten festes til en Schlenk-linjen og anvende alternerende vakuum / inert gass (N 2 eller Ar) miljøer, er det anbefalt å anvende tre such runder og vente 2-5 min på vakuum etapper.
    2. Legg tørr THF via en sprøyte gjennom septum cap.
    3. Legg ekvivalente mengder av VO (O-i Pr) 3 i en THF-løsning, som var blitt fremstilt på lignende måte ved å hekte en passende tørr Schlenk-kolbe til linjen, å anvende en inert omgivelse og tilsette reagensene via en sprøyte fra vanadium-løsning som i liganden.
    4. Omrør reaksjonsblandingen ved romtemperatur i 15 minutter og fjern de flyktige bestanddeler under vakuum, hvis det er et problem av ustabile produkter, utfører Schlenk typen destillasjon av de flyktige stoffene under inert atmosfære; bruke inert gass-strøm for å feste den nødvendige glass som hadde blitt predried .
    5. Legg kald heksan og fjerne den under vakuum. En mørk fiolett pulver bør oppnådd i et kvantitativt utbytte.
    6. Vei 8 mg av den oppnådde forbindelse i en Eppendorf ampullen.
  3. Fremstilling av Ti (IV) kompleks (figur 2), 28
  4. Oppløs 0,35 mmol av liganden H 2 L i tørr THF og tilsett den til en omrørt oppløsning av ekvivalente mengder av Ti (O-i Pr) 4 i THF.
  5. Omrør reaksjonsblandingen ved romtemperatur i 2 timer. Fjern de flyktige bestanddeler under vakuum og ga et gult produkt i et kvantitativt utbytte.
  6. Vei 8 mg av den oppnådde forbindelse i Eppendorf ampullen.
  • Fremstilling av HT-29-celler 96-brønns plate
    1. Kultur HT-29-celler i en 75 cm to kolbe med RPMI-1640-medium som inneholder 1% penicillin / streptomycin antibiotika, 1% L-glutamin og 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C med 5% CO 2 .
    2. Fjern mediet når HT-29 cellene når maksimal confluency (90-100%, hver 3-4 dager uten subkultur). Vask med en mlav trypsin (0,25%) / EDTA (0,05%) løsning og fjerne det.
    3. Tilsett 1 ml av trypsin (0,25%) / EDTA (0,05%)-løsning og inkuberes i 5 min.
    4. Ta av HT-29-celler fra kolben og tilsett 10 ml av mediet til å deaktivere den trypsin-aktivitet. Overfør 5 ml av cellene blandingen til et rør.
    5. Bruk pipette for å overføre noen få dråper av cellene blandingen inn mot kammeret. Telleren kammer omfatter 5 x 5 kvadrater.
    6. Telle celler i fem representative firkanter ved hjelp av et mikroskop: de fire plassene i hjørnene og den som er i midten.
    7. Beregn den beregnede mengden av tilstedeværende celler. Summere celler i de fem representative torg og dele på 20.
    8. Del 0.6 av produktet fra trinn 4.7. Det mottatte nummeret er mengden av celleblandingen som kreves per plate. Denne beregningen viser til en plate som inneholder 0,6 x 10 6-celler (9000 celler per brønn).
    9. Bruk pipette for å overføre mengden av celleblandingen som kreves per psent (som beregnet i pkt. 4.8) og tilsett 13,2 ml av mediet (200 mL per brønn × 66 brønner).
    10. Tilsett blandingen til 96-brønners plate med 11-kanals pipette (200 ul per brønn, 6 linjer, 66 brønner totalt). En brønn av hver linje skal være tomt for blank kontroll.
    11. Inkuber platen ved 37 ° C med 5% CO2 i 24 timer for å tillate cellene å feste seg til platen.
  • Innsetting av forbindelsene
    1. Tilsett 200 ul (eller annet beløp i samsvar med det ønskede konsentrasjonsområde) i tørt THF til 8 mg av hver forbindelse veies som beskrevet i trinn 1,4 (eller 2,6) eller 3,3. Vei 8 mg av liganden H 2 L, også.
    2. Fortynne hver forbindelse løsningen ytterligere ved å legge 60 mL THF i ni forskjellige Eppendorf ampuller.
    3. Forflytning med en pipette 60 pl fra blandingen i avsnitt 5.1 til første Eppendorf ampulle, resuspender og overføre 60 ul til den neste ampulle, og så videre inntil 10 forskjellige konsentrasjoner obtained (inkludert moderblandingen i pkt. 5.1).
    4. Fortynn 20 mL av hver konsentrasjon i THF med 180 ul medium.
    5. Tilbered en kontrolloppløsning med bare THF, 20 pl THF med 180 ul av medium i hver måling.
    6. Tilsett 10 pl av den resulterende løsning (inkludert THF-kontroll), til hver brønn som allerede inneholder 200 ul av den ovennevnte oppløsning av cellene i medium for å gi endelige konsentrasjoner av forbindelsen på opp til 200 mg / L (konsentrasjonsområdet kan forandres i henhold til det sammensatte aktivitet).
    7. Du kan observere en del nedbør på høyeste konsentrasjonen brukt avhengig av sammensatte oppløselighet.
    8. Gjenta hver måling av de sammensatte 3x (3 linjer i platen av den samme forbindelse), hver linje inneholder: celler ble behandlet med forbindelse i 10 forskjellige konsentrasjoner, en brønn som inneholder celler behandlet med oppløsningsmiddel bare for kontroll, og en godt uten celler for blank kontroll.
    9. Inkuber lastet plate for tre dager ved 37 ° C i 5% CO 2 atmosfæren.
  • Cytotoksisitet måling med MTT-analysen
    1. Klargjør MTT-løsning ved å tilsette 1 g av MTT-pulver til en 200 ml løsning av RPMI-1640-medium uten fenolrødt. Denne stamløsningen kan deles i 15 ml rør og lagret i -20 ° C.
    2. Tilsett 20 ul av MTT-løsning til hver brønn ved anvendelse av 11-kanals pipette (bortsett fra i de blanke kontrollbrønner uten cellene fra trinn 4.10), og inkuber platen for ytterligere 3 timer.
    3. Fjern mediet løsning fra hver brønn.
    4. Tilsett 200 ul av isopropanol til hver brønn for å oppløse formazanet. Omrør plate i 0,5 timer inntil homogenitet er oppnådd.
    5. Mål absorbansen ved 550 nm i 200 ul av den ovenfor nevnte oppløsning av en mikroplateleser spektrofotometer.
    6. Gjenta hver måling (som inkluderer tre repetisjoner, se trinn 5.8) på tre forskjellige dager.
    7. Beregn tHan prosentandel av cellelevedyktighet ved å trekke den tomme styre absorbansverdi fra den målte verdi, å dividere resultatet med absorbansen til THF-løsningsmiddel-kontrollverdien, og multiplisere med 100%.
    8. Beregn IC 50-verdier ved hjelp GraphPad Prism programvare (eller tilsvarende).
    9. Den rapporterte IC 50 er gjennomsnittet av alle IC 50 verdier er samlet i minst tre forskjellige dager, og feilverdien er standardavviket.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Kompleksene ble utarbeidet basert på etablerte prosedyrer 18,28 og deres renhet kan bli evaluert av NMR og elementanalyse.

    De mottatt fra MTT-analysen av data blir analysert for å evaluere cytotoksisiteten av forbindelsen 18,21. Først blir subtraksjon av blindkontroll absorbansverdi fra alle andre verdier utføres. For det andre er THF oppløsningsmidlet kontrollverdi satt til 100% levedyktighet, som ingen vekst inhiberende forbindelse ble tilsatt. Alle andre verdier er omdannet til prosent av levedyktigheten i henhold til kontrollen. Konsentrasjonene anvendt, og den relative prosentandel beregnes levedyktighet blir deretter satt inn i GraphPad Prism programvare (eller tilsvarende) for å bestemme IC50-verdier basert på en ikke-lineær regresjon av en variabel helling (fire parameterne)-modellen (fig. 4, tabell 1) 29.

    Målingene skal utføres på en rekkei konsentrasjoner som vil produsere en graf som viser en jevn fordeling Punkt: minst tre punkter på hver platå og tre punkter for å definere skråning (figur 3, graf A). Utilstrekkelige målinger ved høye konsentrasjoner eller lave konsentrasjoner (figur 3, graf B) vil svekke ikke-lineær regresjon tilpasning av kurven som kreves for bestemmelse av IC-50 verdier, og som et resultat redusere nøyaktigheten.

    Relative IC 50-verdier, bestemt ved ikke-lineær regresjon fit 29, svarer til de konsentrasjoner som fører til 50% av cellevekst inhibering mulig av den testede forbindelse, som beregnes som midtpunktet mellom den maksimale og minimale cellenes levedyktighet måles (ikke nødvendigvis 100% og 0%, henholdsvis, se figur 3, graf C, a). For eksempel, hvis en forbindelse som inhiberer bare 60% av celleveksten i forhold til kontrollen (0% og ved lav konsentrasjons), dens relative IC50 er den konsentrasjon som fører til 30% inhibering i forhold til kontrollgruppen. De feilverdier bør reflektere avvik av resultatene oppnådd for forskjellige gjentagelser fra den gjennomsnittlige IC50 verdi som er rapportert, tatt som kjønnssykdommer. I tillegg bør maksimal cellevekst-hemming (%) verdier rapporteres, som beregnet ved å subtrahere fra 100% av minimalt levedyktighet målt.

    En alternativ analyse kan omfatte bestemmelse av absolutte IC 50 verdier. Disse tilsvarer de konsentrasjoner som fører til 50% cellevekst inhibering i forhold til kontrollgruppen på 100%, uavhengig av den maksimale og minimale cellenes levedyktighet målt. Slike verdier kan også være avledet fra en ikke-lineær regresjonsmodell. Ettersom disse verdiene er absolutt, er valgfritt å rapportere de maksimale cellevekst inhibisjonsverdiene. Som vist i figur 3, graf C, kan en forbindelse har en relativt lav aktivitet i forhold til maksimal celle growth hemming egenskaper (kurve a), og fremdeles oppviser en relativ IC50-verdi som er lavere enn ikke bare den absolutte en, men også enn den til en forbindelse som når frem til nær 100% vekstinhibering (kurve b). Det er således svært verdifull for å frem kurven sammen med de rapporterte IC 50-verdier av noen art.

    Ved inspeksjon av resultatene av forsøkene beskrevet i protokollen (figur 4, tabell 1), er det klart at cisplatin og komplekser LTi (O i Pr) 2 og VO (O-i Pr) er meget aktive. Det er også merkes at jo nærmere den maksimale hemming verdien av en gitt forbindelse er 100%, er nærmere relativ IC50-verdien er den absolutte en. Ved sammenligning av de IC-50-verdier mellom de forskjellige forbindelser, har Ti (IV)-kompleks høyeste cytotoksisitet og dets IC 50 verdier er lavere enn for cisplatin og V (V)-kompleks. Men den free ligand utstillinger betydelig redusert aktivitet, siden etter tilsetning av liganden ved forskjellige konsentrasjoner, gjør cellelevedyktighet ikke slippe så betydelig som den gjør for sine komplekser. Dette sikrer at det høye anticancer aktivitet av kompleksene er avhengig av metall-sentre. Siden den frie ligand når knapt 50% celleveksthemming, en absolutt IC 50 verdien kan ikke være nøyaktig avledet. Faktisk er en relativ verdi også kunne ikke ha blitt tilstrekkelig beregnes av programmet på grunn av den mindre aktivitet, og tilsvarende høy feilverdier. Likevel er det klart at selv om en slektning IC 50 verdi kan ha blitt avledet for H 2 L, det ville ikke ha reflektert en merkbar aktivitet, og dermed gjengi rapporten fra maksimal hemming verdi sammen med relative IC 50 verdier (og skildringen av kurven) viktig.

    Relativ IC 50 (mikrometer) Absolute IC 50 (mikrometer) Maksimal inhibering (%)
    LVO (O i Pr) 13 ± 3 19 ± 8 81%
    LTi (O jeg Pr) 2 3 ± 1 5 ± 3 87%
    H 2 L - - 47%
    Cisplatin 14 ± 5 13 ± 6 91%

    Tabell 1. Cytotoksisitet Resultatene for de testede forbindelser: Relativ og absolutt IC50 (uM) og maksimale celleveksthemming verdiene mot HT-29-celler etter en inkubasjonstid på tre dager med V (V)-kompleks LVO (O i Pr), Ti (IV ) kompleks LTi (O i Pr) 2, den frie ligand H 2 L og cisplatin, 18,21 IC 50 verdier er gitt som gjennomsnitt på l øst tre ganger tre repetisjoner med feilverdier som de kjønnssykdommer.

    Figur 1
    Figur 1. Reduksjonen av MTT av mitokondrie og cytosoliske enzymer for å formazanforbindelse. Klikk her for å se større figur .

    Fig. 2
    Figur 2. Utarbeidelse av V (V) og Ti (IV) komplekser 18,28. Klikk her for å se større figur .

    t "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 3
    Figur 3. Eksempler på resultater fra celle levedyktighet målinger. Klikk her for å se større figur .

    Figur 4
    Figur 4. Doseavhengig cytotoksisitet kurver for de testede forbindelsene: Avhengighet av HT-29 cellelevedyktighet på administrert konsentrasjonen av V (V)-kompleks LVO (O i Pr) (blå), Ti (IV)-kompleks LTi (O i Pr) 2 ( red), gratis ligand H 2 L (svart) og cisplatin (grønn), etter en inkubasjonstid på tre dager, som obtained fra minst tre ganger tre repetisjoner som reflekteres av feilverdier 18,21.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Fremgangsmåten som beskrives i dette manuskriptet kombinerer kjemisk syntese med biologisk cellelevedyktighet assay. Som med eventuelle biologiske metoder som gjelder levedyktige celler, er det viktig å arbeide i en laminær hette, og opprettholde sterile forhold, herunder bruk av sterile organiske løsemidler. I tillegg bør fremstilling og lagring av hydrolytisk ustabil metallbaserte stoffer utføres under inerte betingelser, hvor hanskeboks eller Schlenk linjeteknikker bør utnyttes.

    Utvalget av teknikken til å arbeide under inert miljø er stort sett avhengig av tilgjengeligheten av en hanskerommet. Hvis man er tilgjengelig, alle syntesene som krever rom temperaturforhold er svært praktisk for å utføre disse. Synteser som krever oppvarming blir normalt tatt ut av boksen i en Schlenk-kolbe og er festet til Schlenk-linjen. Hvor en hanske-box ikke er tilgjengelig, kan alle manipulasjoner utføres med nøye utvalgte glass på en Schlenk linje, under bruk av vakuum / inert gass (N2 eller Ar)-manipulasjoner for å opprettholde tørre atmosfære.

    I cytotoksisitet evalueringsprosessen, er det nødvendig å undersøke forekomsten av cellene gjennom hele forsøket. Før begynnelsen av forsøket, bør vekstmediet av sunne adherente celler være klart. En forurenset kultur vil dukke grumset. Også, etter inkubering av cellene med trypsin-EDTA, bør cellene løsner fra kolben og nedsenkes i mediet. Hvis de fleste av cellene forblir festet til kolben, kolben bør bli ytterligere inkubert i flere minutter.

    Lengden av en slik måling er fem dager. Vi tillater en dag for de adherente celler til å feste og akklimatisere seg til celleplaten og tre dager etter inkubering av cellene med de testede medikamenter for å muliggjøre at cellene til å gå videre til apoptose. En ytterligere dag er nødvendig for inkubasjon med MTT. Hele denne measurement bør gjentas minst to ganger på forskjellige dager med start fra forskjellige cellekulturer, for at målingene skal være uavhengige.

    Teknikken som er beskrevet her er brukt på adherente celletyper. For å bruke denne metoden på ikke-festede celletyper bør gjøres flere justeringer. Det er ikke lenger nødvendig å vie en dag for at cellene skal feste og akklimatisere seg til celleplaten og dermed fremstillingen av platen og tillegget av de testede legemidler kan oppnås på den samme dag. I tillegg, i det siste trinnet av målingen, like etter inkubering av cellene med MTT, bør oppløsningen sentrifugeres før fjerning av mediet og tilsetning av isopropanol.

    Det er også mulig å erstatte bruken av MTT som markør av vitale celler med en alternativ analyse for cellevekst inhibering, hvor inkubasjonstiden av cellene med markøren er kortere enn tlue med MTT 30. En annen faktor å vurdere når du velger markøren er mulig virkningsmekanisme av de testede medikamentet 27. Det MTT-analysen gir informasjon om mitokondrier metabolsk aktivitet, og siden den er avhengig av enzymatiske reaksjoner, kan den påvirkes av enzyminhibitorer.

    Kombinasjonen av medikament preparat med vurdering av dets cytotoksisitet ved MTT-analysen utgjør en effektiv metode for utvikling av nye metallbaserte cytotoksiske medikamenter. Likevel, denne metoden ikke gi noen informasjon om celledød mekanisme, den fasen i cellesyklusen som er påvirket av narkotika og dens mulige biologiske mål. For disse formålene flere metoder, som for eksempel Propidium jodid (PI) Opptak analysen og Cell Cycle Analysis bør utføres 31.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

    Acknowledgments

    Finansieringen ble mottatt fra European Research Council under EU sjuende rammeprogram (FP7/2007-2013) / ERC Grant avtalen ingen [239603]

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagent/Material
    Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries 04-007-1A
    Hexane AR Gadot 830122313 Dried using a solvent drying system
    HT-29 cell line ATCC HTB-38
    Isopropanol AR Gadot 830111370
    L-glutamine Biological Industries 03-020-1B
    MTT Sigma-Aldrich M5655-1G
    Penicillin/streptomycin antibiotics Biological Industries 03-031-1B
    RPMI-1640 with phenol red with L-glutamine Sigma-Aldrich R8758
    RPMI without phenol red Biological Industries 01-103-1A
    Tetrahydrofuran (THF) AR Gadot 830156391 dried using a solvent drying system
    Ti(OiPr)4 Sigma-Aldrich 205273-500ML moisture sensitive
    Trypsin/EDTA Biological Industries 03-052-1B
    VO(OiPr)3 Sigma-Aldrich 404926-10G moisture sensitive
    Equipment
    12-channel pipette 30-300 μl Thermo Scientific
    12-channel pipette 5-50 μl Finnpipette
    75 cm2 flask NUNC 156472
    96-well plate with lid (flat bottom) NUNC 167008
    CO2 Incubator Binder APT.line C150
    Counter chamber Marienfeld-Superior 650030
    Eppendorf vial KARTELL
    Glove box M. Braun
    Laminar flow hood ADS LAMINAIRE OPTIMALE 12
    Microplate reader spectrophotometer Bio-Tek El-800
    Microscope Nikon Eclipse TS100
    Pipette 20-200 μl Finnpipette
    Pipette 5-50 μl Finnpipette

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development. Expert Opinion on Drug Discovery. 3, 655-669 (2008).
    2. Hatok, J., et al. In vitro assays for the evaluation of drug resistance in tumor cells. Clinical and Experimental Medicine. 9, 1-7 (2009).
    3. Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).
    4. Muggia, F. Platinum compounds 30 years after the introduction of cisplatin: Implications for the treatment of ovarian cancer. Gynecologic Oncology. 112, 275-281 (2009).
    5. Bruijnincx, P. C., Sadler, P. J. New trends for metal complexes with anticancer activity. Current Opinion in Chemical Biology. 12, 197-206 (2008).
    6. Ott, I., Gust, R. Non platinum metal complexes as anti-cancer drugs. Archiv der Pharmazie (Weinheim. 340, 117-126 (2007).
    7. Desoize, B. Metals and metal compounds in cancer treatment. Anticancer Research. 24, 1529-1544 (2004).
    8. Jakupec, M. A., Galanski, M., Arion, V. B., Hartinger, C. G., Keppler, B. K. Antitumour metal compounds: more than theme and variations. Dalton Transactions. , 183-194 (2008).
    9. Meléndez, E. Titanium complexes in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 309-315 (2002).
    10. Evangelou, A. M. Vanadium in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 249-265 (2002).
    11. Djordjevic, C. Antitumor activity of vanadium compounds. Metal ions in biological systems. 31, 595-616 (1995).
    12. Caruso, F., Rossi, M., Pettinari, C. Anticancer titanium agents. Expert Opinion on Therapeutic Patents. 11, 969-979 (2001).
    13. Caruso, F., Rossi, M. Antitumor titanium compounds. Mini-Review in Medicinal Chemistry. 4, 49-60 (2004).
    14. Kostova, I. Titanium and vanadium complexes as anticancer agents. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 9, 827-842 (2009).
    15. Tshuva, E. Y., Ashenhurst, J. A. Cytotoxic Titanium(IV) Complexes: Renaissance. European Journal of Inorganic Chemistry. , 2203-2218 (2009).
    16. Buettner, K. M., Valentine, A. M. Bioinorganic Chemistry of Titanium. Chemical Reviews. 112, 1863-1881 (2012).
    17. Meker, S., Margulis-Goshen, K., Weiss, E., Magdassi, S., Tshuva, E. Y. High antitumor activity of highly resistant salan-titanium(IV) complexes in nanoparticles: an identified active species. Angewandte Chemie International Edition in English. 51, 10515-10517 (2012).
    18. Reytman, L., Braitbard, O., Tshuva, E. Y. Highly cytotoxic vanadium(V) complexes of salan ligands; insights on the role of hydrolysis. Dalton Transactions. 41, 5241-5247 (2012).
    19. Tzubery, A., Tshuva, E. Y. Cytotoxicity and Hydrolysis of trans-Ti(IV) Complexes of Salen Ligands: Structure-Activity Relationship Studies. Inorganic Chemistry. 51, 1796-1804 (2012).
    20. Tshuva, E. Y., Peri, D. Modern cytotoxic titanium(IV) complexes; Insights on the enigmatic involvement of hydrolysis. Coordination Chemistry Reviews. 253, 2098-2115 (2009).
    21. Shavit, M., Peri, D., Manna, C. M., Alexander, J. S., Tshuva, E. Y. Active cytotoxic reagents based on non-metallocene non-diketonato well-defined C-2-symmetrical titanium complexes of tetradentate bis(phenolato) ligands. Journal of the American Chemical Society. 129, 12098-12099 (2007).
    22. Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival - Application to Proliferation and Cyto-Toxicity Assays. Journal of Immunological Methods. 65 (83), 55-63 (1983).
    23. Ahmadian, S., Barar, J., Saei, A. A., Fakhree, M. A. A., Omidi, Y. Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay. Journal of Visualized Experiments. (26), e1191 (2009).
    24. Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology in Vitro. 15, 257-259 (2001).
    25. Denizot, F., Lang, R. Rapid Colorimetric Assay for Cell-Growth and Survival - Modifications to the Tetrazolium Dye Procedure Giving Improved Sensitivity and Reliability. Journal of Immunological Methods. 89, 271-277 (1986).
    26. Alley, M. C., et al. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Research. 48, 589-601 (1988).
    27. Weyermann, J., Lochmann, D., Zimmer, A. A practical note on the use of cytotoxicity assays. International Journal of Pharmaceutics. 288, 369-376 (2005).
    28. Chmura, A. J., et al. Group 4 complexes with aminebisphenolate ligands and their application for the ring opening polymerization of cyclic esters. Macromolecules. 39, 7250-7257 (2006).
    29. Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10, 128-134 (2011).
    30. Yung, W. K. A. In vitro Chemosensitivity Testing and its Clinical-Application in Human Gliomas. Neurosurgical Review. 12, 197-203 (1989).
    31. McCarthy, N. J., Evan, G. I. Current Topics in Developmental Biology. 36, 259-278 (1997).

    Tags

    Medisin uorganiske kjemikalier Therapeutics metaller og metalliske materialer kreft narkotika celle levedyktighet cisplatin metall kompleks cytotoksisitet HT-29 metall-baserte legemidler MTT analysen titan (IV) vanadium (V)
    Anticancer Metal Komplekser: Syntese og Cytotoksisitet Evaluering av MTT analysen
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Ganot, N., Meker, S., Reytman, L.,… More

    Ganot, N., Meker, S., Reytman, L., Tzubery, A., Tshuva, E. Y. Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay. J. Vis. Exp. (81), e50767, doi:10.3791/50767 (2013).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter