Summary
Les cellules de mammifères exprimant la cassette du gène de bioluminescence bactérienne (
Abstract
Basés sur les cellules de mammifères dans des essais in vitro ont été largement utilisés comme alternatives à l'expérimentation animale pour les études toxicologiques mais ont été limités en raison des coûts financiers et temporels élevés de la préparation d'échantillons en parallèle qui sont rendues nécessaires en raison de la nature destructrice des méthodes de dépistage luciférase à base de luciole . Cette vidéo décrit l'utilisation de cellules de mammifères autonome bioluminescentes, qui ne nécessite pas l'ajout destructrice d'un substrat luciférine, comme une méthode peu coûteuse et facile de surveiller les effets cytotoxiques d'un composé d'intérêt. Cellules de mammifère exprimant de manière stable la bioluminescence bactérienne plein (luxCDABEfrp) de la cassette du gène de produire de manière autonome un signal optique que des pics à 490 nm, sans l'addition d'un substrat de luciférine coûteux et susceptibles d'interférer, l'excitation par une source d'énergie externe, ou la destruction de l'échantillon qui est traditionnellement effectué au cours de la procédure d'imagerie optiques. Cette indépendance de la stimulation extérieure place la charge pour maintenir la réaction de bioluminescence uniquement de la cellule, ce qui signifie que le signal qui en résulte est détectée seulement au cours du métabolisme actif. Cette caractéristique rend la lignée cellulaire lux exprimant un excellent candidat pour une utilisation comme biosentinel contre les effets cytotoxiques parce que les changements dans la production de bioluminescence sont révélateurs d'effets négatifs sur la croissance cellulaire et du métabolisme. De même, le caractère autonome et le manque de destruction de l'échantillon requis permet l'imagerie répétée du même échantillon en temps réel tout au long de la période d'exposition aux substances toxiques et peuvent être effectuées sur plusieurs échantillons en utilisant l'équipement d'imagerie existant de manière automatisée.
Introduction
Aux États-Unis, les produits pharmaceutiques et autres produits destinés à la consommation humaine nécessitent une évaluation approfondie avant qu'ils soient approuvés pour utilisation par les consommateurs par la Food and Drug Administration. Le fardeau financier pour réaliser ce test est placé sur le développeur 1, ce qui augmente considérablement le coût de développement de nouveaux composés et donc se traduit par une augmentation des coûts pour les consommateurs. Alors que traditionnellement une grande partie de ce dépistage a utilisé des sujets animaux pour agir comme mandataires pour des hôtes humains, ce qui s'est avéré être un grand fardeau financier, avec un montant estimé à 2,8 milliards de dollars dépensés chaque année sur ADME / Tox (adsorption, distribution, métabolisme, excrétion et toxicité ) le dépistage seul 2 et preuves croissantes suggérant que les modèles animaux ne peuvent pas prédire de façon fiable les réponses toxicologiques humains 3. Par conséquent, dans les tests de cellules humaines in vitro basée sur la culture a gagné en popularité au cours des deux dernières décennies en raison de sa relativement faiblecoût, un débit plus élevé et une meilleure représentation de la biodisponibilité de l'homme et de la toxicologie 4. Méthodes de dépistage de toxicité culture à base de cellules actuelles emploient divers paramètres, tels que la mesure des niveaux d'ATP, le dépistage de l'activité des enzymes cytoplasmiques endogène disponibles, pour sonder l'intégrité de la membrane cellulaire, ou suivre le niveau de l'activité mitochondriale, pour évaluer la viabilité cellulaire 5 , 6. Cependant, quel que soit le critère choisi, ces méthodes nécessitent tous la destruction de l'échantillon avant que les mesures peuvent être prises, ainsi que la production de données à un seul moment. En conséquence, un grand nombre d'échantillons doivent être préparés et traités en parallèle des études de base de la cinétique toxicologiques, ajoutant encore du coût et de la main-d'œuvre nécessaire pour le développement de nouveaux composés. Alternativement, des tests utilisant sécrétées luciférase comme Gaussia luciférase 7, Vargula luciférase 8 et 9 Metridia luciféraseont été développés qui éliminent la nécessité de lyse cellulaire et nécessitent une fraction des médias pour la mesure du point de terminaison, cependant, ceux-ci sont encore limitées à l'échantillonnage à des moments prédéterminés et nécessite également l'ajout de substrats exogènes lumière d'activation.
Pour éviter, au détriment de la destruction de l'échantillon requise ainsi que d'éliminer le coût de substrats, d'une lignée cellulaire humaine a été conçu, qui exprime la bioluminescence bactérienne plein (lux) de la cassette de gène (luxCDABEfrp) pour permettre un suivi continu de cellules vivantes qui est semblable à l'imagerie des cellules vivantes fluorescente à base de colorant, mais sans que les procédures d'enquête photon d'activation et microscopiques supplémentaires. Cette lignée cellulaire est capable de produire de façon constitutive d'un signal optique pour la détection directe en continu sans avoir besoin de stimulation externe, évitant ainsi la destruction de l'échantillon. Mécaniquement, le signal de bioluminescence produite à partir de ces cellules résultes lorsque l'enzyme luciférase luxAB formé catalyse l'oxydation d'un aldéhyde gras à longue chaîne (synthétisé et régénérée par les produits des gènes luxCDE utilisant des substrats endogènes) en présence d'une réduction de phosphate de riboflavine (FMNH2, qui est recyclé à partir de FMN par le gène FRP produit) et de l'oxygène moléculaire 10. L'expression de la cassette lux dans la cellule-hôte permet donc de la lumière à être produit et détecté sans destruction cellulaire ou une addition de substrat exogène. De même, l'interaction entre les gènes lux et la FMN disponible endogène, et O 2 co-substrats, et l'exigence de maintien d'un environnement qui peut soutenir la conversion des FMN à FMNH2, assure que le signal de bioluminescence qui en résulte ne peut être détectée de vivre , les cellules métaboliquement actives.
Ces exigences ont déjà été exploités pour démontrer que lux-Based sortie bioluminescence est fortement corrélée avec la taille de la population cellulaire 11 et que l'exposition au composé toxique altère production autobioluminescent de façon dose-réponse 12. Ici, nous utilisons un rein embryonnaire humain autobioluminescent précédemment caractérisé (HEK293) de ligne de la cellule 11 de démontrer le dépistage toxicologique automatisé d'un antibiotique de la famille de la bléomycine avec activité endommageant l'ADN connu comme un exemple représentatif pour valider la demande de cellules de mammifères autobioluminescent pour les tests de toxicité.
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Protocol
1. Préparation des cellules
- Récupérez un flacon de cellules bioluminescentes HEK293 de l'azote stock congelé liquide et les cultiver dans un milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal, 0,01 mm acides aminés non essentiels, 1x antibiotiques antimycosiques et 0,01 mM pyruvate de sodium dans un T 75 flacon de culture tissulaire à 37 ° C et 5% de CO 2.
Remarque: Les médias et les composants supplémentaires varient en fonction de lignées cellulaires et doivent donc être choisis en conséquence. - Actualiser moyenne tous les 2-3 jours jusqu'à atteindre ~ 80% de confluence.
Note: La quantité de cellules nécessaires sera basé sur la conception expérimentale. Si nécessaire, d'autres cellules peuvent être obtenues par repiquage. - Récolte des cellules pour les tests.
- Retirez le support et laver les cellules avec du phosphate salin (PBS) tamponné en remuant doucement le ballon et ensuite jeter le passé PBS.
- Ajouter la trypsine et incuber à 37 ° C pendant 2 min,ou jusqu'à ce que les cellules sont détachées de la fiole.
- Recueillir les cellules individuelles dans PBS et les transférer dans un tube à centrifuger propre.
Remarque: Si les lignées cellulaires non adhérentes sont utilisés, des cellules séparées par centrifugation et les laver une fois avec PBS.
- Déterminer le nombre total de cellules en utilisant un hématimètre ou tout autre système de comptage cellulaire.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 300 g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans l'eau douce, moyen préchauffé.
- un nombre égal de graines de cellules dans des puits individuels d'une plaque multi-puits opaque. Dans cet exemple, la plaque 5 x 10 5 cellules dans un volume de 1 ml dans chaque puits d'une plaque de 24 puits noir. Plate un volume égal de milieu dans les puits en triple pour agir comme contrôle négatif.
Note: Le nombre de cellules étalées dans chaque puits est flexible et peut être optimisée pour des expériences individuelles. Pour chaque ligne de cellules de bioluminescence, de déterminer expérimentalement la relation entre le nombre de cellules et biolumiNESCent sortie, ainsi que la cellule minimale détectable comptent avant tout test de toxicité. Pour ce faire, mesurer la bioluminescence à travers un large éventail de tailles de population (par exemple, 1 x 10 3 à 1 x 10 6 cellules) dans des conditions d'imagerie standardisés. - Traiter les cellules avec un composé de test (s) tel que décrit ci-dessous.
2. Préparation chimique
- Préparer la substance chimique testée comme une solution stock concentrée. Dans cet exemple, utiliser un 100 mg / ml de solution mère d'un antibiotique de la famille de la bléomycine.
Note: Afin de minimiser les effets toxiques potentiels basés véhicule, surtout si un solvant organique est utilisé comme un véhicule pour l'addition de produits chimiques, il est recommandé que la concentration de l'action soit au moins 1000 fois la concentration post-application souhaitée. - Ajouter le bouillon chimique préparé directement dans les cellules. Dans cet exemple, la dose de l'antibiotique d'intérêt à des concentrations finales de 100, 200, 300 et 400 pg / ml dans triplicate puits. Laisser trois puits de cellules non traitées comme témoins.
Note: La concentration finale de la substance chimique cible doit être choisi en fonction des objectifs expérimentaux spécifiques. Une large gamme de concentrations est normalement testé pour obtenir un éventail complet des effets toxiques.
3. Imagerie et analyse des données
- Immédiatement après l'addition de produits chimiques, de placer la plaque dans la chambre de formation d'image de l 'instrument approprié pour l'acquisition d'images et la mesure de la bioluminescence.
- bioluminescence de mesure toutes les 15 minutes sur une période de 24 heures avec un temps d'intégration de 10 min pour chaque lecture.
Note: Le temps d'intégration utilisé dans cet exemple est une base par plaque et peut être réglé pour la mesure sur une base par puits en utilisant d'autres luminomètres de choix. Le temps d'intégration peut également être ajustée en fonction de la lignée cellulaire bioluminescente choisie. Parce que la bioluminescence est produite de manière autonome, sans destruction cellulaire ou toute stimulation externe, lisezréunions peuvent être prises à tout point dans le temps désiré pour atteindre les objectifs expérimentaux spécifiques. - Quantifier l'intensité de bioluminescence à partir de chaque puits par identification d'une région d'intérêt en utilisant un logiciel compatible. Afficher la sortie de lumière soit en tant que le flux total (photons / seconde), soit la luminance moyenne (photons / seconde / cm 2 / steridian) de chaque échantillon.
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Representative Results
Dans cette étude, la dynamique des cellules autobioluminescent HEK293 ont été surveillés en continu sur une période de 24 heures en réponse à l'exposition aux antibiotiques (Figure 1). Les effets toxiques de cet antibiotique, qui est un membre de la famille de la bléomycine connus pour tuer les cellules vivantes en se liant à et cliver l'ADN 13, ont été démontrés par l'intermédiaire d'une diminution de la production de bioluminescence par rapport aux cellules non traitées, qui peut être visualisée directement à travers les images pseudocolor (Figure 2). La nature autobioluminescent de ces cellules, ce qui a permis le dépistage du parallèle répétés d'échantillons dans diverses conditions de traitement, a permis de comparer les différentes concentrations à n'importe quel point dans le temps donné à l'analyse dose-réponse facile. Par exemple, la bioluminescence produite par les cellules après 15 h, 18 h et 20 h de traitement a été tracée en fonction de concentrations de produits chimiques dans la figure 3, montrant que l'augmentation resul de traitement antibiotiqueTED dans la réduction de la production de bioluminescence d'une manière dose-réponse.
Figure 1. Un suivi continu de la dynamique bioluminescentes en réponse à l'exposition chimique. Des cellules de façon constitutive bioluminescentes HEK293 ont été exposées à différentes concentrations d'un antibiotique de la famille de la bléomycine. Production bioluminescente a été suivie sur une période de 24 heures d'exposition (des données représentatives pour triplicatas techniques sur une plaque, moyenne ± erreur standard) (réimpression de 14).
Figure 2. Images pseudocolor de cellules traitées.
Figure 3. Dose-réponse de l'exposition aux produits chimiques. L'sortie bioluminescence après 15 h, 18 h et 20 h de l'exposition a montré que l'augmentation de traitement antibiotique a entraîné la réduction de la production de lumière d'une manière dose-réponse (données représentatives pour triplicatas techniques sur une plaque, moyenne ± écart-type). R 2 est la valeur calculée pour la régression linéaire.
Tableau 1. Comparaison de représentant de l'écran de toxicité démontrée en utilisant soit des cellules humaines autobioluminescent (lux-based) ou une luciférase de luciole traditionnel (luc) basée essai dans un format de plaque de 96 puits.
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Discussion
Cette méthode illustre l'utilisation de cellules de mammifères autonome bioluminescentes comme un test de dépistage de la cytotoxicité in vitro qui permet aux cellules vivantes à être surveillés en permanence au cours de leur vie. Ce protocole est flexible et peut être modifié pour tenir compte des conditions expérimentales spécifiques selon les besoins. Par exemple, l'expérience présentée ici est approprié pour le suivi des effets toxiques aigus, mais peut être adapté pour évaluer les effets à action lente ou à long terme par l'imagerie à plusieurs reprises à l'augmentation des intervalles de temps (ie toutes les 24 heures) et le maintien des cellules dans des conditions d'incubation standard entre lectures. En outre, le temps d'intégration peut être ajustée en fonction de la lignée cellulaire de bioluminescence. Une expérience préliminaire de l'imagerie avec différents temps d'intégration peut être réalisée pour déterminer la fenêtre de lecture optimal. L'intégration de 10 min utilisé dans cet exemple a été choisi pour mettre en évidence la dynamique de production de bioluminescence à travers tout treatment conditions, toutefois un cadre de lecture plus courts peuvent être appliqués en fonction de l'application. De même, si une plaque de 24 puits est utilisé pour la démonstration dans cet exemple, 96 - plaques ou 384 puits peuvent être substitués pour les applications de débit supérieur. Bien que les résultats représentatifs présentés ici démontrent triplicatas techniques sur une seule plaque, il est important de noter que les tests indépendants sur les différentes plaques doit être effectuée pour établir la signification statistique entre les niveaux de traitement lors de l'essai d'un composé d'intérêt. En outre, parce que ce test peut être adapté pour être utilisé dans une variété d'instruments avec différentes sensibilités de détection, il est recommandé que les rapports signal sur bruit et le signal-bruit acceptables devraient être déterminés sur une base par instrument.
Il a été précédemment déterminé que le nombre de cellules minimale détectable dans une plaque de 24 puits a été d'environ 1,5 x 10 4 cellules dans les conditions d'imagerie décrites ici 15.Cependant, il est important de noter que le nombre minimal de cellules nécessaires pour une détection fiable varie avec la taille bien, et que l'utilisation de petits puits réduit le nombre de cellules nécessaires pour la détection en augmentant le nombre de cellules bioluminescentes par unité de surface. Par conséquent, il est fortement recommandé que la relation entre la production de bioluminescence et la taille de la population sera déterminé dans les conditions d'imagerie souhaitées avant le dépistage. En outre, un lecteur de plaque à tube photomultiplicateur peut également être utilisé pour l'acquisition de données à la place du système d'imagerie Lumina SIIV, mais au détriment de l'obtention d'images pseudocolor. Quel que soit l'instrument d'imagerie utilisée, une plaque opaque doit être utilisé pour minimiser la perte de signal et / ou contamination par bioluminescence de puits adjacents en raison de photons qui traversent la plaque.
Comparé à d'autres approches fondées sur la culture cellulaire couramment employée, cette méthode offre l'avantage que l'acquisition des données peut être performed dans un mode entièrement automatique depuis la nécessité de la destruction de l'échantillon ou de l'addition du substrat est éliminé. Il permet également le suivi continu des effets dynamiques sur la même population de cellules sur une longue période d'exposition, ce qui offre une résolution améliorée de la cinétique toxicologiques sans augmentation concomitante des coûts monétaires ou de temps qui est rendue nécessaire lors de l'utilisation lyse cellulaire, exigeant des méthodes ( Tableau 1). Toutefois, une limitation importante de cette méthode est que l'essai du type cellulaire spécifique, il faudra la transfection stable de la cassette lux dans chaque type cellulaire d'intérêt afin de générer un phénotype autobioluminescent pour le dépistage. Bien que ce besoin sera effectuée une fois depuis les cellules peuvent ensuite être stockés dans de l'azote liquide pour une utilisation future, la procédure de transfection est une entreprise potentiellement beaucoup de temps.
En dépit de cette condition, le protocole décrit ici est simple et peu coûteux, exigents peu de travaux pratiques du personnel de laboratoire, ne nécessite pas de réactifs supplémentaires, et génère des données qui peuvent être utilisés directement pour l'interprétation toxicologique. Pour ces raisons, nous concluons que les lignées cellulaires de mammifères autobioluminescent peut être utilisé comme un test à haut débit pour l'examen préalable rapide d'un grand nombre de candidats à sélectionner des composés qui nécessitent une évaluation plus détaillée en aval.
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Disclosures
DM Close, SA Ripp et GS Sayler sont les fondateurs et propriétaires de 490 Biotech, Inc.
Acknowledgments
Ces efforts de recherche ont été soutenus par la Division de la National Science Foundation de la chimie, bio-ingénierie, l'environnement, et les transports (CBET) Systèmes sous les numéros d'attribution ÉFAC-0853780 et ÉFAC-1159344 et le National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) sous sentence nombre 1R43ES022567-01, et l'Institut national du cancer, programme d'imagerie du cancer sous récompense numéro CA127745-01. L'instrument Lumina SIIV utilisée dans ce travail a été obtenue à partir de l'Armée de Défense Programme d'Instrumentation de recherche de l'Université américaine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
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