Summary
Neuroblast 이주는 출생 후 신경에 근본적인 이벤트입니다. 우리는 급성 뇌 조각의 시간 경과 영상을 사용하여 생체 내 출생의 일렉트로 그들의 이주 이후의 시각화하여 neuroblasts를 효율적으로 표시하기위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 비디오 추적하여 neuroblast 역학의 정량 분석에 대한 설명을 포함한다.
Abstract
subventricular 영역 (SVZ)는 출생 후 뇌의 주요 신경 인성 틈새 시장 중 하나입니다. 여기에, 신경 전구 세포 증식과 후각 망울 (OB)으로 주동이의 철새 스트림 (RMS)을 따라 이동할 수 neuroblasts에 상승을 제공합니다. 이러한 장거리 이동은 OB 신생아 신경의 후속 성숙에 필요하지만,이 과정을 조절 분자 메커니즘은 아직 불분명된다. neuroblast 운동성을 조절하는 신호 전달 경로를 조사하는 신경의 기본적인 단계를 이해하는 데 도움이뿐만 아니라, 부상, 뇌졸중, 또는 변성에 의해 영향을받는 뇌의 사이트를 대상으로하도록 neuroblasts의 능력 부여, 치료 회생 가능성이 있습니다뿐만 아니라.
이 논문에서 우리는 생체 내 출생의 일렉트로 마우스 RMS의 neuroblast 마이그레이션 이후의 시간 경과 영상에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 출생 일렉트로 효율적 SVZ 조상 형질 할 수 있습니다다시 RMS를 따라 이주 neuroblasts을 생성하는 세포. 급성 뇌 슬라이스 문화의 디스크 시간 경과 현미경을 회전 공 촛점을 사용 neuroblast 마이그레이션 밀접하게 생체 조건과 유사한 환경에서 모니터링 할 수 있습니다. 또한, neuroblast 운동성 추적 및 정량적으로 분석 할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 RMS를 따라 이주 neuroblasts 레이블을 시각화하기 위해 GFP를 발현하는 플라스미드의 생체 내 출생의 전기 충격을 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 에 loxP 시스템을 사용하는 조건부 녹아웃 마우스에 shRNA를 또는 CRE 재조합 효소를 발현하는 플라스미드의 일렉트로 또한 관심의 유전자를 대상으로 할 수 있습니다. 급성 뇌 슬라이스 배양 물의 약리 조작 neuroblast 이주 다른 시그널링 분자의 역할을 조사하기 위하여 수행 될 수있다. 시간 경과 영상과 생체 전기 충격에 결합함으로써, 우리는 neuroblast 운동성을 조절하는 분자 메커니즘을 이해하고 개발에 기여할 수 있도록 노력하겠습니다소설의, 표준은 뇌의 복구를 촉진하기 위해 접근한다.
Introduction
포유 동물의 뇌에 새로운 뉴런 (신경)의 발생은 주로 두 지역에서 출생 후 발생, 해마 1의 치아 이랑 (dentate gyrus)의 좌우 심실과 subgranular 영역의 subventricular 영역 (SVZ). 최근 몇 년 동안 수집 된 증거는 해마와 후각 망울 메모리 기능 1-3 출생 후 신경을위한 중요한 역할을 지원합니다. 중요한 것은, 출생 후 신경은 치료 때문에 퇴행성 신경 질환과의 관계의 가능성, 뇌 4-6 부상 사이트를 마이그레이션 할 neuroblasts의 능력을 보유하고있다.
subventricular 영역 (SVZ)는 최근 중요한 신경성 틈새 시장으로 떠오르고있다. SVZ 파생 neuroblasts이 출생 후의 뇌 -1,7,8,8에서 가장 긴 마이그레이션 프로세스 만들기, 주동이의 철새 스트림 (RMS)를 통해 후각 망울 (OB)를 향해 이동한다. 포유류의 SVZ / RMS / OB 시스템이되고있다이러한 증식, 이동 및 분화 1,8 등의 신경에있는 다른 단계를 공부하는 유용한 모델. 많은 성장 인자와 세포 외 신호는 RMS를 따라 SVZ 신경과 이동을 조절하지만, 세포 내 분자 메커니즘은 지금까지 완벽하게되는 1.9을 이해합니다. RMS에 따라 적절한 이주 신생아 뉴런 (10)의 연속적인 성숙을 위해 매우 중요합니다. 또한, 일부 연구는 SVZ 파생 neuroblasts가 뇌 손상 사이트 4-6,11-13에 RMS 밖으로 마이그레이션 할 수있는 것으로 나타났습니다. 따라서, 신호 전달 메커니즘의 조절 neuroblast 마이그레이션을 조사하는 것은 신경을 이해할뿐만 아니라 기본적인뿐만 아니라 잠재적 인 치료 응용 프로그램입니다.
여기, 우리는 생체 내 출생을 전기 SVZ 신경 전구 세포를 라벨 및 시간 경과 회전 디스크 공 촛점 microsco를 사용하여 급성 뇌 슬라이스 문화의 RMS를 따라 그들의 이동을 감시하기위한 세부 프로토콜을 설명평. 일렉트로 널리 배아에서 성인 단계 (14-18)에 발달 연구에 사용됩니다. 그것은 SVZ 신경 전구 세포를 대상으로 조작 할 수있는 강력한 도구입니다 및 형질 전환 모델 1,15,19,20의 바이러스 성 벡터 또는 생성의 정위 주입 저렴하고 상당히 빠른 대안을 나타냅니다. 그것은 수술을 필요로하고 높은 생존율이없는 비교적 간단한 절차입니다. shRNA를 나에 loxP 시스템이 관심의 유전자를 대상으로하거나 SVZ 조상의 영구 라벨을 달성하기 위해, 따라서 성인 신경 연구 (21, 22)를위한 유용한 도구를 나타내는 데 사용할 수 있습니다 채용 마우스 유전자 모델에서 CRE 재조합 효소를 발현하는 플라스미드의 일렉트로.
그대로 뇌 이미징 RMS의 neuroblast 마이그레이션은 여전히 인해 현재 기술적 한계에 도전합니다. 그러나,이 공정은 적당한 SYST 제공 급성 뇌 조각의 촛점 회전 디스크 경과 현미경을 사용하여 모니터링 할 수있다EM은 밀접하게 약물 조작 (23, 24)에 또한 의무가 생체 내 조건을 닮은. 시간 경과 영상과 생체 출생 일렉트로의 커플 링 neuroblast 운동성을 조절하는 분자 메커니즘에 대한 이해를 촉진하고 뇌의 복구를 촉진하기 위해 새로운 접근 방법의 발전에 기여할 것입니다.
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Protocol
이 절차는 영국 홈 오피스 규정 (동물 과학적인 절차의 법, 1986)에 따른다. 과학자들은 설립하고 자신의 기관 및 국가 동물 규제 기관에 의해 승인 된 지침을 따라야합니다.
1. 출생 에레
1.1. 유리 모세 혈관, DNA 솔루션 및 Electroporator의 준비
- DNA의 주입 뽑아 유리 모세관 (0.86 mm : 1.5 mm, ID OD)를 준비합니다. (셔터 P-97 모세관 끌어 당기는에 대한 지표 설정은 다음과 같습니다 : 열 283, 50를 당겨, 속도 (90), 시간 (50)). 약 2 μL의 부피에 해당하는 모세 혈관에 표시를합니다.
- 850 밀리 초 간격 (100 V, 50 밀리 초 ON 펄스, 850 밀리 초, 펄스 5 OFF 펄스)로, 100 V에서 5 평방 펄스, 50 밀리 초 / 펄스 electroporator의 전압을 설정합니다.
- 1-2 ㎍ / μL의 최종 농도 고순도 (OD> 1.80 280분의 260)를 희석하여 독소 프리 플라스미드 DNA독소와 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼 또는 PBS를 무료. 그것은 DNA 용액 (성공적으로 주입했을 때 염료가 뇌실에 확산한다)에 0.1 % 빠른 그린을 추가하는 것이 좋습니다.
- , 5-7 밀리 전극을 준비 전극 젤 가열 패드를 따뜻하게.
1.2. 일렉트로
- 케이지에서 생후 2 마우스 강아지를 제거하고 (~ 0.6 L / min의 유량) 이소 플루 란 흡입으로 마취.
- 약 1 분 후, 다리 핀치 응답을 사용하여 마취 상태를 결정한다. 아무런 움직임이 발생하지 않으면, 뇌 실내 주사를 진행합니다.
- 모세관에 연결 흡입기 튜브를 사용하여 DNA의 1-2 μL 모세관 바늘을 넣습니다.
- 차가운 광원에서 엄지 손가락과 덜 지배적 인 손의 검지 손가락 사이의 강아지의 머리를 잡아. 약간 오른쪽 주입 지점을 식별 할 수 있도록 머리에 피부를 뒤로 당겨.
- 눈과 t 사이에 가상의 선을 고려그는 랜드 마크 람다 (그림 1A)를 craniometric. 람다 (라인 중간 지점에서 약 1 ㎜) 15이 라인의 길이의 3 분의 1에 모세관 바늘을 삽입합니다. 뇌의 깊은 침투를 방지하기 위해 확인하고, 깊이 2mm에 대한 모세관을 삽입합니다.
- 입으로 천천히 불어 플라스미드를 주입 (모세관에 연결된 주사기가 또한 사용될 수있다). 이 성공 플라스미드 주입을 방지 할 수 있습니다으로이 절차를 수행하는 동안, 손가락이 뇌에 너무 많은 압력을 적용하지 있는지 확인합니다.
- DNA 용액의 최소량은 모세관 남아 때 주입을 중지. 그것은 두개 내 압력 해로운 증가를 방지하기 위해보다 1 μl를 주입하는 것이 바람직하다.
- 코트 두 젤 전극과는 DNA가 (그림 1A)를 주입 반구의 측면에서 긍정적 인 측면으로 배치합니다. 에 주동이의 SVZ에 DNA의 설립을위한 장소 전극이 약간 주동이주입 지점. 전극의 위치를 변화 시키면 SVZ 22, 25의 다른 지역에있는 일렉트로의 지역 특이성을 달성 할 수있다.
- 펄스 풋 페달을 눌러 현재의 전송을 시작합니다. 일렉트로가 완료되면 (더 낮은 전압 값이 열악한 전기 천공 효율과 상관 관계 이후 전압 값이 90 V 이하이어야한다) electroporator 디스플레이에 전압을 점검한다.
- 몇 분 동안 가열 패드에 산소에서 강아지를 재 활성화하고 떨어져 어머니를 배치, 케이지로 돌아갑니다. 어머니가 강아지를 검색하고 쓰레기의 나머지와 재결합해야합니다. 일렉트로 후, 다음 단계 전에 4-7일에 대한 자신의 어머니와 함께 새끼를 떠난다.
2. 급성 뇌 슬라이스 문화의 준비
2.1. 솔루션 및 도구 준비
- 다음 용액은 (는 해부 및 이미징 고 글루코스 DMEM을 사용하는 것도 가능하다 필요17)
해부 매체 (500 ㎖)
Gey의 균형 미디어 - 500ML
45 % 포도당 - 5 ㎖
영화 매체 (10 ㎖)
45 % 포도당 - 0.110 ML
HEPES 1 M - 0.100 ML
펜 / Strep의 - 0.100 ML
FCS - 0.500 ML
B27 - 0.100 ML
글루타민 - 0.200 ML
둘 베코 수정 이글 중간 (페놀 레드 무료) - 8.89 ㎖의 - 37 ° C에서 따뜻한 영화 매체
- 배치 밀리 셀은 37 ° C / 5 % CO 2에서 가습 인큐베이터에서 영화 매체와 장소 1 ㎖를 포함하는 35mm 유리 바닥 문화 요리에 삽입합니다.
- vibratome 액세서리 (드라이버, 실, 면도날, 접착제)를 준비합니다.
- 가위, 작은 주걱, 직선 겸자 : 해부 도구를 준비합니다.
- 조각을 처리하기위한 도구를 준비 작은 붓이나 부드러운 접종 루프 (크기 : 10 μL), 플라스틱 파스퇴르 피펫, 아이스 박스와 여러 6cm 플라스틱 접시.
- 해부 매체를 Precool2-4 ° C에서
2.2. 뇌 조각의 준비
- 예냉 해부 매체 6cm 접시를 입력하고 (갓 잘라 조각을 유지하기 위해) 얼음에 놓습니다.
- 자궁 경부 전위 다음, 마우스 강아지 목을 벨 가위를 사용합니다. , 메스로 두피를 제거 소뇌에 OB에서 중간 시상 봉합 따라 두개골을 잘라 조심스럽게 집게를 사용하여 두개골 뚜껑을 제거합니다. 뇌 전체가 노출되어 있는지 확인하고 신중하게 조직을 손상하지 않도록 특별한주의를 가지고, 주걱을 사용하여 해부. 절개는 신중하게 수행되어야하지만 동시에 매우 신속하게 (가능한 분 미만). 약물 / 가스 마취제와 터미널 마취가 neuroblasts과 동물의 희생을 다음과 같은 상대적으로 신속하게 이미지화 할 필요가 뇌 슬라이스 문화의 건강한 상태의 이동성 특성에 영향을 미칠 수 있기 때문에 경추 탈구는 우리가 선호하는 방법입니다.
- 말이 맞아 함께 뇌를 Hemisect또는 블레이드 (그림 2). uninjected 반구를 폐기하거나 다른 실험을 위해 사용합니다.
- vibratome 홀더 테이프의 작은 조각을 놓고 그 위에 뇌 반구 (그림 2)를 연결하는 접착제의 최소한의 필요한 양을 사용합니다. 이는 반복되는 접착제 응용 프로그램에 홀더 표면의 손상을 방지 할 수 있습니다.
- 접착제가 몇 초 동안 건조시킵니다.
- 예냉 해부 솔루션으로 가득 vibratome 트레이에 홀더를 배치합니다. 잎으로 후각 망울 (그림 2)를 가리 킵니다.
- 적절한 설정을 사용하여 뇌의 반구를 절단 시작합니다. 다음 매개 변수를 사용하는 것이 좋습니다 : 슬라이스 두께 300 μm의, 속도 ~ 3-5, 주파수 ~ 9. 높은 주파수와 낮은 속도는 슬라이스의 손상을 방지하는 것이 좋습니다.
- 작은 붓이나 부드러운 접종 루프를 사용하여 조각을 수집합니다. 만 볼 수 OB (보통 2 ~ 3 조각 / 뇌)로 조각을 유지합니다. 일반적으로 RMS의 대부분을 포함하는 슬라이스는 캘리포니아N 바닥면에서 ~ 300 μm의에서 찾을 수.
- (양쪽면에 형광을 확인을 뒤집어 확인하는) GFP 신호에 대한 표준 형광 현미경으로 조각을 확인하고, RMS의 대부분을 따라 밝은 형광을 나타내는 사람을 선택합니다.
2.3. 배양 뇌 조각
- 세포 배양 후드에서, 뇌 슬라이스의 가장 꼬리 제를 버려야 정밀 직선 핀셋이나 미세 절제 메스를 사용하는 접착제의 흔적을 제거합니다.
- 섬세 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 슬라이스를 대기음 (더 큰 구멍을 만드 피펫의 끝을 잘라을,이 조각의 손상을 방지한다) 및 삽입 데워진 밀리 셀의 중앙에 놓습니다.
- 밝은 형광 신호면이 밀리 셀은 (거꾸로 현미경과 영상을 위해) 삽입과 접촉에 배치되어 있는지 확인합니다.
- 피펫 삽입물의 상단에 초과 해부 솔루션을 제거합니다.
- 에 슬라이스 문화를 남겨이미징 전에 적어도 1 시간 동안 37 ° C / 5 % CO 2 배양기에 정착.
3. Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상
- 적어도 2 시간 이미징 전에 상수로 설정 하마 마츠 C10600-10B (ORCA-R2)의 디지털 CCD 카메라를 냉각 퍼킨 엘머 UltraViewVoX 공 촛점 회전 디스크 시스템, 반전 니콘 티-E 현미경 및 난방 시스템 (솔 렌트 과학)를 켭니다 37 ° C의 온도
- Volocity 소프트웨어 획득 모듈을 열고 "즉"버튼을 클릭 이미징 레이저 (들)을 선택합니다.
- 뇌 슬라이스 제제 2 시간 이내에, 현미경 스테이지 촬상 챔버 뇌 슬라이스를 포함하는 유리 바닥 접시를 배치.
- 이미지를 만들 조각의 영역 (예를 들어, 그냥 주사 부위 후 RMS의 첫 번째 하강 부분, 또는 ELBO을 선택하고 초점을 적절한 형광등 아래에서 니콘 CFI 슈퍼 계획 형석 ELWD 20X/0.45 목표를 사용RMS의 지역 W, 또는 neuroblasts가 OB를 입력하기 전에 팔꿈치 후).
- 다음 작업으로 시간 경과 영상을 설정합니다 :
- 현미경에서 샘플의 레이저 스캐닝을 허용하도록 L100 버튼을 클릭합니다.
- Volocity에서 적절한 레이저 (GFP에 대한 예를 들어, 488 nm의 레이저)를 선택하여 UltraVIEW 레이저 체인저를 엽니 다.
- 형광 신호의 강도에 따라 노출 시간 (일반적으로 100 ~ 500 밀리 초 사이) 및 레이저 강도 (일반적으로 20 ~ 30 %)을 설정한다.
- 세포의 시각화를 개선하기 위해 이미지를 디지털 게인을 조정합니다.
- 뇌 조각 내부의 이미지에 Z-스택 간격 (보통 이상 100 ~ 120 μm의 간격)을 선택합니다. (이것은 이후의 추적 분석을 용이하게한다)를 최대한 중첩 가능한 피하기 절연 세포의 적절한 개수와 간격을 선택한다.
- 각각의 Z-스택 이미지 (보통 2-4 μm의) 사이의 간격을 선택합니다.
- 시간 INT 선택각각의 Z-스택 캡처 (예 : 3 분) 및 총 이미징 기간 (예 : 3 시간) 사이 erval.
- 영상 매개 변수에 대한 변경 사항을 저장하기 위해 "저장"아이콘을 클릭합니다.
- 영상을 시작 녹음 버튼을 누릅니다.
- 제어 및 실험 샘플의 다른 영상 같은 날에 걸쳐 (예를 들어, 차량 / 약물 치료 또는 다른 일렉트로 플라스미드에 대한).
4. Neuroblast 마이그레이션 분석
- Volocity 정량 모듈에서 시간 경과 실험을 완료 한 후 생성 된 원하는 라이브러리를 엽니 다. 왼쪽 상단 상자 (그림 4A, 단계 1)에서 "확장 포커스"를 선택합니다.
- (그림 4A, 2 단계) 측정 창을 표시하려면 "측정"탭을 클릭합니다.
- 작업 목록이 화면의 왼쪽 하단에 표시됩니다. 드래그 "트랙"( "기타"에서 현재는 하단에 제목위의 공간에있는 목록). 이 화면의 왼쪽 상단 부분에서 "트랙"이라는 새로운 창 열기 (그림 4A, 3 단계)를 묻는 메시지가 표시됩니다.
- 트랙 창에서 "입력"탭 (그림 4A, 4 단계)에서 "포인트"를 선택합니다.
- 포인트 도구에 (그림 4A, 5 단계)를 클릭합니다.
- 전지 본체의 중앙 영역에 마우스로 클릭하여 마이그레이션 neuroblast 추적을 시작하고 시간 경과의 마지막 시점까지 세포의 움직임을 추적하는 것을 계속할 도달 (3 시간 길이의 영화에 대한 예를 포인트 번호 (61)) .
- 데이터 선택 얻으려면 측정 메뉴 (그림 4B, 6-7 단계)에서 "측정 항목을 확인합니다." 창은 화면의 중앙에 표시됩니다.
- 이 창에서 "라는 새로운 측정 항목 :"를 선택하고 (그림 4C, 8 단계)의 이름을 입력합니다. 홍보 전에 "모든 timepoints"옵션을 선택해야합니다싱 OK (그림 4C, 9 단계). 측정 항목 파일은 시간 경과 파일 아래에 나타납니다 및 정량 분석을위한 매개 변수 (예 : 마이그레이션 거리, 속도, 변위, 변위 속도)가 포함됩니다.
- 창 (그림 4D, 10 단계)로 열 측정 항목 파일을 두 번 클릭합니다.
- 분석 세포의 하나의 트랙을 시각화 "디스플레이"옵션 (그림 4D, 11 단계)에서 "트랙 포인트"를 선택합니다.
- 오른쪽 측정 항목 파일을 클릭 한 다음 마이그레이션 매개 변수를 분석 할 수있는 엑셀 같은 프로그램에서 가져올 수있는 텍스트 파일로 내 보냅니다.
- , 촬영 기간 동안 각 셀에 의해 측정 항목 파일에서 "디스플레이"옵션 "포인트"또는 "집단"에서 선택 (모든 트랙이 고유 한 ID를 가지고) ID를 클릭 연속 프레임과 일시 정지 사이의 움직임을 측정합니다. 진행에 의해 생성 된 파일을 내 보냅니다단계 4.10에 설명 된대로 보내고.
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Representative Results
SVZ에서 파생 된 철새 neuroblasts의 레이블은 보통 4~8일 성공적인 일렉트로 (그림 1B) 후, RMS 함께 관찰 할 수있다. 긴 시간의 가볼만한 곳으로는 선택 될 수있다, 그러나 대부분은 OB를 입력 때문에 적은 세포는 RMS에서 찾을 수 있습니다. Neuroblasts 정도 2~3주 일렉트로 후 (도시하지 않음) OB에서 성숙 과립 세포의 전형적인 형태와 기능을 습득 시작합니다. ~ 1 시간 동안 배양 한 후, 일렉트로 마우스 새끼의 뇌 조각은 안정적으로 최대 3 ~ 4 시간 동안 몇 군데하실 수 있습니다. 이전에 23, 26를보고, neuroblasts 양적 세포 추적 (그림 4)를 사용하여 분석 할 수있다 (그림 3 및 비디오 1) 복잡한 마이그레이션 역학을 표시 할 수 있습니다.
그림 1. Postna 탈 생체 일렉트로. (A) 생후 2 마우스 강아지의 생체 전기 천공의 개략도 그림. craniometrical 랜드 마크 람다에 눈을 연결하는 점선 (적색) 모세관 삽입 위치 마커로 사용됩니다. 주입 지점은 녹색 점으로 표시됩니다. Boutin 등의 설명에 따라 회색 타원형 모양은 전극의 위치를 나타냅니다. 15 (B) 시상 마우스 전뇌 조각은 5 일 GFP를 발현하는 플라스미드의 일렉트로 후 GFP에 대한 면역 염색. SVZ 파생 마이그레이션 neuroblasts는 RMS를 따라 볼 수 있으며 그들 중 일부는 OB에 도달하기 시작했습니다. CTX : 피질, SVZ : subventricular 영역, RMS : 주동이의 철새 스트림, OB : 후각 망울. 바, 400 μm의는. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 2. 영상 급성 뇌 슬라이스 문화의 준비 도식 단계. (A) 꼬리와 intrahemispheric 인하 (점선)은 갓 해부 뇌에서 수행됩니다. (B) 일렉트로 뇌 반구가 vibratome 홀더에 배치됩니다. (C) 시상 슬라이스는 vibratome 얻을 및 표준 형광 현미경으로 관찰 최고의 GFP 신호. (D) 조각은 유리 바닥 접시 내부에 삽입하고 (E) 이후에 디스크 시스템을 회전 반전 공 촛점으로 이미징을위한 환경 챔버에 배치 밀리 셀에 최소 1 시간 동안 배양한다. 여기를 클릭하십시오 더 큰 이미지를 볼 수 .
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그림 3. neuroblasts 마이그레이션의 시간 경과 영상. (A) 5 일 GFP를 발현하는 플라스미드의 일렉트로 후 마우스 시상 뇌 조각에서 촬영 neuroblasts의 회전 디스크 시간 경과 이미지. 이미지는 떨어져 1 시간이다. 각 패널은 4 μm의 간격 28 연속 이미지의 Z-스택 투사입니다. 화살촉이 (오른쪽 하단 모서리에있는 그림의 위치) 후각 망울쪽으로 RMS를 따라 이주 사 대표 neuroblasts를 나타냅니다. (B) 4 neuroblasts의 시간 경과 영상에서 얻은 대표적인 철새 경로 (A)에서 강조했다. (C) 그래프 2 대표 neuroblasts하여 시간과 이주의 거리를 표시합니다. 세포는 일반적인 약진 운동성 동작을 표시합니다. 바, 70 μm의는. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. neuroblasts 마이그레이션의 추적 분석. Volocity 소프트웨어를 사용하여 마이그레이션 neuroblasts을 추적하는 데 사용 순차적 단계. 자세한 설명은 텍스트를 참조주십시오. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
영상 1. 이주 neuroblasts의 시간 경과 영상이 영화는 GFP를 발현하는 플라스미드의 일렉트로 후 5 일 획득 GFP - 라벨 마이그레이션 neuroblasts와 마우스 RMS의 섹션을 보여줍니다. OB는 오른쪽 하단 모서리쪽으로보기 밖으로 있습니다. 공 촛점 Z-스택은 20 배 목표 120 μm의 간격 동안 3 시간마다 3 분으로 회전하는 디스크 공 촛점에 포착되었다. 10 프레임 / 초 : 재생 속도.
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Discussion
RMS를 따라 신경 전구 세포의 효율적인 마이그레이션 기능 신경 (10)에 자신의 후속 성숙을 보장합니다. OB 향하는 신경 전구 세포의 탁월한 스트림은 인간의 초기 단계에 볼 수 있습니다 초기 출생 후의 인간의 두뇌 발달 (27)에 중요한 역할을 할 가능성이있다. 또한,이 세포는 손상과 신경 퇴행의 4,28에 의해 영향을받는 뇌의 사이트를 대상으로 할 수 있습니다. 실시간으로 neuroblast 역학에 유전자 조작의 효과를 모니터링 할 수 있다는 것은 완전히 neuroblast 이동이 안내 및 규제 방법을 이해하는 것이 필수적이된다.
여기에서 우리는 급성 뇌 슬라이스 문화의 시간 경과 공 촛점 회전 디스크 현미경과 생체 출생 일렉트로을 결합하여 SVZ 파생 neuroblast 마이그레이션을 모니터링하는 프로토콜을 설명했다. 특히, 우리는 신경 전구 세포를 마이그레이션하는 것은 SVZ에서 플라스미드 ENC를 electroporating으로 표시 할 수있는 방법을 보여 주었다GFP를 과다 복용. 연구의 목적에 따라, 여러 종류의 플라스미드 (예, 다른 형광 단백질 또는 함께 형광 단백질과 야생형 / 또한, CRE 재조합 효소 또는 shRNA를 돌연변이 단백질의 동시 발현의 발현을 허용하는)이 사용될 수있다. 우리는 강력하게 생체 내 발현을위한 닭고기 베타 굴지의 CAG 프로모터 (29)를 포함하는 플라스미드를 사용하는 것이 좋습니다. 일렉트로 동물로부터 얻은 뇌 조각의 영상은 또한 일렉트로 30 이후 장시간 포인트 (7-10 일)에 OB에서 신경 전구 세포의 반경 방향 이동을 모니터링하기 위해 사용될 수있다.
연습의 초기 기간 후에, 생체 내 출생의 일렉트로는 시간 경과 이미징 및 면역 형광 분석 모두에 대해 강력한 neuroblast 라벨을 허용, 매우 신뢰할 수있는 방법이됩니다. 또한,이 기술은, neuroblast 특정 프로모터 하에서 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스 이상의 기본적인 장점을 구비neuroblasts의 대부분이 표시되는 곳. 사실, 일렉트로 따라서 자신의 형태 및 마이그레이션 역학의 상세한 분석을 가능하게 neuroblasts의 스파 스 라벨 수 있습니다. 바이러스 성 벡터 (31)의 정위 전달에 비해이 기술은 빠르고, 저렴하고 아주 잘 마우스 새끼 용납된다. 주요 단점은 출생 초기 단계에 한정된다는 사실로 구성된다. 우리는 바이러스 성 전달 방법 (31)에 더 적합하게하기 번에 표시 효율에 상당한 감소를 관찰하기 때문에 실제로, 우리는 강력하게, 생후 2 마우스 새끼를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나, 적절한 마우스 유전자 모델에서 CRE 발현 플라스미드의 일렉트로 같은 전략이 성인에 신경을 연구하는 데 사용할 수는 22 스테이지.
이광자 표준 촛점, 스피닝 디스크 공 촛점 및 광 시야 형광 현미경 모두 neuroblast 이주 17,23,24을 시각화 할 수있다. 회전 디스크 콘초점 현미경은 두 개의 광자 현미경에 싼 대안이다. 그것은 표준 공 초점 현미경에 비해 photobleaching에 넓은 필드 형광 이미징 31-33보다 더 높은 해상도를 제공하는 제한, 다 Z 평면을 통해 고속으로 3D 이미징을 허용한다. 마이그레이션 neuroblasts의 대부분은 명확하게 볼 수 소마와 성장 콘 스쳐 매우 역동적 인 주요 프로세스가.
기타 (17)에 의해 설명 된 바와 같이, 관류 챔버를 갖는 직접 동일한 뇌 슬라이스 제어 및 약물 치료의 효과를 평가하는 것을 허용한다. 우리는이 중요한 이점 고려하지만, 여기에서 설명하는 프로토콜은 산소 인공 뇌척수 (ACSF) 또는 높은 혈당 DMEM 17,33와 조각을 perfuse하는 세포 생존을 위해 절대적으로 필요하지 않습니다 것을 보여줍니다. 또한, 거꾸로 현미경을 사용하여 침수 목표에 장착 된 수직 현미경에 비해 쉽게 목적을 조작 할 수 있습니다.우리는 20X 장거리 목표를 사용하여 세포의 좋은 숫자 (조각 당 보통 25 ~ 40)의 추적을 가능하게하고 좋은 해상도의 이미지 (동영상 1) 생산, 최적의 타협 것으로 나타났습니다. 자동 추적은 그러나 항상 신뢰할 수없고, 또한 가능하다. 이러한 이유로 우리는 시각과, 필요한 경우, 자동 추적 데이터를 수동으로 확인하는 것이 좋습니다. 단일 neuroblasts의 고배율 이미징은 니콘 형석 DIC M/N2 40X/0.80W 목적을 사용하여 수행 될 수있다. MTrackJ 또한 기본 트랙 통계 (33)를 측정하는데 사용될 수있는 개방 ImageJ에 플러그인은, 그러나 일부 원시 데이터 수집 파일이 소프트웨어와 호환 할 수 있으며, 어떤 경우에는 시간이 소모 될 수있는 분석에 적합한 포맷으로 변환 될 필요가있다 . Volocity 소프트웨어가 제공하는 이미지 수집 및 분석 모듈의 조합은 허용 철새 매개의 정량 분석에 대한 이미지 캡처 / 처리에서 즉시 전환쉽게 그래프의 다양한 시각하실 수 있습니다 TERS (속도, 변위 등), (이주 패턴 / 거리 / 방향성 / 속도 / 지속 / 시간을 보여주는 예 등, 부동 소요).
Neuroblasts는 고정 단계 (34, 35) (그림 3C)에 철새를 교대로 약진 운동을 표시합니다. 정지상은 4-10 분 (32) 사이가 될 수 있다는 사실에 비추어, 우리는 이미지마다 3 분을 캡처하는 최소 조명 및 광 손상으로 neuroblasts 마이그레이션을 수행하는 것이 타협을 나타내고 있다고 생각합니다. 우리는 거의 3 시간 동안, 그들은 일반적으로 30 분 부동의 평균을 보내고, 세포가 이상 6 분 동안 중지를 참조하지 않고, 그것을 찾을 수 있습니다. 이전 보고서에 따르면, neuroblasts은 우리의 관찰과 일치되는, 약간 0.6 23,36 위, 60 ~ 100 μm의 / 시간의 평균 속도와 평균 사행 지수 (마이그레이션 된 거리에 따라 실제 변위)가있다. Typic동맹, 세포의 약 60 %는 "철새"동작을 보여줍니다 (예 : 0.6-1 사이의 구불 구불 한 지수로, 거의 선형 마이그레이션 경로를 따라) 및 20 % ~ 25 %는 (0-0.4 사이의 구불 구불 한 인덱스) "탐험"입니다 나머지 ~ 20 % (0.4 ~ 0.6 사이의 구불 구불 한 인덱스 철새 및 탐색 단계 교대) "중간"으로 분류 할 수있다.
우리는 그들의 운동에 상당한 변화를 준수하지 않고보다 3 ~ 4 시간 동안 neuroblasts 필름 할 수 없기 때문에 우리는이 기술에 제한이 여전히 있다는 것을 인식하고 있습니다. 촬영 기간은 촬상 주파수 (그러나 이것은 마이그레이션 분석의 정확도에 영향을주는 것)뿐만 아니라 이미징을위한 환경 조건을 최적화하는 관류 챔버를 채용을 하강시킴으로써 증가 될 수있다. 그러나, 프로토콜은 3-4 시간 촬상 기간의 정량 분석을위한 충분한 데이터의 수집을 가능하게하는 적절한 타협을 나타내는 등 기재마이그레이션. 사실, 지금까지 우리는 적절한 컨트롤 (Sonego과 만주국, 게시되지 않은 결과)에 비해 후 단백질 과발현 / 하향 조절 (37)에 의해 또는 약리 조작에 의해 이전에 생성 된 효과를 검출하는 데 성공했다.
결론적으로, 뇌 슬라이스 문화의 회전 디스크 이미징과 생체 내 출생의 일렉트로의 조합은 깊이 조절하는 분자 메커니즘을 조사 할 수있는 가능성을 제공하고, 밀접하게 생체 내 환경을 닮은 시스템에 neuroblast 이동의 역학을 모니터링 할 수있는 강력한 도구를 나타냅니다 운동을 neuroblast.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
MS와 YZ는 KCL과 KCL 중국 박사 studentships에 의해 지원된다. MO는 생물 공학 및 생물 과학 연구 협의회의 박사 과정 학생이기 의해 투자되었다. 우리는 일렉트로에 귀중한 조언을 마사루 오카베 및 월 이치 미야자키 PCX-EGFP 플라스미드 및 알랭 Chedotal와 아테나 입실 랜티 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's Balanced media | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucose, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (phenol red-free) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Glass capillaries for injection | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Aspirator tube | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 capillary puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Footswitch Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel for electrodes | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX spinning disk system | Perkin Elmer | Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Acquisition, Quantitation, Visualization Modules | |
| Environmental chamber for microscopy | Solent Scientific | Custom-made | |
| Ti-E inverted microscope | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper |
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