Summary
恶性胶质瘤是一组具有明显临床和分子特征的高度渗透性胶质肿瘤的异质性群体。原位矫形异种格拉夫特在前科动物模型中重新概括恶性胶质瘤亚型的组织病理学和分子特征。
Abstract
恶性胶质瘤是一组具有明显临床和分子特征的高度渗透性胶质肿瘤的异质性群体。原位矫形异种格拉夫特在前科动物模型中重新概括恶性胶质瘤亚型的组织病理学和分子特征。为了模拟世卫组织在移植检测中的I级和IV级恶性胶质瘤，人类肿瘤细胞被异种移植到免疫功能低下小鼠的正交部位——大脑中。与利用培养肿瘤细胞的继发性异种移植物相比，人类胶质瘤细胞与被切除的标本分离，在组织培养中无需事先通过移植即可产生原发性异种移植。本报告中的程序详细说明了肿瘤样本准备、颅内移植到免疫功能低下的小鼠、肿瘤移植监测以及肿瘤收获，供随后进入受体动物或进行分析。肿瘤细胞准备需要2小时，外科手术需要20分钟/动物。
Introduction
恶性胶质瘤是发生在大脑和脊髓的中枢神经系统的原发性胶质肿瘤。胶质瘤由世界卫生组织（世卫组织）根据组织学上与星形细胞、寡头细胞或子细胞的相似性进行分类，然后根据恶性病理特征进行数值分级（I至IV）。最常见的组织学亚型是天体细胞瘤、寡头性腺胶质瘤和混合寡头肌细胞瘤。包括世卫组织二至四级在内的恶性胶质瘤的特点是侵入性生长和对现有疗法的顽固不化。在美国，每年约有15，750人被诊断为恶性胶质瘤，估计有12，740名患者死于这种疾病。这些统计数字突出了恶性胶质瘤的特别致命性，以及提高疗效的重要需要。
癌症模型对于研究肿瘤生物学和疗法至关重要。人类癌细胞系是体外操纵和体外异种移植研究（继发性异种移植）1的重要第一步。然而，标准癌细胞培养经历表型和基因型转换2-4，可能无法恢复在继发性异种移植5。此外，基因改变，如异辛酸盐脱氢酶（IDH）突变6，独特的干细胞种群7和对关键信号通路8的依赖，可能会在癌细胞培养中消失。基因组特征可以在癌症领域培养中更好地保持，但仍不能完全反映原肿瘤的基因型2，3。直接正交移植否定了体外培养的影响，提供了适当的微环境，并保留了肿瘤启动细胞9，10的完整性。因此，原生异种移植物是一种强大而相关的临床前模型，用于严格测试靶向剂，以帮助合理设计未来的临床试验5，11，12。
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Protocol
1. 肿瘤细胞悬架的准备
注： 需要为使用患者材料和动物提供适当的机构批准，以建立和维持原发性正畸胶质瘤异种移植物。在范德比尔特大学医学中心，在患者同意下收集超过诊断所需量的肿瘤材料，用于研究组织库。标本标本标注带有随机的 5 位 REDcap 数据库编号，并删除所有患者特定标识符。REDcap 数据库包含组织存储库中每个标本的分离临床数据，包括性别、年龄（年）、种族、生存状态、病理学、癌症治疗、切除年份和进展时间。为了保持无菌性和优化主要异种移植方法的成功，所有试剂、蒸汽自动切割手术器械和手术部位应提前组装或准备。
注： 胶质瘤标本通常含有大量的骨髓和碎片。根据标本大小，可能需要使用超过 4 个不连续梯度管来充分清除骨髓和碎屑。
注： 当没有或很少清晰可见的未分离组织剩余时，这个过程就会完成。避免在三次加工过程中引入气泡。
注： 分离后的细胞生存能力通常为 90%>%。较低的通过率可能反映许多变量，包括从手术室的次优组织处理或运输时间、冷冻保存方法或木瓜分离技术。然而，只要以适当的体积移植足够数量的可行细胞，较低的细胞通过率可能仍然足够。每只小鼠的体积为2μl，可植入50，000-200，000个可行的细胞。由于注射器针的斜尖，应在最后音量中加入额外的 5 μl 细胞悬浮，以确保每次注射时都能将足够的材料抽入注射器中。例如，为 5 只小鼠注射 2μl/鼠标，最终体积应为 15 μl （15 μl = （5 x 2 μl） = 5 μl）。
- 将刚被重新解剖的、身份不明的患者材料放在冰上无菌的封顶容器中，以便运往实验室。将标本直接加工为移植或冷冻保存在液氮中的标本（见下文），以储存在液氮中，然后使用。
- 准备在无菌罩与制造商提供的套件组件和说明书包解决方案（帕潘溶液，洗涤/蛋白酶抑制剂溶液和不连续梯度溶液）。标记无菌 15 毫升聚苯乙烯锥形管，并分发如下解决方案：
- 管1：5毫升的帕金溶液
- 管 2： 3 毫升洗涤/蛋白酶抑制剂溶液
- 管 3-6： 5 毫升每个不连续梯度溶液
- 将胶质瘤标本放在管 1 中，配有 5 毫升木瓜溶液，并在 10-20 分钟内用 5 毫升移液器进行三重奏。
- 将材料上下吹10次，然后在室温下孵化材料2-3分钟，然后启动下一个三轮。
- 将 5 毫升移液器的尖端放置在圆锥管底部，每个三轮车循环，使尖端在最后 2 个周期中接触管的底部。
- 离心机在室温下300 x g 5分钟。在 3 毫升的洗涤/蛋白酶抑制剂溶液中上下 10 倍地取出超自然剂和移液器。
- 小心地将等量的悬架分层到每个 5 毫升不连续梯度溶液（管 3-6），以"重力"分配速度设置管道。
- 将管子放在装有摆动桶转子的离心机中，加速速度降低到最低设置，制动器关闭。离心机在室温下76 x g 12分钟。随着制动器的关闭，离心工作一般在20分钟后完成。
- 取出超自然物，再喷出并结合每个颗粒在5毫升的无菌平衡盐溶液中，并将细胞放在冰上。
- 取出细胞悬架的一部分（10-100 μl），并通过用血细胞计排除盘蓝色来确定可行细胞的密度。
- 离心机在300 x g 5分钟。去除超自然物质，以每μl25，000-125，000个可行细胞的密度重新消耗细胞颗粒。
- 将足够容量的细胞悬架转移到 200μl 微中微管 （PCR 管） 中，并放置在冰上。
2. 准备手术场地和仪器
注： 手术过程中佩戴无菌手术手套。根据每个机构的要求，可能需要手术服、帽子和护脸器。
- 准备一个消毒的台面啮齿动物手术与分开的相邻区域，动物准备，手术场和动物恢复。
- 在蒸汽高压灭菌器械中消毒。随后，在从一种动物过渡到另一种动物时，使用热珠灭菌器对仪器进行闪光消毒。
3. 感应、麻醉和镇痛
注： 从小鼠麻醉后超过15分钟的手术需要接触热源。为了防止体温过低，在术前和术后期间，小鼠会获得热源（循环热水毯）。
- 准备氯胺酮/西拉津鸡尾酒进行感应麻醉，使每只小鼠每克体重注射10微克/千克的鸡尾酒，每克体重可获得氯胺酮100毫克/千克和10毫克/千克的西拉津。
-
表1。麻醉鸡尾酒。
库存集中度 要准备的音量 一只鼠标 五只老鼠 十只老鼠 氯胺酮 100毫克/毫升 25 微升 125 微升 250微升 西拉津 100毫克/毫升 2.5 微升 12.5 微升 25 微升 伊索托尼盐水 223 微升 1，113 微升 2，225 微升 总 250 ul 1，250微克 2，500微克 - 通过稀释库存溶液（10毫克/毫升）1：20无菌、无阳激素的水，为镇痛准备酮蛋白溶液，使每只小鼠通过每克体重注射10微克溶液，获得5毫克/千克的剂量。
- 称重并记录术前体重。单个鼠标重量各不相同，但一般范围为 18-22 克。
- 用胰岛素注射器将每克小鼠体重10微克氯胺酮/西拉津鸡尾酒注射到腹膜内空间。例如，为 20 克鼠标注射 200 μl。
- 确定鼠标是否通过后腿的脚趾捏完全麻醉。鼠标通常需要 3-5 分钟才能不再从捏中退出。
- 用胰岛素注射器在侧翼松弛的皮肤中每克小鼠体重皮下注射10μl的酮蛋白溶液。例如，为 20 克鼠标注射 200 μl。
- 用剪子在头骨上剃头发，用棉尖施用器擦洗裸露的头皮，然后擦拭酒精垫。重复这些步骤，多擦两次， 波维酮碘擦洗和酒精擦拭。
- 将眼药膏涂抹在鼠标的眼睛上。
- 用无菌手术刀刀片将1厘米的中线切口从耳朵后面延伸到眼睛前部。
- 将鼠标置于解剖范围下，并露出头骨以识别缝合线。使用带钻头的圆形运动，将一个2.5毫米横向的毛刺孔中心到胸前，将1毫米的后孔集中到日冕缝合线。
4. 颅内移植
注： 注射量超过2.5微克对小鼠可能致命。
- 将鼠标钩在切口杆上的上切口并应用鼻夹，使头骨牢牢地保持在中性位置，从而将鼠标置于立体定形框架上。
- 将微中线管中5-10μl的细胞上下多次抽取到粘在立体定向操纵器探针支架中的10μl汉密尔顿注射器中，以混合悬架并消除气泡。压低柱塞，使注射器装载2μl（足够的体积注入一种动物）。
- 拉皮切口的横向边缘，露出毛刺孔，并使用微脉冲器将针头引入毛刺孔，使斜面部分就在头骨表面以下。
- 将针头推进 3 mm，然后取出针头 0.5 mm 以创建注射空间。
- 将柱塞缓慢推进超过 30 秒，然后让针头在大脑中再停留 2 分钟。通过提升 0.5 mm 并等待额外的 30 秒，然后从大脑中取出针头，逐渐取出针头。
- 将鼠标从立体定型框架中取出，用自动剪辑关闭伤口。
- 将鼠标放在加热垫上以保持体温，并持续监测粘膜和裸露组织（脚底）的呼吸模式和颜色。
- 一旦老鼠从麻醉（麻醉和流动）完全恢复，将鼠标放在无菌微分离器笼中，并将其送回动物收容所。
5. 植入后动物护理和观察
注： 肿瘤移植和渗透生长的最可靠迹象是渐进的，持续的体重减轻，伴随着驼背姿势和粗糙的发衣的发展。在极少数情况下，神经缺陷被注意到，包括厌食症，帕雷西斯和癫痫发作。正交原发性异种移植物具有很强的侵入性，并长期发展。小鼠通常在移植后3-6个月出现肿瘤生长症状。
- 每天观察有正位异种草的小鼠，在切口部位观察食物和水的摄入、行为、梳妆和感染迹象。
- 如果术后观察到疼痛或痛苦，则施用酮丙酮（皮下5毫克/千克，每天1-2次）。
- 手术后 8-10 天取出自动剪辑。
- 每周称量小鼠。
- 监测肿瘤移植的体征和症状。
6. 肿瘤收获
注： 通过这种方法，第一个日冕切片（#1）包含嗅球的后部方面和前叶的前侧。受精肿瘤在随后的3个冠状切片（切片#2、#3和#4）的右半球最为丰富，注射视线通常包含在冠状切片#3中。根据实验需要，该材料可用于肿瘤通道、冷冻组织部分、形式素固定石蜡嵌入组织部分、分离组织流动细胞测量、细胞培养或用于DNA、RNA或蛋白质分析的溶解酶。肿瘤的一部分可以低温保存，以满足未来的需要，细胞存活率在80-95%不等。
- 通过长期接触二氧化碳，然后进行宫颈错位，使小鼠安乐死。
- 用一把较大的手术剪刀在大脑底部（前兆巨无霸水平）将安乐死的小鼠斩首，并将皮肤从切口向前拉，以完全暴露头骨。
- 移除大脑。
- 将一把细手术剪刀插入前体巨无霸的横向侧面，以达到左外听觉肉的水平，沿头骨左侧切割骨骼。在右侧执行相同的切割。
- 沿着冠状平面将冠状骨从一个外部听觉肉切到另一个，并取出骨骼以暴露小脑。
- 切开眼睛之间的鼻骨板。
- 切下垂缝合线，沿下垂缝合线从鼻骨板切割到胸骨。通过从羊肉到布雷格玛的切口，沿着下垂缝合线完成中线切口。
- 小心地将一对细钳的尖端沿两侧的下垂开口插入，将头骨的任何粘附物撕裂到大脑，然后横向剥去两个头骨的两半，以横向暴露大脑和嗅觉球茎。
- 在嗅球的腹腔方面和头骨之间滑动钳子以释放任何粘附。
- 将头骨向后倾斜，使大脑被缩回，使视神经和其他颅骨神经暴露在外。切断颅骨神经，将大脑释放到含有无菌PBS的盘子中。
- 用称重铲将大脑转移到矩阵切片器中，用剃须刀叶片生成 2 毫米日冕切片。
- 将日冕片放在含有无菌PBS的盘子中，以进行进一步的目视检查和进一步的组织处理。
7. 肿瘤冷冻保存
- 准备冷冻保存介质的库存解决方案。
- 添加 50 毫升增殖补充剂、5 毫升 100 倍青霉素和链霉素溶液，以及 450 μl 的 0.2% 肝素至 450 毫升基底介质。
- 在 4 °C 下存储库存解决方案，防止光线照射。
- 准备冷冻保存介质的工作解决方案。
- 将 47.5 毫升低温保存介质和 2.5 毫升无菌 DMSO 混合在 50 毫升聚丙烯锥管中，混合均好。
- Aliquot 1.0 毫升的工作解决方案，以每个低温和存储在 4 °C 保护免受光。
- 将一片2毫米的日冕状粒状大脑放入冰上含有冷冻保存介质的低温内。
- 将小瓶紧紧盖住，放在-80°C的冷冻容器中。 第二天将低温气流转移到液氮罐中，以进行更长的储存。
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Representative Results
分离的胶质瘤细胞被直接移植到免疫功能低下的小鼠的大脑中，以获得原位正畸异种移植线。每个肿瘤标本在移植前被分配一个随机数字，作为去除受保护的健康信息的分离过程的一部分。为此，我们使用 5 位 REDcap 数据库编号。 图1 说明了从胶质母细胞瘤（GBM 17182）与同心酸脱氢酶1（IDH1）突变精氨酸132到组织丁（R132H）建立异种移植线的过程和命名。移植后，肿瘤识别号中添加"X"表示异种移植肿瘤，然后添加"P"来跟踪通过编号。P0 指定初始移植接受者，P1 指定第一个异种移植通道的接受者小鼠。通常，3-5只小鼠最初被移植以建立一条线，然后异种移植的肿瘤被传入10只接受小鼠（P1），以扩大线供将来研究之用。
正位移植后，接受者小鼠接受监测，以监测肿瘤移植和生长的体征和症状。肿瘤移植的最敏感指示是显著和持续的减肥。由于小鼠在幼年时被移植，术后体重有望增加。小鼠的体重可能会在一周到一周以看似戏剧性的方式波动，但是持续超过3克的损失通常是肿瘤移植的良好迹象。通常，异种群中的大多数小鼠在类似时间段内都会出现体重减轻，具体时间从60天到350天不等，具体取决于肿瘤。当每次移植相同数量的肿瘤细胞时，给定肿瘤的中位存活时间通常从通道到通过时间相似。 图2 中图为5只移植的老鼠，移植的GBM（17182XP2）以前曾被移植和通过过一次。在5只17182XP2小鼠中，有4只在移植17周后显著减肥。其余小鼠（小鼠3）没有表现出体重减轻，在验尸时也没有发现肿瘤，表明只有80%的受体出现肿瘤移植。
当有症状的老鼠的大脑被收获时，脑切片矩阵是组织处理的极其有价值的工具。从每个大脑中生成多个解剖定义的部分，允许使用某些部分进行多种分析模式，并冷冻保存组织的其他部分。例如，IDH1的突变状态可以通过桑格用一部分的材料测序或用另一部分的免疫化学来评估（图3）。肿瘤的侵占可能很容易通过对冠状动脉部分的目视检查而显现出来，然而，一些异种移植物可能需要使用免疫组织学（图4 和 图5）。分离用于串行通道或其他研究的异种草时，重要的是从一小部分材料开始，以便可以充分去除骨髓和碎片（图6）。帕潘分离系统的不连续梯度最适合处理成年小鼠大脑的一小部分。我们建议沿中线切割每个日冕部分，每半使用两个不连续梯度。
图1。原位正畸异种移植线通过将分离的胶质瘤细胞直接移植到免疫功能低下的小鼠的大脑中，然后通过连续移植扩大。 IDH1基因中132的异质体突变发生在超过70%的弥漫性天体瘤、寡头细胞瘤、寡头肌细胞瘤和继发性胶质母细胞瘤中，而原发性胶质母细胞瘤的发生率不到7%。GBM 17182 包含最常见的 IDH1 突变，精氨酸 132 到组织丁 （R132H）。 单击此处查看更大的图像。
图2。GBM 17182XP1 系列移植接受者的生长曲线显示，在 5 个 GBM 17182XP2 小鼠中，有 4 只在手术后 130-150 天内显著减重。单击此处查看更大的图像。
图3。患者肿瘤（GBM 17182）和原发异种移植（17182XP0）的异质体、体细胞IDH1 R132H突变可以通过桑格测序或抗体染色检测。 具有 IDH1 R132H 特异性抗体的免疫化学表明突变胶质瘤细胞密集地聚集在血管周围或患者标本和小鼠大脑的更分散渗透区域。 单击此处查看更大的图像。
图4。原发性正位异种移植物表现出高度的渗透性生长，单靠血氧素和 eosin （H &E） 染色可能很难完全欣赏。 具有人特异性抗体的免疫化学是识别受感染的人类细胞的特别有用的方法。肛门塑料寡头细胞瘤异种移植物（14175XP2）的抗人类葡萄干染色揭示了注射中扩散肿瘤质量的渗透性胶质瘤的典型特征 右半球和侵入性生长沿骨髓（星号）和星座纤维（黑色箭头）和瘦膜传播（黑箭头）的骨髓区域。在这个放大（1.25X）是人类肿瘤细胞聚集在入侵皮层中小鼠神经元（腹膜饱和度）周围不被欣赏。 单击此处查看更大的图像。
图5。对盒装区域A-C中功率较高的14175XP2冠状动脉瘤14175XP2冠状动脉瘤的分析显示，血管周围（A区）、星膜脂道（"铅笔纤维"）和语料库卡洛苏姆（C区）的红外突变人类细胞。 与GBM 17182XP2一样，IDH1 R132H对合成代谢寡糖细胞瘤14175XP2的染色表明，IDH突变在受体小鼠的连续通道之后，在原发性正位异种移植中保持。 单击此处查看更大的图像。
图6。人类肿瘤细胞可以根据大小与分离异种移植物中的小鼠细胞区分开来。 为了量化分离的异种移植中的人类肿瘤细胞进行连续通道，人类细胞在光显微镜下通过大尺寸和深绿色发光（箭头）在血细胞仪中识别出来。通过流动细胞学，人体细胞具有与小鼠材料不同的散射特性，可以封闭以供进一步分析。 单击此处查看更大的图像。
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Discussion
培养细胞系、异种移植和转基因小鼠是模拟胶质瘤的最常见方法，每个模型系统3，13，14都有明显的益处和局限性。原位正交胶质瘤异种移植的相关好处包括渗透性生长，这些生长是弥漫性胶质瘤的典型代表，以及保留遗传改变和重要的信号机制，这些机制在培养的胶质瘤细胞中可能极其难以维持。例如，isocitrate脱氢酶突变和声波刺猪配体生产可以维持在原位矫形异种格拉夫特15，16，但很少在培养胶质瘤细胞14，17-19。然而，根据实验需要，考虑原位正位异种移植的重大缺点是很重要的。尽管获得足够的患者材料，但测量大脑中胶质瘤的生长比在异位部位更难测量。此外，原位矫形异种格拉夫特的生长速度明显慢于异位异种格拉夫。因此，研究人员可能更愿意将细胞移植到免疫功能低下的老鼠的侧翼，其中重要的组织学和分子特征也可能保留4。
建立原正交异种移植的两个重要考虑因素是免疫功能低下的小鼠接受者的类型和胶质瘤恶性程度。我们在缺血（nu-nu）小鼠中建立原发性异种移植物的成功严重有限，在NOD/SCID和NSG（N OD/SCID/白细胞-2受体gamma链缺乏）小鼠方面也取得了同样良好的成功。NSG小鼠是可取的接受者，因为肿瘤细胞的移植率和更长的寿命相比，NOD/SCID小鼠20，21。关于世卫组织肿瘤等级，我们观察到三级和四级肿瘤的胶质瘤移植，但未观察到一级和二级肿瘤的胶质瘤。
对于原发性正畸胶质瘤异种移植，分离的肿瘤细胞可直接移植到免疫功能低下的小鼠9 的大脑中，肿瘤启动细胞可被前瞻性分离（例如选择CD133表达细胞）进行移植22。在我们的经验15，16中，任何一个细胞来源都适合成功的肿瘤移植，尽管使用CD133富集的细胞需要更多的启动材料。无论是准备分拣细胞还是未分类细胞进行移植，重要的是要充分去除分离的胶质瘤标本中的骨髓和碎片。未能充分去除骨髓和碎屑，明显妨碍了将悬架拉入汉密尔顿注射器并将统一数量的细胞移植到每个受体的能力。在木瓜分离后，使用测定仪评估一个小的碱性报价是有帮助的，以便确定需要充分消除骨髓和碎屑的不连续梯度管的数量。完全去除是不可行的，但人们可以认识到在骨髓去除之前分离标本中的细胞量化困难，以及去除后与不连续梯度相对容易。
分离患者标本中可行细胞的产量可以高度可变。最理想情况是，105 个细胞被移植到5个受体小鼠中，尽管我们只获得了3，000个细胞/动物的移植。我们移植的主要恶性胶质瘤标本（世卫组织III级和IV级）中，约有一半已经移植到40-100%的初始受体小鼠体内。矫形移植后，接受者小鼠必须每周称重，并定期监测肿瘤移植和生长的体征和症状。原发性正交异种移植物表现出扩散、渗透性生长和焦神经症状，如血尿或癫痫发作，仅在极少数情况下观察到。肿瘤移植的最敏感迹象是显著和持续的体重减轻，可能伴随着驼背姿势、粗糙的发大衣或圆顶头骨的发展。小鼠持续减肥的速度根据患者样本变化很大，范围从60-350天不等。NSG 小鼠在移植时通常体重为 18-25 克，术后成人体重为 28-33 克。床上用品应定期更换，因为笼子条件可能会在相当大的程度上改变动物的重量。动物的体重可能从一周到下一周波动一克，确定这是否代表肿瘤的侵占可能很困难。NSG 小鼠的肿瘤移植的一个很好的迹象，已经达到成人体重是持续减肥大于 3 克。虽然受感染的小鼠通常会逐渐减肥，可以在几周内测量，但偶尔动物的健康可能会因为肿瘤生长而迅速下降，例如脑积水的发展，或者来自感染等无关的原因。
安乐死后，通过对大脑的粗暴检查，肿瘤的侵占可能并不明显，而组织的确认是必不可少的。对于最初的肿瘤接受者，我们以同样的方式处理每个大脑，以便对一部分进行组织学评估，如果确认移植，则为后续肿瘤通道低温保存。如上所述，大脑被放置在矩阵切片器中，以产生2毫米的日冕切片，每个切片代表大脑沿前轴到后轴的定义区域。通常含有注射部位的冠状切片#3固定在形式素中，其余每个切片均放置在单独的、标记的低温中，内含 1 毫升冷冻保存介质。形式素固定石蜡嵌入 （FFPE） 幻灯片沾染了血氧林和 eosin，以评估组织学和抗体对 Ki67 和人体维他汀可视化受体。
一旦移植被证实，肿瘤可能通过和二次接受者的包扎率通常高于80-100%。我们建议在更多的接受小鼠中首次传递肿瘤，以便产生足够的冷冻保存材料，以保持在低通道（2-5）的给定肿瘤线，以便将来的研究。当每次移植相同数量的肿瘤细胞时，给定肿瘤的中位存活时间通常从通道到通过时间相似。
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Disclosures
作者宣称他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们特别感谢范德比尔特大学医学中心的患者，他们为分子神经外科组织库提供了宝贵的研究材料。我们感谢那些建立和维护组织银行的人，里德·汤普森MD（首席调查员），樱桃金纳德RN（研究护士）和拉里A.皮尔斯MS（经理）。组织学服务部分由范德比尔特大学医学中心 （VUMC） 转化病理共享资源（由 5P30 CA068485 奖支持范德比尔特-英格拉姆癌症中心）执行。这项工作得到了国家发展局（1R21NS070139）、伯劳斯威康基金和VMC发展基金向MKC提供的赠款的支持。MKC 由退伍军人事务部、退伍军人健康管理局、研究和发展办公室、生物医学实验室研究和发展部通过赠款 1 I01 BX000744-01 获得支持。内容不代表退伍军人事务部或美国政府的意见。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040-133 | |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corp. | LK003150 | |
| Trypan blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250061 | |
| Ketamine HCl | Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company | ||
| Xylazine HCl | |||
| Ketoprofen | |||
| Ophthalmic ointment |
|||
| Povidone-iodine |
Fisher Scientific | 190061617 |
|
| Cryopreservation medium and proliferation supplement |
StemCell Technologies | 05751 |
|
| 0.2% Heparin sodium salt in PBS |
StemCell Technologies | 07980 |
|
| Penicillin-streptomycin |
Life Technologies | 15140-122 |
|
| Dimethyl sulfoxide |
Sigma-Aldrich | D6250-5X10ML |
|
| NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice |
The Jackson Laboratory | 005557 |
NSG mice |
| Anti-human vimentin antibody |
Dako | M7020 |
Use 1:200 to 1:800 |
| Anti-human IDH1 R132H antibody |
Dianova | DIA-H09 |
Use 1:100 to 1:400 |
| Centrifuge with swinging bucket rotor |
|||
| Pipetter with dispensing speed control |
|||
| Disposable hemocytometer |
Fisher Scientific | 22-600-100 |
|
| Sterile surgical gloves |
Fisher Scientific | 11-388128 |
|
| Disposable gown |
Fisher Scientific | 18-567 |
|
| Surgical mask |
Fisher Scientific | 19-120-1256 |
|
| Tuberculin syringe |
BD | 305620 |
|
| Alcohol pads |
Fisher Scientific | 22-246-073 |
|
| Portable electronic scale |
Fisher Scientific | 01-919-33 |
|
| Zoom stereomicroscope |
|||
| Surgical clipper |
Stoelting | 51465 |
|
| Scalpel handle |
Fine Science Tools | 10003-12 |
|
| Scalpel blades, #10 |
|||
| Stereotaxic instrument |
Stoelting | 51730 |
|
| High-speed drill |
Stoelting | 51449 |
|
| Drill bit, 0.6 mm | Stoelting | 514552 | |
| Hamilton syringe |
Hamilton | 80336 |
|
| Autoclip, 9 mm |
BD | 427630 |
|
| Circulating water warming pad |
Kent Scientific | TP-700 TP-1215EA |
|
| Hot bead dry sterilizer |
Kent Scientific | INS300850 |
|
| Surgical scissors |
Fine Science Tools | 14101-14 |
|
| Fine scissors |
Fine Science Tools | 14094-11 |
|
| Spring scissors |
Fine Science Tools | 15018-10 |
|
| Dumont forceps |
Fine Science Tools | 11251-30 |
|
| Semimicro spatulas |
Fisher Scientific | 14374 |
|
| Mouse brain slicer matrix |
Zivic Instruments | BSMAS002-1 |
|
| Cryogenic storage vials |
Fisher Scientific | 12-567-501 |
References
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