Summary
Konfokal scanning mikroskopi anvendes til billeddannelse enkelt mitokondrie begivenheder i perfunderet hjerte eller skeletmuskulatur i levende dyr. Real-time overvågning af enkelte mitokondrie processer såsom superoxid blinker og membran potentielle udsving muliggør evaluering af mitokondriefunktionen i en fysiologisk relevant kontekst og under patologiske forstyrrelser.
Abstract
Mitokondrier er en kritisk intracellulær organel er ansvarlig for energiproduktion og intracellulær signalering i eukaryote systemer. Mitokondriel dysfunktion ofte ledsager og bidrager til sygdom hos mennesker. Størstedelen af de fremgangsmåder, der er blevet udviklet til at vurdere mitokondriefunktionen og dysfunktion er baseret på in vitro-eller ex vivo målinger. Resultater fra disse forsøg har begrænset evne til bestemmelse af mitochondrial funktion in vivo. Her beskriver vi en ny tilgang, der udnytter konfokal scanning mikroskopi til billeddannelse af intakte væv i levende aminaler, som tillader vurdering af enkelt mitokondriefunktion i en real-time måde in vivo. Først, vi frembringelsen af transgene mus, der udtrykker mitokondrier målrettet superoxid indikator cirkulært permuteret gult fluorescerende protein (mt-cpYFP). Bedøvet mt-cpYFP mus er fastsat på et skræddersyet bordadapter og time-lapse billeder er taget fra de udsatte skelet muskler i bagbenet. Musen er efterfølgende aflivet, og hjertet er sat op til Langendorff perfusion med fysiologiske løsninger ved 37 ° C. Den perfunderet hjerte er placeret i en særlig afdeling på konfokal mikroskop scenen og blide tryk påføres immobilisere hjertet og undertrykke hjerteslag induceret bevægelsesartefakt. Superoxid blinker opdages af real-time 2D konfokal billedbehandling med en hyppighed på ét billede pr sekund. Perfusionsopløsningen kan modificeres til at indeholde forskellige åndedræt substrater eller andre fluorescerende indikatorer. Perfusion kan også justeres til at producere sygdomsmodeller såsom iskæmi og reperfusion. Denne teknik er en unik fremgangsmåde til at bestemme funktionen af en enkelt mitokondrie i intakte væv og in vivo.
Introduction
Mitokondrier spiller en central rolle i celle bioenergetik, frie radikaler signalering, redox homeostase, ion regulering, og celle skæbne beslutsomhed 1,2. Mitokondrier dysfunktion ofte ledsager og ligger til grund for patogenese af sygdomme 3-6. Især i musklen systemer såsom hjerte-og skeletmuskulatur, mitokondriel respiration giver hovedparten af ATP til at understøtte rettidig regulering af intracellulær calcium og robust styrke udvikling 7,8. Disse muskler besidder et stort antal af mitokondrier, der ofte optager op til 20-40% af det totale cellevolumen og "faste" imellem myofilaments 2.
Trods talrige undersøgelser, vores forståelse af mitokondriefunktionen regulering, især in vivo og under fysiologisk relevante tilstande, er begrænset. En af grundene er, at flertallet af de metoder, der er udviklet for at vurdere mitokondriefunktionen stole på i vi troo eller ex vivo metoder, såsom overvågning iltforbrug af isolerede mitokondrier suppleret med kunstige substrater, og den indirekte bestemmelse af mitokondrie funktion gennem morfologi (fx elektronmikroskopi), enzym-aktivitet (fx aconitase aktivitet), eller intracellulære ATP-niveauet 9-11 .
For nylig har små molekyle fluorescerende indikatorer med relativ mitokondrie berigelse blevet anvendt til at give et glimt af mitokondrie-signaler, herunder membran potentiale, calcium og reaktive ilt arter (ROS), i intakte celler 11-13. Desuden flere grønne fluorescerende protein (GFP) baseret redox og er blevet udviklet ROS indikatorer for at opnå mere specifik evaluering af opdelte intracellulære redox eller ROS signalerer 14-16. Blandt dette, har vi udviklet en genetisk kodet superoxid indikator, den cirkulære Permuted gult fluorescerende protein og targeted det i mitokondrier (mt-cpYFP) 17. mt-cpYFP kan blive anslået ved 405 eller 488 nm med både emission topper ved 515 nm. Emissionen ved 488 nm excitation er specielt lydhør over for superoxid som det fremgår af tidligere in vitro og in vivo kalibreringer 17,18. Emissionen ved 405 nm excitation bruges som intern kontrol (se figur 1 Ref 17 for detaljerede oplysninger om emissions-og excitationsspektre af mt-cpYFP under forskellige betingelser). Med time-lapse konfokal billedbehandling, registrerer denne indikator sprængfyldt superoxidproduktion begivenheder, opkaldt superoxid blinker, i enkelte mitokondrier intakte celler. Superoxid flash fungerer som en sammensat funktion af mitokondrie respiration, ledsagende forbigående mitochondriemembran depolarisering og ROS produktion 17-20. For nylig har vi skabt de pan-væv mt-cpYFP transgene mus ved hjælp af pUC-CAGGS-mt-cpYFP vektor 17,19 om C57/BL6 baggrund og verificeret de stærke udtrykdelse af denne indikator i hjertet, skeletmuskulatur og andre væv (figur 2). Den transgene mus vil være tilgængelige for interesserede akademiske efterforskere efter anmodning og MTA godkendt af University of Washington.
I denne undersøgelse, vi beskriver i situ billeddannelse af superoxid blinker i Langendorff perfunderet hjerte såvel som in vivo billeddannelse af flash begivenheder i skelet muskler i bedøvede mt-cpYFP transgene mus 17,19. Denne teknologi giver tidstro overvågning af enkelte mitokondrie ROS produktions begivenheder i et fysiologisk relevant tilstand eller in vivo 21,22. Det er også muligt at bruge systemet til at overvåge andre enkelt mitokondrie parametre såsom membran potentiale og calcium med passende fluorescerende indikatorer. Endvidere samtidig eller parallel evaluering af mitokondriefunktion med intracellulære hændelser (f.eks calcium transienter) eller hjerte funktion (f.eks. Uddrivningsfraktion) kan opnås. Patologiske forstyrrelser, såsom iskæmi og reperfusion, kan anvendes på den perfunderede hjerte til at vurdere virkningen af stress på enkelt mitokondrie funktion i den intakte myokardiet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Eksperiment Forberedelse
- Forbered isotonisk balanceret saltopløsning (50 ml) indeholdende: 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 2,5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 og 10 mM HEPES (pH 7,2) til in vivo skeletmuskulatur billeddannelse.
- Klargør 1 L af Krebs-Henseleit-puffer (KHB) indeholdende: 118 mM NaCl, 5,3 mM KCI, 1,2 mM MgSO4, 0,5 mM EDTA og 25 mM NaHCO3.
- Bubble den KHB med gas indeholdende 95% O2 / 5% CO2 i 10-15 minutter før tilsætning af 2 mM CaCl2. Tilføj metaboliske substrater (fx 10 mM glucose og 0,5 mM pyruvat).
- Forbered kirurgiske instrumenter ved at sterilisere klemmen saks og pincet i 70% ethanol og derefter skylle i steriliseret Hedeselskabet 2 O.
- Tænd for hjerte perfusionssystem, justere temperaturen på vandbadet og cirkulationspumpe, indstille hastigheden for peristaltisk pumpe til 6 ml / min.
- Bubble den KHB med 95% O 2/ 5% CO 2-gas, og overvåge strømningshastighed og temperatur (37 ° C, ved en fiberoptisk temperaturføler) i spildevand. Systemet har brug for omkring 20 min for gas og temperatur ligevægt.
2. Konfokal Imaging skeletmuskulatur in vivo
- Bedøver mus med pentobarbital (80 mg / kg, ip). Dyret vil nå kirurgisk anæstesi (intet svar til tå knivspids) inden for 10-15 min og forbliver i denne status for 1-1,5 timer, tilstrækkelig til in vivo billeddannelse af skeletmuskulatur.
- Fjern hår på en af baglemmer og sterilisere huden med 70% ethanol.
- Lave et snit på huden langs den ydre side af benet for at blotlægge gastrocnemius muskler.
- Afhente epimysium forsigtigt med en skarp pincet og lave et snit igennem det med en saks. Yderligere dissekere at fjerne epimysium og udsætte muskelfibre under den.
- Til in vivo-fyldning af TMRM i skeletsystemetmuskel, omfatter TMRM (500 nM) i isotonisk balanceret saltopløsning at fordybe muskel i 30 min og derefter vaske ud af indikator-fri løsning.
- Sæt musen på siden på det konfokale mikroskop (Zeiss LSM 510) fase og fastgøring af bageste lemmer i en position, at den udsatte skeletmuskulatur vender mod dækglasset, der danner bunden af kammeret. Dækglasset er i mellem muskelvæv og den omvendte målsætning (40X olie).
- Tryk på benet forsigtigt ned for at tæt kontakt mellem vævet og dækglasset. Fordyb de udsatte muskler i isotonisk balanceret saltopløsning.
- Optag todimensionale (2D, XY) konfokal billeder med en prøveudtagning på et sekund per ramme. Intensiteten af hver pixel digitaliseres ved 8-bit dybde. Normalt en seriel scanning indeholder 100 frames.
- Saml sekventielle billeder ved første spændende ved 405 nm og indsamling på> 505 nm derefter ved 488 nm, mens indsamling på> 505 nm for dobbelt bølgelængde excitation billeddannelse af mt-cpYFP. Brug sekventiel excitation ved 405, 488 og 543 nm, og indsamle emission ved 505-545, 505-545 og> 560 nm, henholdsvis for tredobbelt bølgelængdeexcitering billeddannelse af mt-cpYFP og TMRM.
3. Konfokal Imaging af perfusioneres Mouse Heart
- Umiddelbart efter in vivo billeddannelse af skelet muskler, injicere mus med 200 enheder heparin (ip). Ti minutter senere aflive musen ved torakotomi og hurtigt at fjerne hjerte med lunger og thymus knyttet til den.
- Hurtigt fjerne lungen i iskold buffer. Identificere de kamre af thymus og forsigtigt skræl tilbage for at blotlægge opstigende aorta.
- Fjern thymus og isolere aorta ved omhyggeligt at fjerne eventuelle omgivende væv.
- Lave et snit i den øvre ende af opstigende aorta før den første gren af aortabuen.
- Hold aortavæggen forsigtigt med to mikro suturering pincet til at udsætte lumen og anbring forsigtigt aorta på cannula (PE50 rør). Aorta holdes på plads med en mikro fartøj klemme mens suturer hurtigt bliver bundet rundt om aorta.
- Fjern klemmen, omhyggeligt kontrollere kanylen med en pincet til at sørge for, at spidsen af kanylen er over aortaroden. Ekstra bånd er tilføjet som er nødvendigt for at holde hjertet på plads.
- Tænd den peristaltiske pumpe og perfundere hjertet ved 1 ml / min. Hjertet vil genoptage slå på perfusion.
- Justere placeringen af perfusionssystemet og sætte hjertet på mikroskopet scenen. Etapen har en adapter, der muliggør opvarmning af kammeret, der holder hjertet.
- Tilsættes 1 ml KHB perfusionsopløsning i kammeret til delvist at oversvømme hjertet. Overvåge temperatur i kammeret ved 37 ° C. Fjern spildevand fra kammeret ved hjælp af en peristaltisk pumpe.
- Øge hastigheden på peristaltisk pumpe til gradvist at give tilstrækkelig strømning (cirka 2 ml / min) til hjertet.
- Efter 10 minutter af stabilisering, perfuse hjertrt med 10 pM blebbistatin og 100-500 nM TMRM. Hjerterytme vil bremse efter 10 min.
- Tryk forsigtigt på hjertet for at sikre tæt kontakt af hjertet med dækglasset i bunden af kammeret og til yderligere at undertrykke hjerteslag.
- Følg samme procedure for konfokal billeddannelse af intakt myokardiet som beskrevet i trin 2.8 ovenfor. Justér forsigtigt brændplanet at afsløre det klarest mulige billede.
4.. Image Processing og Data Analysis
- Brug værktøjer, som "Physiological Analysis" modul i konfokal software til at analysere en enkelt mitokondrie blinker og membran mulige ændringer. Dette modul indgår ofte i billedet erhverve software konfokal system, og giver mulighed for bestemmelse af visse områder i billedet, samt produktion af fluorescens intensitet med tiden etiketter.
- Åbn databasen og derefter den serielle 2D-billede fil, der skal analyseres.
- Klik på "Regionof Interest (ROI) betyder "at skifte til" gennemsnit af ROIs "mode. Klik på" Region of Interest (ROI) betyder "at skifte til" betyde af ROIs "mode.
- Sluk for visning af andre kanaler undtagen kanal cpYFP 488 nm til valg blinker.
- Zoom ind på billedet og manuelt flytte skyderen til at spille de serielle 2D-billeder.
- Identificer enkelt mitokondrie superoxid blinker ved at lokalisere det sted, hvor fluorescerende signal stiger forbigående. Brug det rette værktøj ROI at markere blinker. Sporet viser tidsafhængige fluorescens ændring af hver ROI vil dukke op ved siden af billedet.
- Når du har valgt alle de blinker, tænde for visning af andre kanaler. Vælg et ROI på billedet uden for cellen for baggrunden signal subtraktion. Output den gennemsnitlige fluorescens for hver ROI sammen med tidsangivelser.
- Registrere antallet af blink i hver af seriel scanning billedfilen sammen med scanningen tid og arealcellen. Brug Excel til at beregne flash frekvens som antallet af blink pr 100 sec / 1,000 mM 2 celle område.
- Brug et specialudviklet program skrevet i Interactive Data Language (IDL, ResearchSystems) til at beregne parametrene for hver flash (amplitude, tid til at toppe og forfald tid). IDL software er kommercielt tilgængelige og den brugerdefinerede udviklede program til flash parameter analyse kan fås fra forfatteren efter anmodning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ifølge denne protokol, kan in vivo billeddannelse af enlige mitokondrie begivenheder ske i skelet muskler i bedøvede mus efterfulgt af in situ billeddannelse i perfunderet hjerte (Figur 1). Den optimale indstilling af de billeddannende betingelser vil sikre klare billeder af de intakte muskelvæv og med enkelt mitokondrier opløsning (Figur 2). TMRM bruges ofte til at kontrollere placeringen af mt-cpYFP og skal vise et komplet overlappende mønster med mt-cpYFP signal (figur 2). TMRM er en kommercielt tilgængelig indikator for mitochondrial membranpotentialet måling i intakte celler 23. Dens spektre adskiller sig fra cpYFP. Endvidere ved hjælp af den sekventielle excitation metode, emissions-signaler TMRM og mt-cpYFP vil ikke forstyrre hinanden 17. Repræsentative billeder, der vises i Figur 3 viser, at enkelt mitokondrie superoxid flash accompanied af membrandepolarisering kan identificeres i de serielle 2D scanning af billeder med en forbigående fluorescens stigning over baggrundssignaler i både skelet muskelvæv og myokardiet (Figur 3). Udover høj opløsning, er tilstrækkelig fluorescensintensitet også påkrævet. Dette kan opnås ved at modulere laseren intensitet og forstærkningen i opsamlings-kanaler. I almindelighed er den basale fluorescenssignal fra cellen fastsat til en tredjedel til en fjerdedel af den maksimale intensitet af kanalen. Eftersom ekspressionsniveauet af mt-cpYFP og lastning af TMRM kan variere blandt dyr, bør finjustering af de billeddannende betingelser gøres for hvert forsøg. Både fysiologiske og patologiske forstyrrelser, såsom metaboliske substrater 17,19, elektrisk stimulering (figur 4) 20, iskæmisk reperfusion 17, er blevet brugt til at vise, at superoxid flash aktivitet reagerer på ændringer i cellulære metaboliske status. 
Figur 1. Skematisk illustration af konfokal billeddannelse af skelet muskler og Langendorff perfunderet hjerte. De transgene mus udtrykker mt-cpYFP er bedøvet, og skeletmuskulatur på én af de bagbensknogler udsættes for konfokal billeddannelse. Hjertet derefter perfunderet i Langendorff tilstand og konfokal billede gennemføres. Billedbehandling og dataanalyse anvendt konfokal software og specialudviklet program.
Figur 2. Konfokal billeddannelse af skelet muskelfibre in vivo og myokardiet i perfunderet hjerte. A. Repræsentative billeder, der viser skeletmuskelforandringer non-transgene (NTG) og mt-cpYFP transgene (mt-cpYFP) mus fyldt med mitochondriemembran mulig indikator, TMRM. B. Repræsentant billeder viser myoCardium af NTG og mt-cpYFP mus i Langendorff perfunderet hjerte. Ex: excitationsbølgelængde. mt-cpYFP er begejstret ved 405 og 488 nm med emissioner opsamlet på 505-530 nm (blå) og 505 til 530 nm (grøn), hhv. TMRM er begejstret ved 543 nm med emission indsamlet ved> 560 nm (rød). Skalapanelerne = 50 um.
Figur 3. Single mitokondrie superoxid blinker påvist i skeletmuskulatur in vivo og in perfunderet hjerte. A. Repræsentative billeder (øverste panel) og spor af tidsafhængig fluorescens ændring (mt-cpYFP ved 405 og 488 nm excitation og TMRM ved 543 nm excitation, nederste panel), der viser en enkelt mitokondrie superoxid flash (fremhævet af appelsin pile i det udvidede del af billeder) i skeletmuskulatur fibre. Bemærk den øgede mt-cpYFP signal (ved 488 nm excitation) ledsages af nedsat TMRM signal. B. repræsentant images (øverste panel) og spor af tidsafhængig fluorescens (lavere panel) under en enkelt mitokondrie superoxid flash i perfunderet myokardiet. Skalapanelerne = 50 mM. Klik her for at se større figur .
Figur 4.. Øget superoxid flash frekvens i perfunderede hjertet ved elektrisk stimulation. Hjertet blev elektrisk stimuleret (Pacing, 4 V og 2 Hz) i 2 min. Dataene er middeltal ± SEM, n = 8 celler. *:. P <0,05 versus Resting Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Imaging enkelt mitokondrie begivenheder i levende dyr eller perfusionerede organer har en betydelig fordel i forhold til traditionelle metoder til mitokondriefunktionen evaluering 17,19,21,22,24,25. Den her beskrevne teknik kan opnå real-time in situ bestemmelse af mitochondrial funktion i en reel fysiologisk tilstand ved subcellulær opløsning. Dette er især nyttigt, når den kombineres med andre målinger, at systemisk undersøge den rolle, mitokondrier i den normale funktion af et bestemt organ eller celletype in vivo. Dette er en kompliceret teknik, der kombinerer konfokal mikroskopi og sofistikeret perfusionssystem med kontrollen af forskellige parametre. Ikke desto mindre har denne teknik er blevet brugt til at forbinde hele kroppen glukosemetabolismen med muskel mitokondriefunktion 17,19,20 og er i øjeblikket ansat af os til at studere mitokondriel dysfunktion i hjertesygdomme.
Den Langendorff hjerte perfusion-system er kompatibelt til hjertefunktionen evaluering gennem overvågning af venstre ventrikel tryk og billeddannelse intracellulære Ca 2 + transienter i hvert slag. Alternativt kan andre fluorescerende indikatorer såsom MitoSOX eller DCF perfunderes at lette in situ billeddannelse af steady-state ROS niveauer i myokardiet. Langendorff perfunderet hjerte har været meget anvendt til at evaluere responset af hjertet til fysiologiske (f.eks β-adrenerg stimulation af dobutamin) eller patologiske (f.eks iskæmireperfusion) perturbationer 26-28. Sådanne behandlinger kan inkorporeres i konfokal imaging system til at vurdere enkelt mitokondriefunktion som reaktion på belastninger.
Begrænsninger af denne fremgangsmåde indbefatter udvælgelse af væv / organer, der er muligt for levende dyr billeddannelse. Overfladiske væv såsom skeletmuskulatur, subkutane strukturer og overfladiske nerver er ideelle til konfokal billeddannelse i levende animal. Indre organer er teknisk upassende for levende dyr billeddannelse på grund af den omfattende skader på musen, mens du udsætter orglet. Imidlertid kan indre organer oprettes for organperfusion / kultur, som Langendorff perfunderet hjertet eller hjernen skive kultur, hvis en fysiologisk mimetisk miljø kan opretholdes. Desuden konfokalt mikroskop har en effektiv billeddannelse dybde på 30-50 um, som giver mulighed for billeddannelse af et par lag af celler beneath organ overflade. Det er muligt, at dette system kan kombineres med en multi-foton mikroskop, som har en meget højere indtrængningsdybde (fx op til 1 mm) og har været anvendt til at vurdere mitokondriefunktionen i det intakte hjerte 29. Bevægelsesartefakt er et andet kritisk spørgsmål, der bør overvejes. Mitokondrier i skelet muskler og hjertemyocytter viste minimal bevægelse under scanningen. Endvidere kan heartbeat-induceret bevægelsesartefakt undertrykkes eller elimineres ved perfusion med blebbistatin ennd anvendelse af let tryk på hjertet. I andre celletyper, såsom neuroner og fibroblaster kan mitokondrierne undergå konstante og dramatiske bevægelser. Under billedbehandling og analyse bør eventuelle signal ændringer som følge bevægelsesartefakt nøje identificeres og udelukkes.
Yderligere udfordringer i denne teknik er bl.a. at opretholde den passende tilstand hele eksperimentet, positive kontroller og fortolkningen af data. Til skeletmuskel billeddannelse i bedøvede mus bør udsættes muskel overflade nedsænkes i fysiologiske buffere hele tiden. Vitale tegn med musen såsom vejrtrækning bør overvåges under hele forsøget. For perfusionerede hjerte studier er passende iltning, temperaturkontrol og substrat forsyning nødvendig. Positive kontroller anbefales at kontrollere tilstand og reaktionsevne vævene. For at gøre dette, kan mus injiceres med insulin eller glucose og perfusionerede hjerter kan være elektrisk stilerede eller perfunderet med isoproterenol. Øget superoxid blinker skal observeres efter disse behandlinger (Figur 4) 19,20. Desuden er de time-lapse billeder taget når bevægelsesartefakt undertrykkes gennem hæmme hjerteslag, der producerer sub-fysiologiske forhold på grund af nedsat arbejdsbyrde. Således bør perfunderet hjerte forsøget betragtes som en tæt mimetisk af in vivo-situationen.
Endelig blev teknikken udviklet under anvendelse af et Zeiss konfokal (LSM 510). Andre konfokal (f.eks Nikon, Olympus eller Leica) kan anvendes, hvis systemet opfylder følgende krav: (1) har time-lapse frame scanning, (2) har en sampling rate på 1 sek / ramme, og (3) kan nå enkelt mitokondrier opløsning (fx 1 um x 2 um). Softwaren af en konfokal sædvanligvis tillader simpel billedbehandling og analyse, som definerer ROIs og fluorescens intensitet output med time etiketter. Alternativt kan Billede J software anvendes til både billedanalyse og beregning flash parameter.
Sammenfattende billeddannelse af en enkelt mitokondrie begivenheder såsom superoxid blinker i skeletmuskulatur in vivo eller in perfunderet hjerte er en unik tilgang til real-time bestemmelse af mitokondriefunktionen. Denne teknik er en betydelig fremgang i de traditionelle in vitro målinger og vil give en mere præcis vurdering af mitokondrie funktion og dets forhold til cellulære processer / funktioner under virkelige fysiologiske betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Drs. Heping Cheng, Huiliang Zhang og Stephen Kolwicz for deres nyttige kommentarer og teknisk støtte til at udvikle denne metode. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra NIH og Scientist Development Grant fra American Heart Association til WW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Blebbistatin | Toronto Research Chemicals | B592500 | |
| CaCl2 | Acros Organics | AC34961-5000 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006-500 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1 | |
| MgCl2•6H2O | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | M1880-1 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282-500 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014-1 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25 | |
| TMRM | Invitrogen | T-668 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module. | |||
References
- Brookes, P. S., Yoon, Y., Robotham, J. L., Anders, M. W., Calcium Sheu, S. S. Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, 817-833 (2004).
- Scheffler, I. E. Mitochondria. , 2nd, J. Wiley and Sons, Inc. (2008).
- Rosca, M. G., Hoppel, C. L.
- Griffiths, E. J.
- Winklhofer, K. F., Haass, C.
- Pieczenik, S. R., Neustadt, J. Mitochondrial dysfunction and molecular pathways of disease. Exp. Mol. Pathol. 83, 84-92 (2007).
- Szentesi, P., Zaremba, R., van Mechelen, W., Stienen, G. J. M. ATP utilization for calcium uptake and force production in different types of human skeletal muscle fibres. J. Physiol. 531, 393-403 (2001).
- Lemieux, H., Hoppel, C. L.
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. J. Biol. Chem. 217, 409-427 (1955).
- Lambert, A. J., Brand, M. D. Reactive oxygen species production by mitochondria. Methods Mol Biol. 554, 165-181 (2009).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G.
- Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15038-15043 (2006).
- Dickinson, B. C., Srikun, D., Chang, C. J. Mitochondrial-targeted fluorescent probes for reactive oxygen species. Curr. Opin. Chem. Biol. 14, 50-56 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 13044-13053 (2004).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat. Methods. 3, 281-286 (2006).
- Wang, W., et al.
- Wei-Lapierre, L., et al. Respective Contribution of Mitochondrial Superoxide and pH to Mitochondria-targeted Circularly Permuted Yellow Fluorescent Protein (mt-cpYFP) Flash Activity. J. Biol. Chem. 288, 10567-10577 (2013).
- Fang, H., et al. Imaging superoxide flash and metabolism-coupled mitochondrial permeability transition in living animals. Cell Res. 21, 1295-1304 (2011).
- Wei, L., et al. Mitochondrial superoxide flashes: metabolic biomarkers of skeletal muscle activity and disease. FASEB J. 25, 3068-3078 (2011).
- Sheu, S. S., Wang, W., Cheng, H., Dirksen, R. T. Superoxide flashes: illuminating new insights into cardiac ischemia/reperfusion injury. Future Cardiol. 4, 551-554 (2008).
- Wei, L., Dirksen, R. T. Perspectives on: SGP symposium on mitochondrial physiology and medicine: mitochondrial superoxide flashes: from discovery to new controversies. J. Gen. Physiol. 139, 425-434 (2012).
- Johnson, I., Spence, M. T. Z. Ch. 12.2. The Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , Life Technologies Corp. 510-511 (2013).
- Wang, X., et al. Superoxide flashes: elemental events of mitochondrial ROS signaling in the heart. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 940-948 (2012).
- Li, K., et al. Superoxide flashes reveal novel properties of mitochondrial reactive oxygen species excitability in cardiomyocytes. Biophys. J. 102, 1011-1021 (2012).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).
- Pasdois, P., et al. Effect of diazoxide on flavoprotein oxidation and reactive oxygen species generation during ischemia-reperfusion: a study on Langendorff-perfused rat hearts using optic fibers. Am. J. Physiol. 294, H2088-H2097 (2008).
- Granville, D. J., et al. Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1321-1326 (2004).
- Davidson, S. M., Yellon, D. M., Murphy, M. P., Duchen, M. R. Slow calcium waves and redox changes precede mitochondrial permeability transition pore opening in the intact heart during hypoxia and reoxygenation. Cardiovasc. Res. 93, 445-453 (2012).
