Summary
Neuroblast migratie is een fundamentele gebeurtenis in postnatale neurogenese. We beschrijven een protocol voor efficiëntie-etikettering van neuroblasts door in vivo postnatale elektroporatie en de daaropvolgende visualisatie van hun migratie met behulp van time-lapse imaging van acute hersenen plakjes. Wij beschikken over een beschrijving van de kwantitatieve analyse van neuroblast dynamiek door video-tracking.
Abstract
Subventriculaire zone (SVZ) is een van de belangrijkste neurogene niches in de postnatale hersenen. Hier, neurale voorlopercellen vermenigvuldigen en aanleiding geven tot neuroblasts staat langs de rostrale migratie stroom (RMS) te verplaatsen naar de bulbus olfactorius (OB). Deze lange-afstand migratie vereist voor de daaropvolgende rijping van pasgeboren neuronen in de OB, maar de moleculaire mechanismen reguleren deze taak zijn nog onduidelijk. Het onderzoeken van de signaalwegen leidend neuroblast beweeglijkheid kan niet alleen helpen begrijpen een fundamentele stap in neurogenese, maar ook therapeutisch regeneratief potentieel, gezien het vermogen van deze neuroblasts hersenen plaatsen aangetast door verwonding, beroerte, of degeneratie richten.
In dit manuscript beschrijven we een gedetailleerd protocol voor in vivo postnatale elektroporatie en de daaropvolgende time-lapse imaging van neuroblast migratie in de muis RMS. Postnatale elektroporatie kan efficiënt transfecteren SVZ voorlopercellencellen, die op hun beurt neuroblasts migreren langs de RMS. Met behulp van confocale draaiende schijf time-lapse microscopie op acute hersenen slice culturen, kan neuroblast migratie worden bewaakt in een omgeving die gelijkenis vertonen met de in vivo toestand. Bovendien kan neuroblast beweeglijkheid worden gevolgd en kwantitatief geanalyseerd. Als voorbeeld beschrijven we hoe in vivo postnatale elektroporatie van een GFP-expressie plasmide gebruiken labelen en visualiseren neuroblasts migreren langs de RMS. Elektroporatie van shRNA of CRE-recombinase tot expressie plasmiden conditionele knockout muizen onder toepassing van de LoxP systeem kan ook worden gebruikt om genen van belang richten. Farmacologische manipulatie van acute hersenen slice culturen kunnen worden uitgevoerd om de rol van verschillende signaalmoleculen in neuroblast migratie te onderzoeken. Door de koppeling van in vivo elektroporatie met time-lapse imaging, hopen we de moleculaire mechanismen die neuroblast beweeglijkheid te begrijpen en bij te dragen tot de ontwikkeling vanling van nieuwe benaderingen herstelmechanismen in de hersenen te bevorderen.
Introduction
In de hersenen van zoogdieren, de generatie van nieuwe neuronen (neurogenese) plaatsvindt na de geboorte voornamelijk in twee gebieden, de subventriculaire zone (SVZ) van de laterale ventrikels en de subgranulaire zone in de dentate gyrus van de hippocampus 1. Verzameld in de afgelopen jaren aanzienlijk bewijs ondersteunt een cruciale rol voor postnatale neurogenese in de hippocampus en het reukorgaan geheugenfuncties 1-3. Belangrijk postnatale neurogenese heeft ook therapeutisch potentieel vanwege de relatie met degeneratieve neurologische aandoeningen, en het vermogen van neuroblasts te migreren naar gewonde gebieden in de hersenen 4-6.
Subventriculaire zone (SVZ) is onlangs naar voren gekomen als een cruciale neurogene niche. SVZ-afgeleide neuroblasts migreren naar de bulbus olfactorius (OB) via de rostrale migratie stroom (RMS), waardoor dit de langste migratieproces in de postnatale hersenen 1,7,8. De zoogdieren SVZ / RMS / OB systeem is uitgegroeid tot eenbruikbaar model voor verschillende stappen in neurogenese, bijvoorbeeld proliferatie, migratie en differentiatie 1,8 bestuderen. Veel groeifactoren en extracellulaire signalen reguleren SVZ neurogenese en migratie langs de RMS, maar de intracellulaire moleculaire mechanismen lang niet volledig begrepen 1,9. Juiste migratie langs de RMS is cruciaal voor de verdere rijping van pasgeboren neuronen 10. Daarnaast hebben sommige studies aangetoond dat SVZ-afgeleide neuroblasts kunnen migreren uit de RMS om hersenletsel locaties 4-6,11-13. Zo onderzoekt de signalerende mechanismen betrokken neuroblast migratie is niet alleen essentieel om neurogenese te begrijpen, maar ook voor potentiële therapeutische toepassingen.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor SVZ neurale voorlopercellen labelen door in vivo postnatale elektroporatie en het toezicht op hun migratie langs de RMS in acute hersenen slice culturen met behulp van time-lapse draaiende schijf confocale microscopy. Elektroporatie wordt veel gebruikt in de ontwikkelings-studies uit embryonale naar volwassen stadia 14-18. Het is een krachtig hulpmiddel te richten en te manipuleren SVZ neurale voorlopercellen en vertegenwoordigt een aanzienlijk goedkoper en sneller alternatief stereotactische injectie van virale vectoren of genereren van transgene modellen 1,15,19,20. Het is een relatief eenvoudige procedure die geen chirurgie nodig en heeft een hoge overleving. Elektroporatie van shRNA of CRE-recombinase tot expressie plasmiden muizen genetische modellen gebruik van de LoxP systeem worden gebruikt om genen van belang richten of permanente etikettering van SVZ voorlopers bereiken, zodat aan een nuttig instrument voor volwassen neurogenese studies 21,22.
Imaging RMS neuroblast migratie in de intacte hersenen is nog steeds een uitdaging te wijten aan de huidige technische beperkingen. Echter, dit proces kan worden gecontroleerd met behulp van confocale draaiende schijf time-lapse microscopie van acute hersenen plakjes, die een geschikte syst biedenem gelijkenis vertonen met de in vivo toestand ook vatbaar zijn voor farmacologische manipulatie 23,24. Koppeling in vivo postnatale elektroporatie met time-lapse imaging zal het begrip van de moleculaire mechanismen die neuroblast beweeglijkheid vergemakkelijken en bijdragen tot de ontwikkeling van nieuwe benaderingen om de hersenen te repareren te promoten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze procedure is in overeenstemming met de UK Home Office Verordeningen (Animal Wetenschappelijke Procedures Act, 1986). Wetenschappers zouden de gevestigde en door hun institutionele en nationale dier regelgevende organisaties goedgekeurde richtlijnen te volgen.
1. Postnatale Elektroporatie
1.1. Voorbereiding van de Glass-capillairen, DNA Solution en Electroporatie
- Bereid getrokken glas haarvaten (OD: 1,5 mm, ID: 0.86 mm) voor DNA-injectie. (Indicatieve instellingen voor een Sutter P-97 capillaire puller zijn: Heat 283; Trek 50; Velocity 90; Time 50). Een markering op de capillaire overeenkomt met een volume van ongeveer 2 ui.
- Stel de spanning van de elektroporator tot 5 rechthoekimpulsen, 50 msec / puls bij 100 V, 850 msec intervallen (100 V, 50 msec puls ON, OFF puls 850 msec puls 5).
- Verdun hoge zuiverheidsgraad (OD 260/280> 1.80) endotoxinevrij plasmide-DNA tot een uiteindelijke concentratie van 1-2 ug / ulmet endotoxine vrij Tris-EDTA-buffer of PBS. Het wordt aanbevolen om 0,1% Fast Green aan de DNA-oplossing (de kleurstof moet verspreid in de ventrikel als succesvol geïnjecteerd).
- Bereid de 5-7 mm elektroden, de elektrode gel en opwarmen van de verwarming pad.
1.2. Elektroporatie
- Verwijderen postnatale dag 2 muis pup van kooi en verdoven door isofluraan inhalatie (met een stroomsnelheid van ~ 0,6 L / min).
- Na ongeveer 1 minuut, wordt de actuele verdoving het voetpedaal pinch respons. Als er geen beweging optreedt, doorgaan met intraventriculaire injectie.
- Laad capillaire naald met 1-2 ul van DNA met behulp van een beluchtingsbuis aangesloten op het capillair.
- Onder een koude lichtbron, houdt u de kop van de pup tussen duim en wijsvinger van je minder dominante hand. Iets trek de huid weer op de kop om de identificatie van de juiste injectie punt helpen.
- Overweeg een denkbeeldige lijn tussen het oog en thij craniometric oriëntatiepunt lambda (Figuur 1A). Steek de capillaire naald ongeveer eenderde van de lengte van de lijn van de lambda (ongeveer 1 mm van het middelpunt lijn) 15. Plaats de capillaire ongeveer 2 mm diep, en zorg ervoor dat diepe penetratie in de hersenen voorkomen.
- Injecteer plasmide door langzaam blazen door de mond (een spuit verbonden met het capillair kan worden gebruikt). Tijdens deze procedure, zorg ervoor dat uw vingers niet toepassen van te veel druk op de hersenen, omdat deze succesvolle plasmide injectie kan voorkomen.
- Stop injectie wanneer een minimale hoeveelheid DNA-oplossing in de capillair. Het is raadzaam om minder dan 1 pi injectie op nadelige toename van intracraniale druk te voorkomen.
- Coat beide elektroden met gel en plaats ze met de pluskant aan de laterale zijde van de halve bol waar het DNA werd geïnjecteerd (Figuur 1A). Voor het DNA van de rostrale SVZ, plaats elektroden iets rostraal van deinjectiepunt. Variërend elektrode positie kan regionale specificiteit van elektroporatie te bereiken in verschillende gebieden van de SVZ 22,25.
- Initiëren huidige overdracht door op de pols voetschakelaar. Wanneer de elektroporatie is voltooid, controleert de spanning op de elektroporator scherm (spanningswaarden mag niet lager zijn dan 90 V, aangezien lagere spanningswaarden correleren met een slechte elektroporatie efficiëntie).
- Reanimeren de pup onder zuurstof op verwarming pad voor een paar minuten en terug te sturen naar de kooi, waardoor het uit de buurt van de moeder. Zorg ervoor dat de moeder haalt de pup en herenigt met de rest van het nest. Na elektroporatie, laat pups met hun moeder voor 4-7 dagen voor de volgende stap.
2. Voorbereiding van de Acute Brain slice culturen
2.1. Bereiding van oplossingen en tools
- De volgende oplossingen zijn (het is ook mogelijk om hoog glucose DMEM gebruiken ontleden en imaging17):
Dissectie Medium (500 ml)
Gey's gebalanceerde media - 500ml
45% Glucose - 5ml
Film medium (10 ml)
45% Glucose - 0.110 ml
HEPES 1 M - 0.100 ml
Pen / Strep - 0.100 ml
FCS - 0.500 ml
B27 - 0.100 ml
Glutamine - 0.200 ml
Dulbecco Modified Eagle Medium (fenol rood-vrij) - 8.89 ml - Warm-up film medium bij 37 ° C.
- Plaats Millicell voegt in een 35 mm glazen bodem cultuur schotel met 1 ml medium film en plaats in een bevochtigde incubator bij 37 ° C / 5% CO 2.
- Bereid vibratome accessoires (schroevendraaier, kamer, scheermesjes, lijm).
- Bereid dissectie-instrumenten: schaar, kleine spatel, rechte tang.
- Bereid je gereedschappen voor het omgaan met plakjes: kleine kwast of zachte entnaald (grootte: 10 pl), plastic pasteurpipetten, een ice box en diverse 6 cm plastic schaaltjes.
- Precool de dissectie mediumbij 2-4 ° C.
2.2. Voorbereiding van Brain Slices
- Vul een 6 cm schotel met voorgekoeld dissectie medium en plaats het op het ijs (naar vers gesneden plakjes te houden).
- Na cervicale dislocatie, met een schaar om de muis pup onthoofden. Verwijder de hoofdhuid met een scalpel, snijd de schedel langs de mid-pijlnaad van de OB naar het cerebellum en verwijder voorzichtig de craniale flappen behulp van een tang. Zorg ervoor dat de gehele hersenen is blootgesteld en zorgvuldig ontleden met behulp van een spatel, waarbij speciale zorg het weefsel niet beschadigt. De ontleding moet zorgvuldig gebeuren maar tegelijkertijd zeer snel (minder dan een minuut indien mogelijk). Cervicale dislocatie is onze voorkeur omdat terminal anesthesie met drugs / gas anesthetica de trekkende eigenschappen van de neuroblasts en de gezonde toestand van de hersenen slice culturen, die moeten relatief snel worden afgebeeld na het offeren van dieren kan beïnvloeden.
- Hemisect de hersenen met een razof blade (figuur 2). Gooi uninjected halfrond of gebruiken voor andere experimenten.
- Leg een stukje tape op de vibratome houder en gebruik de minimale benodigde hoeveelheid lijm op de hersenhelft erbovenop (figuur 2) bevestigen. Dit voorkomt beschadiging van het houderoppervlak door herhaalde lijm toepassingen.
- Laat de lijm drogen voor een paar seconden.
- Plaats de houder in de vibratome dienblad gevuld met voorgekoelde dissectie oplossing. Richt de bulbus olfactorius naar het mes (Figuur 2).
- Begin het snijden van de hersenhelft met behulp van geschikte instellingen. De volgende parameters worden aanbevolen: plakdikte 300 micrometer; snelheid ~ 3-5; frequentie ~ 9. Hoge frequentie en lage snelheid wordt aangeraden om schade aan de slice te voorkomen.
- Verzamel plakjes met behulp van een klein penseel of een zachte entnaald. Alleen houden plakjes met zichtbare OB (meestal 2-3 plakjes / hersenen). Typisch, het segment met de meeste RMS can te vinden op ~ 300 micrometer van het bodemoppervlak.
- Controleer plakjes onder een standaard fluorescentiemicroscoop voor GFP signaal (en zorg ervoor dat ze omdraaien om de fluorescentie te controleren aan beide kanten), en kies degene die toont heldere fluorescentie langs het grootste deel van de RMS.
2.3. Het kweken van Brain Slices
- In een celkweek kap, weggesneden de meest caudale derde van de hersenen slice en lijm sporen met behulp van fijne rechte pincet of een microdissection scalpel verwijderen.
- Fijn zuig het schijfje met een plastic Pasteur pipet (snijd de punt van de pipet om een grotere opening creëren, zal dit voorkomen dat schade aan de slice) en plaats het op het midden van een voorverwarmde Millicell insert.
- Controleer de kant met de helderste fluorescerende signaal wordt in contact gebracht met de Millicell invoegen (beeldvorming met een omgekeerde microscoop).
- Verwijder overtollig dissectie oplossing op de top van de insert met een pipet.
- Verlaat slice culturenvestigen in een 37 ° C / 5% CO2 incubator voor tenminste 1 uur voor de beeldvorming.
3. Time-lapse beeldvorming van neuroblast Migratie
- Ten minste 2 uur voor de beeldvorming, zet de Perkin Elmer UltraViewVoX confocale draaiende schijf systeem, omgekeerde Nikon Ti-E microscoop, Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2) gekoelde digitale CCD-camera, en verwarmingssysteem (Solent Scientific) ingesteld op de constante temperatuur van 37 ° C.
- Open de Volocity software Acquisitie module en klik op "Viz" knop en selecteer de laser (s) voor de beeldvorming.
- Binnen 2 uur van de hersenen slice voorbereiding, plaats de glazen bodem schaaltje met de hersenen slice in de beeldvorming kamer op de microscoop podium.
- Gebruik een Nikon CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 doelstelling onder de geschikte tl-licht aan de oppervlakte van het segment dat zal worden afgebeeld (bijvoorbeeld de eerste dalende deel van de RMS net na de injectie, of de Elbo selecteren en focusw regio van de RMS, of net na de bocht voordat neuroblasts voer de OB).
- Stel de time-lapse imaging met de volgende acties:
- Op de microscoop, klik op de L100 knop om laser scanning van het monster mogelijk te maken.
- In Volocity, opent u de Ultra VIEW Laser Changer door de juiste laser (bijv. 488 nm laser voor GFP).
- Stel de belichtingstijd (gewoonlijk tussen 100-500 msec) en de laserintensiteit (gewoonlijk 20-30%) afhankelijk van de intensiteit van het fluorescentiesignaal.
- Pas het beeld digitaal te krijgen tot celvisualisatie verbeteren.
- Selecteer de z-stack interval op de foto in de hersenen slice (meestal meer dan een 100-120 um interval). Kies een interval met een geschikt aantal geïsoleerde cellen mogelijk te vermijden overlappingen zoveel mogelijk (dit zal de volgende tracking-analyse te vergemakkelijken).
- Selecteer de afstand elk beeld z-stack (meestal 2-4 micrometer) tussen.
- Kies de tijd intERVAL tussen de z-stack capture (bijv. 3 min) en de totale beeldvorming duur (bijv. 3 uur).
- Klik op het icoon "opslaan" om de wijzigingen in de imaging parameters op te slaan.
- Druk op de opnametoets om beeldvorming te starten.
- Alternatieve beeldvorming van controle en experimentele monsters (bijvoorbeeld voertuig / medicatie of andere geëlektroporeerd plasmiden) gedurende dezelfde dag.
4. Het analyseren neuroblast Migratie
- In de Volocity Kwantificering module, open de gewenste bibliotheek die na het voltooien van een time-lapse experiment. Selecteer "Uitgebreide Focus" vanuit de linkerbovenhoek box (Figuur 4A, stap 1).
- Klik op het tabblad "Metingen" om de meting venster weer te geven (Figuur 4A, stap 2).
- Een lijst van taken is zichtbaar in de linkerbenedenhoek van het scherm. Drag "Track" (onder het "Varia" aanwezig rubriek aan de onderkant vande lijst) ruimte boven. Dit zal de opening van een nieuw venster genaamd "Track" in de linkerbovenhoek van het scherm (Figuur 4A, stap 3) gevraagd.
- Kies "" van de "Input" tabblad in het venster Track (Figuur 4A, stap 4).
- Klik op de Point Tool (Figuur 4A, stap 5).
- Beginnen met het bijhouden van de migrerende neuroblast door te klikken met de muis op het centrale gebied van de cel lichaam en houden het volgen van de beweging van cellen tot de laatste tijdstip van de time-lapse is bereikt (bijvoorbeeld punt nummer 61 voor een 3 uur durende film) .
- Voor het verkrijgen van gegevens kiezen "Make Meting Item" van de Metingen Menu (figuur 4B, stappen 6-7). Er verschijnt een venster in het midden van het scherm.
- In dit venster, selecteer "Een nieuwe meting item met de naam:" en typ een naam (Figuur 4C, stap 8). Vergeet niet om de optie 'Alle tijdstippen "voor pr selecterenessing OK (Figuur 4C, stap 9). Een meting artikelbestand zal verschijnen onder de time-lapse-bestand en zal de parameters voor de kwantitatieve analyse (bijv. migratie afstand, snelheid, verplaatsing en verplaatsing tarief) bevatten.
- Dubbelklik op de meting punt om het te openen als een venster (Figuur 4D, stap 10).
- Om de single tracks van de geanalyseerde cellen zichtbaar te maken, kies "rupsbanden Point" van de "Display"-opties (Figuur 4D, stap 11).
- Klik met de rechtermuisknop op de meting Item bestand en exporteren als een tekstbestand, dat vervolgens in programma's als Excel om migratie parameters te analyseren kan worden geïmporteerd.
- Bewegingen tussen opeenvolgende frames en pauzes die door elke cel tijdens het filmen periode, in de Meting Item bestand te selecteren uit de "Display" opties "Point" of "Populaties" en klik op ID (elke track heeft een unieke ID) te meten. Het resulterende bestand door te gaan exporterening zoals beschreven in stap 4.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Labeling van SVZ-afgeleide trekkende neuroblasts kan worden waargenomen langs de RMS, meestal 4-8 dagen na een succesvolle elektroporatie (Figuur 1B). Langere tijd punten kunnen ook worden gekozen, maar minder cellen worden gevonden in de RMS, aangezien de meeste van hen zullen de OB hebt ingevoerd. Neuroblasts beginnen te verwerven typische morfologie en eigenschappen van rijpe granule cellen in de OB ongeveer 2-3 weken na elektroporatie (niet getoond). Na kweken gedurende ~ 1 uur, kan hersenplakjes van elektroporatie muisjongen betrouwbaar worden afgebeeld tot 3-4 uur. Zoals eerder gemeld 23,26 kan neuroblasts complexe migratiedynamiek (Figuur 3 en Video 1), die kwantitatief geanalyseerd met behulp van mobiele volgen (figuur 4).
Figuur 1. Postna Tal in vivo elektroporatie. (A) Schematische tekening van in vivo elektroporatie van een postnatale dag 2 muis pup. Een gestippelde lijn (rood) die de oog op de craniometrical landmark lambda dient als een positionele merker voor capillaire inbrengen. De injectie punt wordt aangeduid als een groene stip. Grijze ovale vormen geven elektrode positie zoals beschreven in Boutin et al.. 15 (B) Sagittale muis voorhersenen slice immunostained voor GFP 5 dagen na elektroporatie van een GFP-expressie plasmide. SVZ-afgeleide migreren neuroblasts zijn zichtbaar langs de RMS en sommige van hen zijn begonnen met de OB te bereiken. CTX: cortex; SVZ: subventricular zone; RMS: rostrale migratiestroom; OB: reukorgaan. Bar, 400 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding .
n "src =" / files/ftp_upload/50905/50905fig2.jpg "width =" 500px "/>
Figuur 2. Schematische stappen in de bereiding van acute hersenen slice culturen beeldvorming. (A) Staart en intra-hemisferische delen (stippellijnen) worden uitgevoerd op een vers ontleed hersenen. (B) De geëlektroporeerd hersenhelft wordt geplaatst op een vibratome houder. (C) sagittale plakken verkregen met een vibratoom en bekeken onder een standaard fluorescentiemicroscoop . (D) Plakken met de beste GFP signaal worden gekweekt voor minstens 1 uur op een Millicell voegen in een glazen bodem schaal, en (E) vervolgens in een klimaatkamer voor de beeldvorming geplaatst door een omgekeerde confocale spinning disk systeem. Klik hier voor grotere afbeelding .
les/ftp_upload/50905/50905fig3.jpg "width =" 500px "/>
Figuur 3. Time-lapse imaging migreren neuroblasts. (A) Spinning disk time-lapse beelden van neuroblasts genomen van een muis sagittale stukje hersenen 5 dagen na elektroporatie van een GFP-expressie plasmide. Beelden zijn 1 uur uit elkaar. Elk paneel is een z-stack projectie van 28 opeenvolgende beelden 4 micrometer uit elkaar. Pijlpunten duiden 4 representatieve neuroblasts migreren langs de RMS naar de bulbus olfactorius (gelegen buiten beeld op de rechter benedenhoek). (B) Vertegenwoordiger trekroutes verkregen van time-lapse imaging van de 4 neuroblasts gemarkeerd in (A). (C) Grafiek met de afstand gemigreerd met de tijd door 2 vertegenwoordiger neuroblasts. Cellen vertonen een typische saltatorische beweeglijke gedrag. Bar, 70 pm. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 4. Tracking analyse van het migreren neuroblasts. Opeenvolgende stappen gebruikt om migreren neuroblasts volgen met behulp van Volocity software. Zie de tekst voor een gedetailleerde beschrijving. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Video 1:. Time-lapse beeldvorming van migratie neuroblasts De film toont een doorsnede van de muis RMS met GFP gemerkte migreren neuroblasts 5 dagen verkregen na elektroporatie van een GFP-expressie plasmide. De OB ligt uit het zicht naar de rechter benedenhoek. Confocale z-stacks werden gevangen op een draaiende schijf confocale met een 20X objectief elke 3 min gedurende 3 uur op een 120 urn interval. Playing snelheid: 10 beelden / sec.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Efficiënte migratie van neurale voorlopercellen langs de RMS verzekert de latere rijping in functionele neuronen 10. Prominente stromen van neurale voorlopercellen gericht de OB zijn zichtbaar in menselijke kinderschoenen en waarschijnlijk een belangrijke rol spelen in de vroege postnatale ontwikkeling hersenen 27. Bovendien zijn deze cellen kunnen gebieden van de hersenen getroffen door verwonding en neurodegeneratie 4,28 richten. In staat zijn om in real time het effect van genetische manipulatie op neuroblast dynamiek wordt het essentieel om volledig te begrijpen hoe neuroblast beweging wordt geleid en gereguleerd.
Hier hebben we een protocol voor het begeleiden SVZ-afgeleide neuroblast migratie door het koppelen van in vivo postnatale elektroporatie met time-lapse confocale draaiende schijf microscopie van acute hersenen slice culturen beschreven. Specifiek hebben we aangetoond hoe migrerende neurale voorlopercellen door elektroporeren in de SVZ een plasmide enc codeerbaaroding GFP. Afhankelijk van het doel van de studie kunnen verschillende typen plasmiden worden gebruikt (bv. die expressie van andere fluorescerende eiwitten of co-expressie van wildtype / mutant eiwitten van belang, CRE recombinase of shRNA met fluorescerende eiwitten). Wij raden u ten sterkste aan plasmiden die de kip beta actine CAG promotor 29 voor in vivo expressie. Beeldvorming van de hersenen plakjes verkregen geëlektroporeerde dieren kunnen ook worden gebruikt voor het bewaken van de radiale migratie van neurale voorlopercellen in de OB bij langere tijdstippen (7-10 dagen) na elektroporatie 30.
Na een eerste periode van de praktijk, in vivo postnatale elektroporatie wordt een zeer betrouwbare methode, waardoor robuust neuroblast etikettering voor zowel time-lapse imaging en immunofluorescentieanalyse. Bovendien biedt deze techniek een fundamentele voordeel boven transgene muizen die fluorescerende eiwitten onder neuroblast promotoren,waar de meerderheid van neuroblasts gelabeld. Inderdaad, elektroporatie maakt schaars etikettering van neuroblasts, waardoor gedetailleerde analyse van hun morfologie en migratie dynamiek. Vergeleken met de stereotactische afgifte van virale vectoren 31, deze techniek is goedkoper, sneller en is zeer goed verdragen door muisjongen. Het belangrijkste nadeel bestaat erin dat het beperkt is tot vroege postnatale fase. Inderdaad, raden wij het gebruik van postnatale dag 2 muis pups, want we zagen een aanzienlijke daling van de etikettering efficiëntie op latere tijden, toen virale levering methoden worden meer geschikt 31. Echter, strategieën, zoals elektroporatie van-CRE uitdrukken plasmiden in de juiste muis genetische modellen worden gebruikt om neurogenese studeren in volwassen stadia 22.
Twee-foton, standaard confocale, draaiende schijf confocale en wide-field fluorescentie microscopie kunnen allemaal gebruikt worden om neuroblast migratie 17,23,24 visualiseren. Spinning disk confocale microscopie is een goedkoper alternatief voor de twee-foton microscopie. Hiermee 3D beeldvorming hogere snelheid via meerdere z vlakken beperken fotobleken vergelijking met standaard confocale microscopie en met een hogere resolutie dan wide-field fluorescentie beeldvorming 31-33. De meerderheid van het migreren neuroblasts hebben een duidelijk zichtbaar soma en een zeer dynamische toonaangevende proces getipt met een groei kegel.
Zoals beschreven door anderen 17 heeft perfusie kamer zou toelaten de effecten van controle en drugs porties op dezelfde plak hersenen direct beoordelen. Hoewel wij dit een belangrijk voordeel overwegen de hier beschreven protocol duidelijk dat het niet absoluut noodzakelijk om cellevensvatbaarheid te plakken perfuseren van geoxydeerd kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) of hoog glucose DMEM 17,33. Bovendien, met behulp van een omgekeerde microscoop kunt gemakkelijker doel manipulatie vergeleken met rechtopstaande microscopen voorzien van water onderdompeling doelstellingen.We vonden dat het gebruik van een 20X lange afstand doel is een optimaal compromis, waardoor het volgen van een goede aantal cellen (meestal 25-40 per segment) en het produceren van een goede resolutie beelden (Video 1). Automatisch volgen is ook mogelijk, maar het is niet altijd betrouwbaar. Om deze reden adviseren wij visuele en, indien nodig, manuele verificatie van automatisch bijhouden van gegevens. Hogere vergroting beeldvorming van enkele neuroblasts kan worden uitgevoerd met een Nikon Fluor DIC M/N2 40X/0.80W doelstelling. De vrij beschikbare ImageJ plugin MTrackJ kan ook worden gebruikt om basisspoor statistieken 33 te meten, maar sommige ruwe gegevens acquisitiedossiers niet compatibel met deze software en moet worden omgezet in geschikte formaten voor analyse, die in sommige gevallen tijdrovend kan . De combinatie van beeld acquisitie en analyse modules die door de Volocity software maakt een onmiddellijke overgang van vastleggen van het beeld en / of verwerking aan de kwantitatieve analyse van trekkende parameterters (snelheid, verplaatsing, enz.), die gemakkelijk kan worden gevisualiseerd in verschillende grafieken (bv. die migratiepatronen / afstand / gerichtheid / snelheid / persistentie / tijd immobiel doorgebracht, enz.).
Neuroblasts vertonen een sprongsgewijze beweging, afwisselend trekkende aan stationaire fasen 34,35 (Figuur 3C). In het licht van het feit dat de stationaire fase kan tussen 4-10 min 32, zijn wij van mening dat het vastleggen van beelden om de 3 minuten een goed compromis te volgen migreren neuroblasts met minimale verlichting en photodamage. We zien zelden cellen stoppen voor meer dan 6 min, en vinden dat, meer dan een 3-uur periode, zij over het algemeen besteden gemiddeld 30 minuten onbeweeglijk. Volgens eerdere berichten, neuroblasts hebben een gemiddelde snelheid van 60-100 micrometer / uur en een gemiddeld meanderende index (werkelijke verplaatsing over de gemigreerde afstand), iets boven 0.6 23,36, wat in overeenstemming is met onze waarnemingen. Typicbondgenoot, ongeveer 60% van de cellen een "trekkende" gedrag (bijvoorbeeld na bijna lineaire migratieroutes, met een meanderende index tussen 0,6-1) en 20-25% zijn "verkennende" (met een meanderende index tussen 0-0,4), terwijl de overige ~ 20% kan worden geclassificeerd als "intermediair" (afwisselend trek-en verkennende fase, met een meanderende index tussen 0.4-0.6).
We erkennen dat er nog steeds beperkingen aan deze techniek, aangezien we niet neuroblasts kunnen filmen voor meer dan 3-4 uur zonder wezenlijke veranderingen waarnemen in hun beweeglijkheid. Filmen duur kan worden verhoogd door het verlagen beeldvorming frequentie (hoewel dit de nauwkeurigheid van de migratie analyse beïnvloeden) en door middel van een perfusiekamer omgevingsomstandigheden voor beeldvorming optimaliseren. Echter, het protocol hier beschreven, waaronder een 3-4 hr beeldvorming periode een geschikte compromis waardoor voor de kwantitatieve analyse van het verzamelen van voldoende gegevensmigratie. Inderdaad, tot nu toe zijn we erin geslaagd om de effecten gegenereerd op de migratie te detecteren door eiwitoverexpressie / downregulation 37 of door farmacologische manipulatie na vergelijking met geschikte controles (Sonego en Zhou, niet gepubliceerde resultaten).
Kortom, de combinatie van in vivo postnatale elektroporatie met draaiende schijf beeldvorming van de hersenen slice culturen vormt een krachtig instrument om de dynamiek van neuroblast migratie te monitoren in een systeem gelijkenis vertonen met de in vivo omgeving, die de mogelijkheid biedt om te onderzoeken in de diepte van de moleculaire mechanismen die de neuroblast beweeglijkheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
MS en YZ worden ondersteund door KCL en KCL-China PhD-training. MO werd gefinancierd door een biotechnologie en biologische wetenschappen Research Council PhD studententijd. Wij danken Masaru Okabe en Jun-ichi Miyazaki voor de PCX-EGFP plasmide en Alain Chedotal en Athena Ypsilanti voor waardevolle adviezen over elektroporatie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's Balanced media | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucose, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (phenol red-free) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Glass capillaries for injection | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Aspirator tube | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 capillary puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Footswitch Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel for electrodes | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX spinning disk system | Perkin Elmer | Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Acquisition, Quantitation, Visualization Modules | |
| Environmental chamber for microscopy | Solent Scientific | Custom-made | |
| Ti-E inverted microscope | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper |
References
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and. 11, 339-350 (2010).
- Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction? Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
- Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
- Emsley, J. G., Hagg, T. alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain. Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).
- Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).
- Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
- Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
- Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
- Gotts, J. E., Chesselet, M. F. Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury. J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).
- Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury. Brain Res. 996, 213-226 (2004).
- Romanko, M. J., et al. Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury. Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS One. 3, e1883 (2008).
- Barnabe-Heider, F., et al. Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation. Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Pathania, M., et al. miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons. PloS One. 7, e38174 (2012).
- dal Maschio, M., M,, et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat. Commun. 3, 960 (2012).
- Oudin, M. J., et al. Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A.
- Nam, S. C., et al. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy. Front. Neurosci. 5, 30 (2011).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Dev. 6, 13 (2011).
- Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone. J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).
- Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
- Tattersfield, A. S., et al. Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington's disease. Neuroscience. 127, 319-332 (2004).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain. J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Schaar, B. T., McConnell, S. K. Cytoskeletal coordination during neuronal migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).
- Valiente, M., Marin, O. Neuronal migration mechanisms in development and disease. Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).
- Comte, I., et al. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
- Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
