Summary
Approches pour tester les effets des médicaments antipsychotiques (APDS) dans Caenorhabditis elegans sont démontrés. Les dosages sont décrits pour tester les effets des médicaments sur le développement et sur la viabilité et le taux de pompage du pharynx. Ces méthodes sont également applicables pour les expériences pharmacogénétiques avec d'autres classes de médicaments que les PDA.
Abstract
Caenorhabditis elegans est un organisme génétique simple prêtent à grande échelle avant et arrière écrans génétiques et les écrans génétiques chimiques. Le C. génome elegans comprend médicament antipsychotique potentiel (APD) des cibles conservées chez l'homme, y compris les gènes codant pour des protéines nécessaires à la synthèse des neurotransmetteurs et pour la structure et la fonction synaptique. Exposition APD produit retard et / ou la létalité chez les nématodes de développement d'une manière dépendante de la concentration. Ces phénotypes sont dus, en partie, par l'inhibition induite APD de 1,2 pharyngée pompage. Ainsi, le phénotype de développement a une base neuromusculaire, ce qui est utile pour des études pharmacogénétiques des neuroleptiques. Ici, nous démontrons des procédures détaillées pour tester les effets APD sur le développement des nématodes et du pharynx pompage. Pour le dosage du développement, les embryons sont placés synchronisés sur un milieu de croissance de nématodes (NGM) des plaques contenant APDs, et les stades de développement de l'anusmaux sont ensuite marqués quotidien. Pour le test de débit de pompage du pharynx, mis en scène de jeunes animaux adultes sont testés sur des plaques NGM contenant APD. Le nombre de pompes du pharynx par unité de temps est enregistré, et le débit de pompage est calculé. Ces dosages peuvent être utilisés pour l'étude de nombreux autres types de petites molécules ou même de grandes molécules.
Introduction
Caenorhabditis elegans est un organisme génétique simple prêtent à grande échelle écrans génétiques avant et arrière et des écrans génétiques chimiques. C. elegans est sensible à un large spectre de composés bioactifs et a donc été utilisée avec succès pour déterminer les mécanismes d'action de ces divers composés. Par exemple, les composés bioactifs étudiés en utilisant la pharmacogénétique à vis sans fin comprennent des agonistes des récepteurs de l'acétylcholine (par exemple, lévamisole, la nicotine, morantel, et pyrantel), anesthésiques (par exemple, l'halothane), la caféine, les inhibiteurs de cholinestérase (par exemple, l'aldicarbe, Lannate, et trichlorfon), le fluorure, le GABA-connexes composés (par exemple GABA et muscimol), l'ivermectine, le paraquat, les esters de phorbol et les médicaments liés à la sérotonine (par exemple, la sérotonine et imiprimine) 3. Par ailleurs, C. elegans a été utilisé pour les écrans de petites molécules à grande échelle, permettant la découverte d'un nouveau composé bioactifs et l'identification de cibles génétiques nouveaux 4.
Le C. génome elegans comprend médicament antipsychotique potentiel (APD) des cibles conservées chez l'homme, y compris les gènes codant pour des protéines nécessaires à la synthèse des neurotransmetteurs et pour la structure et la fonction synaptique 5. Ainsi, C. elegans neurogénétique et offre de neurobiologie méthodes pour découvrir de nouveaux mécanismes moléculaires d'action des APD. Dans les nématodes, exposition APD tôt dans le développement produit un retard de développement, et à des concentrations plus élevées, la létalité 2,6. Exposition APD à l'âge adulte produit phénotypes comportementaux. Par exemple, l'exposition clozapine inhibe la locomotion et du pharynx pompage et améliore la ponte 1,2,7.
Retard de développement APD-induite et la létalité sont des phénotypes puissants pour grands écrans génétiques chimiques. Ces phénotypes sont complexes dans la mesure où ils ont probablement plus d'un basi cellulaires et génétiquess. Par conséquent, ces écrans génétiques devraient donner une variété de cibles indirectes de drogue. Cependant, notre laboratoire a effectué des écrans de gènes candidats et un écran ARNi à grande échelle pour des suppresseurs de retard de développement APD-induite et de la létalité et les gènes qui codent probablement des cibles directes, y compris la dopamine, l'insuline et les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine 2,8 a réussi à récupérer. Cribles génétiques basés sur les comportements APD-induits chez l'adulte ont également conduit à l'identification de nouvelles cibles APD, et nous sommes maintenant la validation de cibles à partir des écrans à la fois développement et de comportement chez les mammifères 7. Ainsi, une approche génétique chimique invertébrés de découvrir de nouveaux mécanismes moléculaires d'action des APD semble réalisable 5,8.
Le C. elegans pharynx est un organe qui comprend 20 neurones, 20 des cellules musculaires, et les 20 cellules accessoires, enveloppés par une membrane basale. Semblable à cœur de mammifère, le pharynx est un autonomend pompes constamment aliment depuis l'environnement externe 9. Inhibition de la vitesse de pompage du pharynx compromet l'absorption de nourriture, et donc des mutations ou des médicaments qui inhibent pharyngée pompage cause de retard de développement ou arrêter 9. APD inhibent le taux de pompage du pharynx, soit dans le cadre de leurs effets sur le développement et la viabilité 1,2. Ici, nous utilisons la clozapine APD atypique comme un exemple pour démontrer dosages de médicaments pour le développement des nématodes et du pharynx pompage.
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Protocol
Une. Retard de développement / test de létalité: Le type sauvage (N2) et deux souches mutantes (MUT1 et Mut2) sont testés dans trois concentrations de clozapine dans une plaque de 12 puits
- Au jour 1, verser 2 ml NGM support 10 dans chaque puits d'une plaque de 12 puits (chaque puits d'un diamètre de 2 cm) et laisser durcir sur le banc à la température ambiante (RT) pendant la nuit. Le même jour, choisir une colonie de bactéries Escherichia coli OP50, infecter une bouteille de 50 ml de solution LB, et de la culture dans un shaker 37 ° C à 220 rpm rotation pendant la nuit.
- Le jour 2, transférer 20 culture bactérienne ul OP50 sur le centre de chaque NGM bien. Incuber les plaques dans un incubateur à 37 ° C ou les laisser à la température ambiante pendant une nuit pour permettre au tapis bactérien de croître plus épais.
- Faire une clozapine solution stock de 80 mM en dissolvant la clozapine dans le DMSO (diméthylsulfoxyde) solvant. Ensuite, faire une solution de travail de 80 pi avec la solution mère diluée dans 1,7 mM d'acide acétique belon sur le tableau 1.
Remarque: La solution de travail pour un médicament d'intérêt particulier doit être déterminée en faisant une série de tests de concentration préliminaires pour trouver la concentration la plus appropriée pour distinguer le type sauvage des mutants. - Transfert de 80 ul solution de travail clozapine sur la plaque NGM ensemencé bien et agiter la plaque pour permettre la solution afin de répartir uniformément sur la surface. Attendez que la plaque sécher. Utilisation de la plaque pour le dosage, le même jour ou le placer dans un incubateur à 20 ° C pour être utilisé le jour suivant.
Remarque: La solution de travail est une suspension de médicament en raison de la faible solubilité de la clozapine, en particulier à une concentration plus élevée. Par conséquent, le tube vortex avant de transférer la solution à la plaque de médicament, afin de garantir que la concentration de médicament est exacte. - Lavez vers une assiette de 3,5 cm contenant de nombreux adultes gravides avec le tampon M9 puis tournez-les dans un tube de 15 mlà 2000 rpm pendant 1 min.
- Aspirer le surnageant. Ajouter 5 ml de solution d'eau de Javel (NaOH: hypochlorite: le trou DDH 2 O à 04:01:05) et perturber les nématodes en retournant doucement les tubes.
- Observer les animaux jusqu'à ce que la moitié d'entre eux sont dissous à environ 5 min. Centrifuger les œufs à 2000 rpm pendant 1 min.
- Aspirer le surnageant et ajouter rapidement 14 ml de tampon M9.
- Isoler les œufs à 2000 rpm pendant 1 min et aspirer le surnageant, laissant environ 100 solution ul. Vortex pour suspendre les oeufs.
- Transfert 2 oeufs ul suspension dans M9 sur une plaque NGM régulière pour tester combien d'oeufs sont transférés. Réglez le volume des œufs en suspension pour assurer qu'il ya environ 30-35 œufs dans chaque transfert. Transférer 30 à 35 œufs dans chaque puits de la plaque de dosage et ensuite incuber dans un incubateur à 20 ° C pendant 24 heures.
- Au premier jour de l'essai, marquer le nombre d'œufs éclos. Réglez le nombre total d'animaux éclos à 25/well par picking hors les vers supplémentaires si nécessaire.
- Les jours suivants, observer les animaux et de les marquer tous les 24 heures. Stade développement est reçu sur la base de la taille de l'animal et la forme de la vulve 11. L'expérience dure 5-6 jours avec l'effet le plus robuste typiquement vu sur le troisième ou le quatrième jour.
- Saisissez les données dans un fichier Excel et calculer le pourcentage d'animaux à chaque étape de développement pour chaque jour de l'expérience. Générer des graphiques avec la fonction '100% Stacked colonne "dans la colonne '2 D 'menu.
2. Pharyngée pompage Dosage: Jeune adulte Animaux pour le type sauvage et souches mutantes sont notés sur la clozapine dosage plaques
- La plaque d'essai est faite suivant le même protocole utilisé pour le dosage retard / de létalité de développement.
- Choisissez 50 animaux L4 pour chaque souche de plaques NGM ensemencées 24 heures avant l'essai et incuber les vers à 20 ° C.
- Choisissez 10 animaux à un assay plaque bien. Ensuite, prenez 10 animaux à l'autre et toutes les 15-20 minutes.
- Après les animaux dans le premier puits ont été exposés au médicament pendant 30 minutes, commencer l'essai en observant pharyngée pompage sous un microscope à dissection et marquer les pompes pendant 20 sec 9. Une fois pharyngée pompage est marqué, ramasser le ver de la plaque.
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Representative Results
Une. Le retard de développement / résultat du test de létalité
Un résultat typique pour le dosage de retard / de létalité de développement est mise en évidence sur les figures 1a et 1b. Lorsque les animaux sauvages dans le groupe de contrôle ont grandi à l'âge adulte gravide (figure 1a), les animaux de type sauvage exposées à la clozapine sont encore dans les jeunes stades larvaires ou sont morts (figure 1b). Figure 1c montre un résultat représentatif comparant un mutant suppresseur (Mut1) et un mutant d'activateur (Mut2) avec le type sauvage à trois concentrations différentes de clozapine. À tous les trois concentrations de clozapine, la létalité de Mut1 est inférieur de type sauvage et la létalité de Mut2 est plus élevé. Animaux survivants MUT1 progressent de stades larvaires plus avancés que le type sauvage, tandis que les animaux survivants Mut2 affichent un retard de développement par rapport au type sauvage. </ P>
2. Résultat de l'analyse du taux de pompage du pharynx
La figure 2 montre un test de pompage pharyngé résultat représentant la comparaison d'un mutant suppresseur (Mut1) et un mutant d'activateur (Mut2) avec le type sauvage à deux concentrations de clozapine. l'exposition de la clozapine réduit les taux de pompage du pharynx des souches sauvages et mutantes d'une manière dépendante de la concentration. Toutefois, le taux de pompage du pharynx diminué de Mut1 est inférieure à celle du type sauvage, tandis que le taux de pompage du pharynx diminué de Mut2 est supérieure à celle du type sauvage.
Figure 1. Démonstration de retard et la létalité de développement induite par la clozapine. Animaux de type sauvage (N2) cultivées sur un contrôle Plaque NGM (a) et sur une plaque NGM supplémenté avec 200 ug / ml (612 pM) clozapine (b). (C) Un résultat représentatif de l'essai de développement de retard / de létalité montrant l'effet de la clozapine sur le type sauvage (N2), un mutant suppresseur (Mut1), et un mutant d'activateur (Mut2). Les images (a) et (b) sont reproduits < http://www.nature.com/npp/journal/v34/n8/full/npp200935a.html > de neuropsychopharmacologie. 34 (8), 1968-1978 (Juillet , 2009). Cliquez ici pour agrandir l'image .
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Figure 2. Mise en évidence de l'inhibition induite par la clozapine de pompage du pharynx. Un résultat typique pour le dosage de pompage pharyngé montrant l'effet de la clozapine sur le type sauvage (N2), un mutant suppresseur (Mut1), et un mutant d'activateur (Mut2). Les données ont été analysées avec deux ANOVA en utilisant le logiciel statistique R. programme Cliquez ici pour agrandir l'image .
Tableau 1. Préparation de la solution de travail de la clozapine. Le montant est de 4 puits pour chaque concentration.
| concentration de la clozapine | 0 uM | 300 uM | 400 uM | 500 uM |
|---|---|---|---|---|
| Solution HAC | 270 pi | 270 pi | 270 pi | 270 pi |
| Solution clozapine stock | - | 30 pl | 40 pl | 50 pl |
| DMSO | 50 pl | 20 pl | 10 pl | 0 pi |
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Discussion
Ici, nous décrivons les méthodes pour tester les effets des APD sur le développement et le comportement de C. elegans. DMSO ou de l'éthanol est utilisé pour dissoudre la clozapine, étant donné que le médicament est relativement insoluble dans l'eau. Parce que les solvants ont été signalés à affecter C. elegans biologie 12, le DMSO seul ou groupes de contrôle éthanol seul sont essentiels. La plus forte concentration de DMSO utilisés dans nos essais est jusqu'à 3%, qui n'a pas un effet évident sur C. elegans développement. DMSO peut être utilisé pour de nombreuses petites molécules, ou même certaines grandes molécules, par exemple des acides lipidiques.
APD concentrations utilisées dans ces essais sont plus élevées que celles données pour les humains. Cette situation est commune à la plupart des petites études de molécules dans C. elegans, étant donné que des concentrations élevées sont nécessaires pour la pénétration de l'C. elegans cuticule. Des études de HPLC indiquent que les niveaux de la clozapine dans C. tissu elegans dans l'assa développementy sont proches de celles attendues dans les cerveaux humains 2.
Pénétration de la cuticule est une préoccupation particulière pour les études de grosses molécules. Mutants avec des défauts dans la barrière de la cuticule, comme ACS-20 mutants et de bus (B acterially U n-S wollen) mutants, offrent une approche pour contourner ce problème 13. Bus mutants ont été isolés sur la base de leur résistance à l'infection par l'agent pathogène de nematophilum Microbacterium. Par exemple, les alleles faibles du bus-8 montrent que ce gène joue un rôle dans la production de la surface de la cuticule. Ces mutants sont résistants à l'infection, car la bactérie ne peut pas se lier à la surface de l'hôte. Surtout, la perturbation de la formation de la cuticule provoque également une sensibilité accrue de la drogue dans ce contexte génétique 14.
Le test de développement décrit ici peut être adapté pour les écrans génétiques à grande échelle par la réalisation du test dans cultu liquidere. Pour interférence ARN du génome entier (ARNi) écrans, par exemple, le protocole est similaire à celui décrit ci-dessus, mais les bactéries se nourrissant d'ARNi est substitué à bactéries OP50 15. Le dosage de culture liquide nécessite une concentration de médicament plus faible que le dosage de plaque (observation non publiée). Notre laboratoire a effectué un tel écran ARNi à grande échelle pour des suppresseurs de retard de développement induite par la clozapine et obtenu 40 suppresseurs d'un écran de ~ 17 000 C. elegans 8 gènes.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'il n'y a pas de conflit d'intérêt en cause.
Acknowledgments
Le travail a été soutenu par une NIH prix scientifique de développement clinique K08NS002083, une subvention de l'Institut de recherche Shervert Frazier, et le Prix du jeune chercheur NARSAD à Edgar A. Buttner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | EMD | SX0590-13 | |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 | |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 | |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX12 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 | |
| 12-well Tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
References
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