Summary
Le présent protocole décrit un nouveau procédé d'identification d'une population d'énucléation d'érythroblastes orthochromatiques par écoulement d'imagerie multi-spectrale cytométrie, fournissant une visualisation du processus d'énucléation des érythroblastes.
Abstract
Érythropoïèse chez les mammifères conclut avec le processus dramatique de l'énucléation qui aboutit à la formation de réticulocytes. Le mécanisme d'énucléation n'a pas encore été complètement élucidé. Un problème fréquemment rencontré lors de l'étude de la localisation des protéines et des structures clés au sein énucléation des érythroblastes par microscopie est la difficulté d'observer un nombre suffisant de cellules subissant une énucléation. Nous avons développé un nouveau protocole d'analyse par imagerie multiparamétrique haut débit cellulaire en flux (Multi-Spectral Imaging cytométrie en flux), une méthode qui combine la microscopie par immunofluorescence avec la cytométrie de flux, afin d'identifier efficacement un nombre important d'événements énucléation, qui permet de obtenir des mesures et effectuer des analyses statistiques.
Nous décrivons d'abord ici deux méthodes de culture in vitro de l'érythropoïèse dans utilisés pour synchroniser les érythroblastes murins et augmenter la probabilité de capture d'énucléation à etemps e de l'évaluation. Ensuite, nous décrivons en détail la coloration des érythroblastes après fixation et perméabilisation afin d'étudier la localisation des protéines intracellulaires ou radeaux lipidiques pendant énucléation par cytométrie de flux d'imagerie multi-spectrale. Avec la taille et DNA/Ter119 coloration qui sont utilisés pour identifier les érythroblastes orthochromatiques, nous utilisons les paramètres "aspect ratio" d'une cellule dans le canal champ lumineux qui aide à la reconnaissance des cellules allongées et "delta barycentre XY Ter119/Draq5 "qui permet l'identification d'événements cellulaires dans lequel le centre de Ter119 coloration (de réticulocytes naissante) est loin en dehors du centre de DRAQ5 coloration (noyau subissant extrusion), indiquant ainsi une cellule sur le enucleate. Le sous-ensemble de la population des érythroblastes orthochromatique avec centre de gravité du delta élevé et un faible rapport d'aspect est fortement enrichie en cellules énucléation.
Introduction
Différenciation terminale à l'intérieur de la lignée érythroïde chez les mammifères se termine par le procédé de l'énucléation dramatique, à travers laquelle le érythroblastes orthochromatic expulse son noyau enveloppé d'une membrane (pyrenocyte) 1, 2, générant une réticulocytes. Le mécanisme exact de ce procédé, qui est également l'étape limitant le taux de succès, à grande échelle, la production de globules rouges du sang in vitro, n'est pas encore complètement élucidé. La localisation des protéines et des structures clés au sein d'énucléation d'érythroblastes repose sur l'utilisation de la fluorescence et microscopie électronique 5.3. Ce processus fastidieux se traduit généralement par l'identification d'un nombre limité d'événements énucléation et ne permet pas toujours une analyse statistique significative. Étendre sur une méthode d'identification des érythroblastes décrit précédemment par McGrath et al. 6, nous avons développé une nouvelle approche de l'identification et l'étude des événements énucléation par Multi-Spectral Imaging cytométrie en flux (multiparamétrique imagerie cellulaire à haut débit de l'écoulement, une méthode qui combine la microscopie à fluorescence avec la cytométrie de flux) 7, qui peut fournir un nombre suffisant d'observations pour obtenir des mesures et effectuer des analyses statistiques.
Ici, nous décrivons deux premières méthodes de culture in vitro de l'érythropoïèse dans utilisés pour synchroniser les érythroblastes et augmenter la probabilité de capture d'énucléation au moment de l'évaluation. Ensuite, nous décrivons en détail la coloration des érythroblastes après fixation et perméabilisation afin d'étudier la localisation des protéines intracellulaires ou radeaux lipidiques pendant énucléation par cytométrie de flux d'imagerie multi-spectrale.
Les échantillons sont analysés sur un flux d'imagerie cytomètre et les cellules recueillies sont déclenchés de manière appropriée pour identifier les érythroblastes orthochromatiques 6. Érythroblastes orthochromatiques sont ensuite analysés en fonction de leur rapport d'aspect, tel que mesuré en fond clair imaging, par rapport à leur valeur pour le paramètre delta centroïde XY Ter119-ADN, qui est définie comme la distance entre les centres des zones tachées pour Ter119 et l'ADN, respectivement. La population de cellules ayant un faible ratio d'aspect et delta haut centre de gravité XY Ter119/DNA est fortement enrichie en cellules énucléation. Utilisation de type sauvage (WT) érythroblastes contre érythroblastes avec suppression Mx-Cre médiation conditionnelle de Rac1 sur Rac2 - / - ou combiné Rac2 - / -; RAC3 - / - fond génétique et ce protocole d'analyse de roman de flux d'imagerie multi-spectrale cytométrie, nous avons récemment démontré que l'énucléation ressemble cytokinèse asymétrique et que la formation d'un anneau de actomyosin réglementé en partie par GTPases Rac est important pour la progression de l'énucléation 7.
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Protocol
1. Long terme in vitro érythropoïèse Culture (Ex vivo différenciation érythroïde Protocole Culture par Giarratana et al. 8, modifié et adapté pour les cellules de souris)
Il s'agit d'un long terme en 3 étapes dans le protocole de l'érythropoïèse vitro. Dans la première étape (0-4 jours) 2 x 10 5 cellules / ml sont placés dans un milieu de croissance supplémenté avec érythroblastes le facteur des cellules souches (SCF), l'interleukine-3 (IL-3), et d'érythropoïétine (Epo). Dans la seconde étape (5-6 jours), les cellules sont remises en suspension à 2 x 10 5 cellules / ml et en co-culture sur des cellules stromales adhérentes (MS5) dans du milieu de croissance frais additionné d'érythroblastes seulement avec Epo. Dans la troisième étape (7-9 jours), les cellules sont cultivées sur une couche de MS-5 les cellules dans un milieu de croissance des érythroblastes frais sans cytokines jusqu'à énucléation (Figure 1A).
Tous les protocoles d'animaux ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC) deMedical Center Hospital de Cincinnati Children.
- Récolte des os et l'isolement de cellules de moelle osseuse faible densité
- Ajouter 2 ml de IMDM stérile contenant 2% de sérum bovin fœtal (FBS) dans un tube conique de 15 ml et conserver sur de la glace.
- Euthanasier un vieux 2-6 mois C57/BL6 souris de type sauvage (avec ou sans souris génétiquement ciblée d'intérêt) à la suite institution approuvée par le protocole (par exemple inhalation de CO 2, suivie par dislocation cervicale).
- Isoler les os du bassin, fémurs, tibias et des deux jambes à la pince et scalpel, ajoutez-les dans le tube contenant IMDM 2% de FBS et garder sur la glace.
- Ajouter 1 ml IMDM 2% de FBS dans un tube cytométrie de flux stérile et rincer os en utilisant une pince et une seringue à tuberculine avec un 25-G x 5/8 "aiguille. IMDM Flush 2% de FBS à travers les os quelques fois doucement ( en aspirant ~ 500 ul de la suspension cellulaire et de rinçage à nouveau à travers l'os), et de recueillir des cellules de la moelle osseuse dans le flux-cytometrtube de y. Flushing est complète lorsque les os apparaissent en blanc.
- Filtrer suspension cellulaire par un 40-um tamis cellulaire appareil au-dessus d'un tube conique de 50 ml. Laver avec tamis cellulaire IMDM 2% de FBS et en utilisant le même moyen d'ajuster le volume final de la suspension cellulaire à 5 ml.
- Préparer des cellules de moelle osseuse de faible densité (ldbm) par centrifugation en gradient de densité: superposer soigneusement les 5 ml de suspension cellulaire par 5 ml de séparation cellulaire à gradient de densité moyenne 1,083 g / ml dans un tube de 15 ml et on centrifuge à 750 g pendant 25 min à température ambiante (RT), sans accélération de freinage / bas.
- Transférer le surnageant (de tout jusqu'à environ la marque de 2 ml du tube de 15 ml afin d'acquérir couche leuco-plaquettaire) dans un nouveau tube de 15 ml et effectuer un lavage plus avec IMDM 2% de FBS à 525 g pendant 5 min à RT.
- Aspirer le surnageant et lyser des globules rouges (RBC) restant en mettant en suspension le culot dans 3 ml de tampon de lyse RBC pendant 5 min à température ambiante. Si une plus grande pureté des érythroblastes estnécessaire à l'étape finale (par exemple pour les études biochimiques), purifier les cellules ldbm encore à cette étape de cellules neg Lin par séparation magnétique.
- Ex vivo la différenciation érythroïde protocole de culture à partir de cellules ou LDBM neg Lin (Figure 1A)
- Ajouter 7 ml IMDM 2% de FBS, rotation à 525 g pendant 5 min à température ambiante et remettre en suspension le culot cellulaire dans 2 ml de milieu de croissance des érythroblastes (EGM), composé de:
une. Moyen STEMPRO-34, contenant
b. 2,6% STEMPRO-34 moyen supplément,
c. 20% de BIT-9500,
d. Sulfate ferreux 900 ng / ml,
e. 90 ml de nitrate ng / ferrique,
f. 100 unités / ml de pénicilline / streptomycine, 2 mM de L-glutamine
g. 10 -6 M d'hydrocortisone
h. et des cytokines fraîchement ajoutée:
i) 100 ng / ml SCF,
ii) de 5 ng / ml d'IL-3, et
iii) 3 UI / ml Epo. - Compter les cellules en utilisant un compteur de cellules automatique ou manuellement à l'aide d'un microscope d'un ourletocytometer.
- Plaque dans une plaque de culture cellulaire à 6 puits à une concentration de 5 x 10 5 cellules / puits à un volume final de 2,5 ml dans EGM (2 x 10 5 ldbm cellules / ml) et incuber à 37 ° C (ce qui est considéré comme le jour # 0 de la culture).
- Changer le milieu par aspiration 1,5 ml du surnageant, tournant à 525 g pendant 5 min à température ambiante, la remise en suspension dans 1,5 ml de milieu frais contenant tous les trois cytokines et ajoutant au puits chaque jour les jours 2, 3, 4, afin d'optimiser phase de prolifération. Au jour 3, enlever toutes les cellules, compter et divisé en un nombre approprié de puits afin de maintenir les concentrations de cellules et de ~ 2 x 10 5 cellules / ml. Maintenir la culture à 37 ° C / 5% CO 2.
- Au jour 4, les cellules de la plaque MS5 (lignée cellulaire stromale murine) aux puits d'une nouvelle culture cellulaire plaque à 6 puits. Le milieu de culture cellulaire est MS5 α-MEM contenant 20% de FBS, 100 unités / ml de pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine.
- Au jour 5, compter le nombre deles cellules (à présent nettement enrichi en érythroblastes) dans chaque puits de la plaque de culture d'origine en utilisant un compteur de cellules automatique ou manuellement au microscope en utilisant un hémocytomètre.
- Lever toutes les cellules de chaque puits et transférer dans des tubes coniques de 15 ml, centrifuger à 525 g pendant 5 min à température ambiante, aspirer le surnageant et dissoudre des pastilles avec EGM frais ne contenant que de l'Epo (3 UI / ml) à une concentration de 2 x 10 5 cellules / ml.
- Aspirer le surnageant des puits où MS-5 cellules ont été étalées la veille (cible à 70-80% de confluence au moment de la co-culture) et ajoutent les cellules érythroïdes dans ces puits dans EGM ne contenant que de l'Epo (mais pas moyen de leur choix, MS-5 cellules survivent bien dans EGM pendant plusieurs jours).
- Changer le milieu ajoutant frais OEB le jour # 6.
- Changer le milieu du jour # 7, en utilisant EGM sans cytokines ajoutés. Les jours de 7 à 9, les échantillons d'essai pour l'énucléation de cytométrie de flux après coloration avec anti-Ter119 et Syto-16 tous les jours et procéder aux taches échantillons pour Multi-Spectral Imaging cytométrie en flux (tel que décrit dans la section 3).
Remarque:. Avant de placage et le jour 2, 4, 6, et 7 de la culture, de surveiller les cellules en culture pour l'enrichissement des érythroblastes et la différenciation avec la cytométrie de flux par l'évaluation des marqueurs de surface CD44 et Ter119 vs taille (FSC) 9 Sinon CD71, Ter119, et FSC peut également être utilisé 10, 11.
- Ajouter 7 ml IMDM 2% de FBS, rotation à 525 g pendant 5 min à température ambiante et remettre en suspension le culot cellulaire dans 2 ml de milieu de croissance des érythroblastes (EGM), composé de:
2. Rapide énucléation dosage, selon le protocole décrit par Yoshida et al. 12 avec modifications (figure 1B)
- Stress érythropoïèse induction et le stroma préparation cellulaire pour la culture de l'érythropoïèse in vitro
- Anesthésier un vieux 2-6 mois type sauvage C57/BL6 la souris selon les lignes directrices du IACUC (par exemple avec une solution de l'isoflurane). Assurez-vous que la souris a été correctement anesthésié par la vérification de l'absence de réponses réflexes à une douce biche patte pincement et pourrespirations régulières au cours de la procédure. Utilisez vétérinaire pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie.
- Induire un stress érythropoïèse par la queue saignement à un volume final de 500 pl. En utilisant une seringue à insuline, injecter un volume égal de solution saline normale par voie intrapéritonéale d'assurer la réanimation liquidienne de l'animal (tenir animal en position déclive avant l'injection et injecter dans le bas de l'abdomen afin de ne pas endommager les organes internes).
- Ne laissez pas la souris sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris le contrôle du moteur, comme indiqué par l'animal commence à se déplacer autour de la cage et être capable de se tenir debout et marcher sans tomber. La souris phlébotomisé est placé dans une cage sans autres souris.
- Après 2 jours, la plaque MS-5 cellules dans les puits d'une plaque de culture cellulaire de 24 puits. Incuber MS-5 les cellules à 37 ° C / 5% de CO2 dans un milieu de cellules MS5 (a-MEM contenant 20% de FBS, 100 unités / ml de pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine) dans le but d'être de 70 à 80 i% de confluencepuits n de la plaque après 48 h.
- Récolte de la rate et du traitement des splénocytes
- Quatre jours (96 h) après un stress érythropoïèse induction, euthanasier déjà saigné la souris via le protocole IACUC approuvé (par exemple inhalation de CO 2 suivie par dislocation cervicale).
- rate de récolte et le mettre dans un tube conique de 15 ml contenant IMDM 2% de FBS et garder sur la glace.
- De retour au laboratoire, dans le tissu de la culture capot dans des conditions stériles, inverser le tube contenant la rate sur un tamis cellulaire de 40 um situé sur le haut d'un tube de 50 ml. Écraser la rate en utilisant le piston d'une seringue en plastique de 5 ml.
- Laver avec tamis cellulaire IMDM 2% de FBS et en utilisant le même moyen, d'ajuster le volume final de la suspension cellulaire à 5 ml.
- Couche délicatement la suspension de splénocytes 5 ml sur 5 ml gradient de densité de séparation de cellules moyenne 1.083 g / ml dans un tube de 15 ml et centrifuger à 750 g pendant 25 min à température ambiante, sans accélération de frein / bas.
- Transfertsurnageant (solution à environ la marque de 2 ml du tube de 15 ml afin d'acquérir couche leuco-plaquettaire) dans un nouveau tube de 15 ml et effectuer un lavage avec IMDM plus 2% de FBS à 525 g pendant 5 min à température ambiante .
- Aspirer le surnageant et lysent les cellules rouges du sang par mise en suspension du culot dans 3 ml de tampon de lyse RBC pendant 5 min à température ambiante.
- Ajouter 7 ml IMDM 2% de FBS à laver les cellules et à diluer et neutraliser le tampon de lyse RBC et de spin à 525 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Aspirer le surnageant et suspendre les cellules sous forme de granulés dans 2 ml de milieu de croissance des érythroblastes (EGM).
- Culture des splénocytes isolés de faible densité, enrichis en érythroblastes, sur le plastique (première étape de culture in vitro rapide de l'érythropoïèse)
- Compter les cellules sur un compteur de cellules automatisé ou manuellement par un hématimètre. Nombre habituel de cellules isolées par la rate à ce stade est d'environ 15 x 10 6.
- Suspendre d'autres cellules dans EGM contenant les cytokines (à fconcentrations Inal): SCF 50 ng / ml, IL-3 5 ng / ml, et Epo 2 U / ml.
- Plate 1-5 x 10 6 cellules dans un volume final de 1 ml / puits (même nombre de cellules par puits en fonction du nombre total de cellules) d'une plaque de culture cellulaire à 24 puits et incuber O / N à 37 ° C / 5% de CO 2.
- Culture des érythroblastes sur les cellules MS5 (deuxième étape de culture in vitro rapide de l'érythropoïèse
- Aspirer le surnageant du plastique bien et lever les cellules (hautement enrichi dans les érythroblastes) en ajoutant 2 ml de froid EDTA 10 mM dans du PBS pendant 5 min, sur la glace à chaque puits.
- Mettez cellules dans des tubes frais, laver une fois dans EGM (sans cytokines) et remettre en suspension dans le même.
- Planche 5 5 x 10 -1 x 10 6 cellules dans un volume de 2.1 ml à chaque MS5 puits d'une plaque à 24 puits revêtue de cellule. Si inhibiteurs pharmacologiques sont utilisés dans l'expérience, les ajouter à des concentrations appropriées maintenant.
- Incuber pendant 6 à 8 heures (heure guidée parl'observation microscopique de l'ordre de 30% à 40% dans l'échantillon énucléation WT non traité). La liaison des érythroblastes de MS-5 cellules accélère leur énucléation.
- Soulever les cellules de chaque puits en ajoutant 2 ml de PBS froid mM d'EDTA + 10, pendant 5 min, sur de la glace. Avec les érythroblastes, MS-5 cellules seront également collectées mais ceux-ci peuvent ensuite être facilement exclus lors de l'analyse par cytométrie de flux comme FSC salut Ter119 - cellules.
- A ce stade, les cellules peuvent être fixées et colorées pour l'analyse par Multi-Spectral Imaging cytométrie en flux.
3. Coloration des érythroblastes pour la localisation des protéines intracellulaires ou radeaux lipidiques Pendant énucléation par imagerie multispectrale cytométrie en flux
- Laver les cellules dans du PBS, tourner 525 g pendant 5 min à température ambiante et aspirer le surnageant.
- Fixer les cellules en remettant en suspension les culots cellulaires dans 500 ul de 3,7% de formaldehyde dans du PBS pendant 15 min (temps de fixation variable en fonction de la lutte contregen sondée) et un léger pipetage.
- Transférer dans des tubes à centrifuger en plastique de 1,5 ml et incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Spin 2000 xg sur un banc à centrifuger pendant 20 s, aspirer le surnageant et effectuer un lavage par addition de 500 ul de PBS à chaque tube et pipetage doucement.
- Spin sur un 2000 xg banc à centrifuger pendant 20 sec, aspirer le surnageant et conserver les tubes sur de la glace pendant au moins 15 min. Permeablization étapes 3.6-3.9 devrait être fait rapidement et efficacement, et en suivant la filature / aspiration à la température ambiante, les culots cellulaires devrait immédiatement être remis sur la glace, pour les cellules à mieux conserver leur intégrité.
- Prenez des solutions d'acétone à partir de -20 ° C congélateur et de mettre sur la glace. Perméabiliser les cellules en remettant en suspension les culots cellulaires dans 500 ul d'abord 50% d'acétone refroidie à la glace (1:1 avec dH 2 O) et de pipetage doucement.
- Spin sur le banc microcentrifuge 2000 g pendant 20 sec, aspirer le surnageant et remettre en suspension cellulaires de pastilles dans 500 ul60; glacée 100% d'acétone par pipetage.
- Spin sur le banc microcentrifuge 2000 g pendant 20 sec, aspirer le surnageant et remettre en suspension cellulaires de granulés une fois de plus dans 500 ul glacée 50% d'acétone par pipetage.
- Spin sur le banc microcentrifuge 2000 g pendant 20 sec, aspirer le surnageant et laver les cellules une fois dans un tampon froid FACS (PBS + 0,5% de BSA) par un léger pipetage.
- Préparer l'étiquetage cocktail avec des anticorps ou des marqueurs pour les molécules d'intérêt: 0,1 U/100 ul AF488-phalloidin pour la coloration F-actine et 1 μl/100 ul Ter119-PECy7 pour la coloration des cellules érythroïdes. Coloration de remplacement ou complémentaire peut également être effectuée en utilisant AF-488-anti-β-tubuline anticorps (1:50), AF-594 conjugué à la sous-unité B de la toxine cholérique à étiqueter les radeaux lipidiques (1:200), anti-pMRLC (SER19) l'anticorps primaire de la chaîne de la myosine phosphorylée de la lumière de régulation (01:50), suivie d'anti-lapin de AF-488 conjugué anticorps secondaire (1:400) et anti-γ-tubulin anticorps primaire de lapin (1:100) suivi par un anticorps anti-lapin secondaire AF-555-conjugué (1:300).
- Suite à l'aspiration le surnageant, remettre en suspension les culots de cellules dans 100 ul de cocktail le marqueur, une pipette doucement et incuber pendant 30 min à température ambiante.
- Préparer tampon FACS contenant 2,5 M de la tache DRAQ5 nucléaire.
- Laver les cellules dans un tampon FACS, spin-down sur le banc microcentrifuge 2000 g pendant 20 sec, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 60 pl de tampon FACS contenant DRAQ5.
- Échantillons s'exécutent sur le cytomètre de flux imagerie de recueillir au moins 10.000 événements par expérience, compenser les fichiers de données brutes comme précédemment publié le 13, et analyser les résultats comme le montre la figure 2, en utilisant le logiciel d'analyse spécifique à l'imagerie cytomètre de flux.
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Representative Results
Tout d'abord, les cellules sont analysées en fonction de leur Aspect Ratio Brightfield (le rapport de la longueur de leur mineure par rapport à leur axe principal) et son Espace Brightfield (indicatif de leur taille). Les événements avec une valeur Brightfield Région inférieur à 20 et supérieur à 200 sont pour la plupart des débris cellulaires et des agrégats, respectivement, et sont exclus de l'analyse (figure 2A). Les cellules individuelles (porte "R1") sont ensuite analysées en fonction de leur valeur pour le paramètre Gradient RMS, ce qui indique la netteté de l'image. Gate "R2" est créé cellules contenant une valeur de gradient RMS plus que les 50 e percentile afin de sélectionner les images ainsi prises au point (figure 2B). Les cellules sont alors déclenchés en fonction de leur taille, mesurée par leur Brightfield régionaux, et leur positivité pour la Ter119 marqueur érythroïde, telle que mesurée par le paramètre de fluorescence Ter119 taches moyenne de pixel (grille "Ter119 positif", figure 2C). Cellules très basses ou très élevées pour Ter119, sont des non-erythroids ou agrégats de cellules restantes, respectivement, et sont exclus de l'analyse. Dans l'étape suivante, les cellules sont sélectionnées en fonction de leur DRAQ5 Intensité Rapport d'aspect (le rapport de la mineure par rapport à l'axe majeur de l'intensité de leur noyau) et de l'intensité de DRAQ5 (figure 2D). DRAQ5 cellules négatives (cellules essentiellement énucléés, comme des réticulocytes et des globules rouges), et les cellules avec un faible ratio d'aspect de DRAQ5 (principalement des doublets) sont exclus de l'analyse. DRAQ5 cellules positives (porte "d'ADN positif", érythroblastes surtout à ce stade) sont ensuite analysés en fonction de leur zone Ter119, qui indique la taille de la cellule, et leur Ter119 moyenne Pixel / zone (densité d'expression Ter119), qui indique la Ter119 luminosité de coloration. Érythroblastes orthochromatiques (porte "OrthoE") sont reconnus comme les petites, Ter119 cellules salut (figure 2E). Finalement, une sous-population de la orthochromatic érythroblastes hautement enrichi en énucléation cellules est caractérisé par un faible allongement Brightfield, qui est une mesure de l'élongation cellulaire, calculé par le rapport entre le petit axe axe / de l'image de la cellule dans le canal Brightfield M01, et par une forte Delta Centroid XY Ter119 / DRAQ5, qui est définie par la distance entre le centre de la Ter119 +-réticulocytes naissante et le centre de la DRAQ5 +-noyau (grille "cellules" dans énucléation Figure 2F).
Avec anticorps contre Ter119 et la DRAQ5 ADN-tache, les cellules ont été colorées pour l'actine filamenteuse (F-actine) avec phalloidin fluorescent pour évaluer la localisation de F-actine pendant l'énucléation des érythroblastes 7. Il convient de noter, d'une progression de l'énucléation peut être visualisée dans les cellules fixées, en tant que cellules présentant un rapport d'aspect décroissante (c'est à dire de plus en plus allongée) et l'augmentation delta centroïde XY Ter119/Draq5 sont observés (Fig.ure 3). F-actine est observée à concentrer au sillon de clivage lors de l'énucléation et dissiper une fois que le noyau est extrudé. De plus, la co-localisation de l'actine et de la myosine à la sillon de clivage entre les réticulocytes naissante et le noyau peut être démontrée par l'écoulement d'imagerie multi-spectrale cytométrie après co-coloration des érythroblastes WT pour pMRLC (myosine phosphorylée chaîne légère régulatrice) et la F-actine 7.
D'autres protéines et des structures d'intérêt peuvent également être colorées avec des anticorps appropriés ou des marqueurs fluorescents pour permettre des études d'imagerie de leur rôle au cours de l'énucléation. La formation des microtubules est polarisée visible dans les érythroblastes orthochromatiques WT avant l'énucléation, mais pas dans les érythroblastes traitées avec de la colchicine (figure 4A). L'inhibition de la polymérisation de la tubuline par la colchicine diminue la polarisation de la cellule, tel que démontré par la mesure du paramètre delta centroïde XY BF/Draq5 entre le center du corps de la cellule en vue canal à fond clair et le centre de la coloration obtenue avec DRAQ5 nucléaire (Figure 4B).
Utilisant WT ou Rac-déficiente (après manipulation génétique ou pharmacologique) érythroblastes en flux d'imagerie multi-spectrale cytométrie études d'imagerie permis qui démontrent le rôle des GTPases Rac dans l'énucléation. GTPases Rac réguler au moins en partie la formation d'un anneau d'actomyosine ainsi que la confluence des radeaux lipidiques dans le sillon entre les réticulocytes naissante et pyrenocyte 7.
Figure 1. Démonstration schématique des protocoles érythropoïèse in vitro utilisées pour produire des érythroblastes énucléation pour les études. A. à long terme dans la culture de l'érythropoïèse vitro initiated de LDBM ou Lin -.. cellules B. dosage d'énucléation rapide initiée par splénocytes hautement enrichi dans les érythroblastes après un stress érythropoïèse induction in vivo par la saignée S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Analyse des données en utilisant le logiciel d'analyse spécifique à l'écoulement de l'imagerie cytomètre. Déclenchement successif des populations d'intérêt est représenté dans les panneaux AF. Le nombre entre parenthèses indique le pour cent environ de la population parente correspondante, dans cette expérience. A. déclenchement initial de population R1 élimine les agrégats de celluleset les débris cellulaires. B. porte sur R1 R2 inclut les cellules qui ont été imagées clairement, à l'exclusion de cellules de réflexion. cellules positives Ter119-C (R2) hors de sont choisis, à l'exclusion des cellules qui sont négatives pour l'une ou l'autre ou sont Ter119 trop intensément coloré en raison de leur présence dans les agrégats. cellules ADN positifs D. (sur cellules Ter119-positifs) sont choisis, après avoir tracé pour Aspect Ratio d'intensité par rapport à l'intensité de la coloration nucléaire (ici DRAQ5 lire dans le canal 5). E. l'ADN des cellules et Ter119-positifs sont déclenchés dans basophiles, polychromatophilic et érythroblastes orthochromatiques en fonction de leur emplacement dans le Ter119 Pixel moyenne par rapport Ter119 zone (ici lire dans le canal 3), comme indiqué précédemment par McGrath et al 5. F. Les cellules énucléation sont ces cellules à des érythroblastes orthochromatiques, qui ont Aspect Ratio faible (une mesure de elongat cellulaireion en fond clair (BF) canal) et haute Delta Centroid XY Ter119/Draq5 (distance entre le centre de formation Ter119 + réticulocytes et le centre de noyau). Cette recherche a été publié à l'origine dans le sang: Konstantinidis DG, Pushkaran S, et al signalisation et les exigences du cytosquelette dans l'énucléation des érythroblastes de sang... 2012;. 119 (25) :6118-6127 par l'American Society of Hematology S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Des images représentatives de énucléation des érythroblastes avec augmentation progressive de Delta Centroid XY Ter119/Draq5. WT souris érythroblastes orthochromatiques, colorées avec Ter119-PECy7, phalloidin-AF488, et Draq5, sont bloquées par leur rapport d'aspect et delta barycentre XY Ter119/Draq5. Les cellules sont représentées fixées à différentes étapes successives de l'énucléation, avec une progression qui correspond à la diminution de rapport d'aspect et l'augmentation delta centroïde XY Ter119/Draq5 (vert-croix à l'intérieur de la porte jaune indique la position de la cellule imagée sur la droite). Dans les images de cellules de haut en bas, la F-actine peut être observée au cours de l'énucléation de se concentrer sur le sillon de clivage et dissiper une fois que le noyau est extrudé (comme indiqué dans la cellule # 4782 à l'image du bas). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une une plus grande version de cette figure.
Figure 4. Formation d'un assemblage de microtubules unipolaire et la polarisation de orthochromaérythroblastes tic précède l'énucléation. A. polarisé la formation des microtubules est visible dans les érythroblastes de WT de contrôle (teinté anti-b-tubuline-AlexaFluor-488 et la tache DRAQ5 nucléaire), alors que b-tubuline est diffuse colorée dans les érythroblastes incubées avec de la colchicine (5 M) pendant 6 heures dans le test in vitro d'énucléation rapide à. B. multi-spectrale cytométrie de flux de formation d'image peut offrir une évaluation quantitative de la polarisation de la cellule par l'analyse de la distribution du paramètre delta centroïde XY BF/Draq5, qui mesure la distance entre le centre du corps de cellule comme on le voit en champ clair et le centre de la coloration nucléaire obtenue avec DRAQ5 (représentation schématique dans l'encart). Valeurs Delta Centroid BF/Draq5 de érythroblastes orthochromatiques WT colchicine traités sont statistiquement significativement différente de celle du contrôle des valeurs Delta Centroid BF/Draq5 (p <0,001). Cette recherche a été publié à l'origine dans Blood:.. Konstantinidis DG, Pushkaran S, et al signalisation et les exigences du cytosquelette dans l'énucléation des érythroblastes sang. 2012;. 119 (25) :6118-6127 par l'American Society of Hematology S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Au cours des dernières années, l'étude de l'énucléation érythroblastes a gagné en dynamique, car il est l'étape dans des cultures in vitro en l'érythropoïèse qui est le plus difficile à reproduire de manière efficace afin de réaliser avec succès, la production à grande échelle de cellules rouges du sang ex vivo. Jusqu'à récemment, l'étude de l'énucléation des érythroblastes utilisé la microscopie par fluorescence et principalement la cytométrie en flux méthodes. méthodes de microscopie de fluorescence, bien utile pour identifier les molécules qui participent, exigent jours d'observation microscopique d'identifier un petit nombre d'érythroblastes orthochromatiques subissant énucléation dans des centaines de cellules fixées à un point donné dans le temps. La cytométrie en flux méthodes, d'autre part, sont très utiles pour évaluer le taux de l'énucléation dans une culture, ainsi que les effets de la manipulation pharmacologique ou génétique de molécules particulières sur ce processus, mais ne fournissent pas de données sur la intracellular localisation de ces molécules.
Flux d'imagerie multi-spectrale combine les avantages de la cytométrie en cytométrie de flux et microscopie par immunofluorescence, car il permet l'acquisition rapide des deux cytométrie de flux et des données morphologiques à plusieurs milliers de cellules. Il s'agit d'un avantage important en fonction du débit classique cytométrie en études de l'érythropoïèse, puisque les différentes étapes de la différenciation des érythroblastes (proérythroblastes, basophiles, polychromatophilic, et orthochromatique) ont été définies selon les critères morphologiques 6. Cependant, l'écoulement multi-spectrale cytométrie de formation d'image est optimale pour la visualisation de structures cellulaires plutôt que des comparaisons de quantification relatifs dans les numéros de population. Pour de telles comparaisons, cytométrie de flux routine qui ne nécessite pas l'étape de perméabilisation nécessaire pour immunofluorescence des structures intracellulaires donne de meilleurs résultats. Par exemple, le pourcentage relatif de BasoE: polye: OrthoE sur la figure 2E
Les données d'imagerie peuvent être traitées en liaison avec les données de cytométrie en flux en utilisant le logiciel d'analyse spécifique à l'écoulement d'imagerie cytomètre, ce qui permet la collecte de cellules présentant certaines caractéristiques morphologiques à l'intérieur des portes. Environ une centaine de cellules énucléation peuvent être identifiés dans une population de 10 000 érythroblastes avec la méthode d'analyse décrite ci-dessus d'une manière rapide et efficace 7, permettant des observations plus significatives et l'évaluation statistique.
En outre, le traitement d'image est facilité avec le logiciel d'analyse spécifique à l'écoulement d'imagerie permettant l'analyse quantitative cytomètre de caractéristiques telles que le delta centroïde XY pour étudier par exemple la position relative du noyau dele cytoplasme qui peut être utilisé comme mesure de la polarisation.
Les étapes critiques dans le protocole et le dépannage
Il est bien connu que même un léger pipetage peut entraîner la séparation des réticulocytes et pyrenocyte 12. Cela a le potentiel de limiter sévèrement le nombre d'événements énucléation imagées. Par conséquent, il faut prendre soin, en particulier lors du levage érythroblastes liés aux cellules MS5 dans la culture.
Fixation avec une solution de formaldéhyde peut provoquer des altérations dans les régions extracellulaires des marqueurs de surface résultant en anticorps spécifique diminution de la fixation et / ou de liaison accrue d'anticorps non spécifique. Un avantage de l'écoulement de formation d'image est un cytomètre que la coloration de surface est visualisée et sa qualité peut ainsi être évaluée. Pointillé, au lieu de l'uniforme, coloration des marqueurs de surface abondantes, comme Ter119 indique overfixation et devrait être abordée à travers un mélange de formaldéhyde inférieureconcentration de hyde et de plus courte durée de fixation.
Après la fixation, en maintenant les cellules sur de la glace pendant au moins 15 minutes est indispensable pour empêcher la rupture des cellules en excès au cours du processus de perméabilisation à cause des différences de température. Bien que l'acétone perméabilisation maintient la fin erythroids fragiles mieux que la perméabilisation de détergent médiation, l'étape où l'acétone 100% est requise se traduira par un notable, mais ne nuisent pas, la perte de cellules. A la fin, après un lavage avec du tampon FACS à froid, on laisse les cellules à température ambiante pendant les étapes d'incubation d'anticorps.
Le flux d'imagerie a cytomètre un taux fixe de flux (cellules / s) en fonction de l'objectif utilisé (taux diminue à mesure que le grossissement augmente). À la suite de lavage final avant la mesure, il est recommandé que les culots cellulaires sont remis en suspension dans un petit volume (50 à 60 pi), afin d'accélérer le traitement de l'échantillon. Pour un grand nombre d'échantillons qui reQuire longue durée de course (plus de 30 min), les échantillons doivent être conservés dans la glace.
Le dosage de l'énucléation à long terme offre l'avantage d'une production de cellules érythroïdes élargi afin de produire suffisamment de cellules qui peuvent être recueillies à l'étape de l'énucléation de l'évaluation biochimique comme immuno et pull-bas. Le dosage de l'énucléation rapide donne l'avantage de temps ne nécessitant que deux jours pour effectuer, même si une souris doit être phlébotomisé 4 jours avant l'expérience. Nous n'avons pas observé de différence significative dans l'efficacité de l'énucléation entre les deux méthodes. Il faut noter que la cytométrie en flux évaluation, qui ne nécessite pas l'étape nécessaire pour immunofluorescence des structures intracellulaires de perméabilisation, comme décrit avant 7, est la plus appropriée pour l'évaluation quantitative de l'efficacité d'énucléation.
Limites de la technique
La méthode décrite ici utiLizes induite par le stress érythropoïèse in vivo et de la culture dans un milieu contenant de l'hydrocortisone in vitro afin d'amplifier les populations érythroïdes et de les synchroniser à l'étape de l'énucléation. Ces deux conditions imiter probablement érythroblastes-énucléation sous contrainte. En outre, l'hydrocortisone augmente de manière significative le rendement en cellules érythroïdes et la survie. Pour obtenir un rendement similaire d'événements énucléation de cellules de moelle osseuse provenant de souris de type sauvage avec érythropoïèse l'état d'équilibre et de culture sans hydrocortisone (synchronisation évitant ainsi), nous aurions besoin de cellules de culture de plusieurs souris et exécuter et traiter beaucoup plus d'événements grâce à Multi -imagerie spectrale cytométrie en flux. Bien que le flux d'imagerie multi-spectrale accélère cytométrie collecte de données morphologiques énormément par rapport à la microscopie à immunofluorescence en utilisant des lentilles de grossissement jusqu'à 60x, comparaison des observations obtenues par imagerie classique avec un cytomètre de flux, Z-empilement,et des images de microscopie confocale est utile pour obtenir une meilleure détail, étant donné que la lentille d'objectif d'un microscope peut fournir un grossissement jusqu'à 100 fois et images Z-stack donnent une impression en 3 dimensions de la structure, ce qui n'est pas réalisable par l'écoulement d'imagerie cytomètre de la même cellule. Le nombre relativement élevé de cellules semblables recueillies dans un flux d'imagerie multi-spectrale cytométrie expérience, à une orientation aléatoire, compense partiellement cette limitation permettant des observations de un point de vue différent.
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Disclosures
Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le flux de recherche cytométrie de base à l'hôpital Fondation de la recherche pour enfants de Cincinnati et Richard Demarco, Sherree ami, et Scott Mardochée du Amnis Corporation (partie de EMD Millipore) pour le support technique expert. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé accorde K08HL088126 et R01HL116352 (TAK) et P30 DK090971 (YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM medium | CellGro | 15-012-CV | |
| IMDM medium | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30228.01 | |
| Stempro-34 SFM | GIBCO (Life Tech) | 10640 | |
| Stempro-34 nutrient supplement | GIBCO (Life Tech) | 10641-025 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | 512450 | |
| BIT9500 | Stemcell Technologies | 09500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30028.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone (Thermo Scientific) | SV30010 | |
| L-glutamine | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30590.01 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler-Schein | 029405 | |
| Histopaque 1.083 mg/ml | Sigma | 10831 | |
| BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) | BD Biosciences | 555899 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 534064 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP 531-500 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | 213-13 | |
| EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) | AMGEN | available by pharmacy | |
| CD44-FITC antibody | BD Pharmingen | 553133 | |
| CD71-FITC antibody | BD Pharmingen | 553266 | |
| Ter119-PECy7 antibody | BD Pharmingen | 557853 | |
| Phalloidin-AF488 | Invitrogen (Life Technologies) | A12379 | |
| β-tubulin-AF488 antibody | Cell Signaling | #3623 | |
| anti-rabbit AF488-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A11008 | |
| anti-rabbit AF555-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A21428 | |
| AF594-cholera toxin B subunit | Invitrogen (Life Technologies) | C34777 | |
| pMRLC (Ser19) antibody | Cell Signaling | #3671 | |
| γ-tubulin antibody | Sigma | T-3559 | |
| Syto16 | Invitrogen (Life Technologies) | S7578 | |
| Draq5 | Biostatus | DR50200 | |
| Ferrous sulfate | Sigma | F7002 | |
| Ferric nitrate | Sigma | F3002 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 15-ml tubes | BD Falcon | 352099 | |
| 50-ml tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | BD Falcon | 351147 | |
| Flow tubes | BD Falcon | 352008 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309602 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | |
| Syringe needle 25-G 5/8 | BD | 305122 | |
| Capped flow tubes | BD | 352058 | |
| 40-μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Scalpel (disposable) | Feather | 2975#21 | |
| FACS Canto Flow Cytometer | BD | ||
| ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Hemavet 950 Cell Counter | Drew Scientific | CDC-9950-002 | |
| NAPCO series 8000WJ Incubator | Thermo scientific | ||
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Mini Mouse Bench centrifuge | Denville | C0801 |
References
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