Identifiering av en Murina erytroblast subpopulation Berikad i Enucleating Händelser av Multispektral Imaging flödescytometri

Summary

Föreliggande protokoll beskriver en ny metod för att identifiera en population av enucleating orthochromatic erytroblaster av multispektrala avbildning flödescytometri, vilket ger en visualisering av erytroblast enucleation processen.

Abstract

Erytropoes hos däggdjur avslutas med den dramatiska processen för enucleation som resulterar i reticulocyte formation. Mekanismen för enucleation har ännu inte helt klarlagd. Ett vanligt problem som påträffas när man studerar lokalisering av viktiga proteiner och strukturer inom enucleating erytroblaster från mikroskopi är att det är svårt att observera ett tillräckligt antal celler som undergår enukleation. Vi har utvecklat en ny analysprotokoll med hjälp av multihöghastighets cell imaging i flöde (Multi-Spectral Imaging flödescytometri), en metod som kombinerar immunfluorescensmikroskopi med flödescytometri, för att identifiera effektivt ett stort antal enucleating händelser, gör det till utföra mätningar och utföra statistiska analyser.

Vi beskriver först här två in vitro erytropoesstimulerande odlingsmetoder som används för att synkronisera murina erytroblaster och öka sannolikheten för att fånga enucleation på the tid för utvärdering. Därefter beskriver vi i detalj färgning av erytroblaster efter fixering och permeabilization för att studera lokalisering av intracellulära proteiner eller lipidrafts under enucleation av multispektrala avbildnings flödescytometri. Tillsammans med storlek och DNA/Ter119 färgning som används för att identifiera de orthochromatic erytroblaster, utnyttjar vi parametrarna "bildförhållande" i en cell i ljusfält kanal som stöd i erkännandet av långsträckta celler och "delta tyngdpunkt XY Ter119/Draq5 "som gör det möjligt att identifiera cellulära händelser där centrala Ter119 färgning (begynnande reticulocyte) är långt från centrum av DRAQ5 färgning (kärna genomgår extrudering), vilket indikerar en cell på väg att enucleate. Den delmängd av orthochromatic erytroblast befolkningen med höga delta tyngdpunkt och låg bildförhållandet höganrikat i enucleating celler.

Introduction

Terminal differentiering inom erytroid härstamning i däggdjur avslutas med den dramatiska processen för enukleation, genom vilken orthochromatic erytroblast utstöter sin membraninneslutna kärnan (pyrenocyte) ^1, vilket genererar en retikulocyt ^2. Den exakta mekanismen för denna process, som också är det hastighetsbegränsande steget för framgångsrik storskalig produktion av röda blodceller in vitro, är ännu inte helt klarlagts. Lokaliseringen av viktiga proteiner och strukturer inom enucleating erytroblaster förlitar sig på användningen av fluorescerande och elektronmikroskopi ^3-5. Detta mödosam process resulterar normalt i att identifiera ett begränsat antal enucleation händelser och inte alltid tillåter meningsfull statistisk analys. Expanderande på ett förfarande för erytroblast identifiering tidigare beskrivits av McGrath et al. ^6, har vi utvecklat en ny metod för att identifiera och studera enucleation händelser genom Multispektral Imaging flödescytometri (multihöghastighets cell imaging i flöde, en metod som kombinerar fluorescensmikroskopi med flödescytometri) ^7, vilket kan ge ett tillräckligt antal observationer för att utföra mätningar och utföra statistiska analyser.

Här beskriver vi först två in vitro erytropoesstimulerande kulturmetoder som används för att synkronisera erytroblaster och öka sannolikheten för att fånga enucleation vid tidpunkten för utvärderingen. Därefter beskriver vi i detalj färgning av erytroblaster efter fixering och permeabilization för att studera lokalisering av intracellulära proteiner eller lipidrafts under enucleation av multispektrala avbildnings flödescytometri.

Prover körs på en avbildning flödescytometer och de insamlade cellerna gated lämpligt att identifiera orthochromatic erytroblaster ^6. Orthochromatic erytroblaster analyseras sedan utifrån deras bildförhållande, mätt i bright imaging, jämfört med deras värde för parametern delta centroid XY Ter119-DNA, vilket definieras som avståndet mellan centra hos de områden som färgats för Ter119 och DNA, respektive. Populationen av celler med låg förhållande och hög delta tyngdpunkt XY Ter119/DNA är höganrikat i enucleating celler. Med användning av vildtyp (WT) erytroblaster kontra erytroblaster med Mx-Cre-medierad villkorlig deletion av RAC1 på RAC2 ^{- / -} eller kombinerat RAC2 ^{- / -;} Rac3 ^{- / -} genetisk bakgrund och denna nya analysprotokoll av multispektrala avbildnings flödescytometri, nyligen visade vi att enucleation liknar asymmetrisk cytokines och att bildandet av en aktomyosin ring regleras delvis av Rac GTPases är viktigt för enucleation progression ^7.

Protocol

1. Långsiktigt In vitro Erythropoiesis kultur (ex vivo erytroiddifferentiering Kultur Protokollet Giarratana et al. ^8, modifieras och anpassas för musceller)

Detta är ett 3-steg långsiktigt in vitro erytropoes protokoll. I det första steget (dagarna 0-4) 2 x 10 ⁵ celler / ml placeras i erytroblast tillväxtmedium kompletterat med stamcellsfaktor (SCF), interleukin-3 (IL-3) och erytropoietin (EPO). I det andra steget (dag 5-6), celler suspenderas på 2 x 10 ⁵ celler / ml och co-odlade på vidhäftande stromaceller (MS5) i färskt erytroblast tillväxtmedium kompletterat endast med Epo. I det tredje steget (dagarna 7-9), cellerna odlas på ett skikt av MS-5-celler i färska erytroblast tillväxtmedium utan cytokiner upp till enukleation (Figur 1A).

Alla djurprotokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) avCincinnati Childrens Hospital Medical Center.

1. Skörd av ben och isolering av låg densitet benmärgsceller
   1. Tillsätt 2 ml steril IMDM innehållande 2% fetalt bovint serum (FBS) i en 15 ml koniska rör och hålla på is.
   2. Euthanize en 2-6 månader gammal vildtyp C57/BL6 mus (tillsammans med eller utan genetiskt riktade mus av intresse) efter institutions godkända protokoll (t.ex. CO ₂ inandning följt av halsdislokation).
   3. Isolera bäckenet, lårben och skenben på båda benen med hjälp av pincett och skalpell, lägga till dem i rör innehållande IMDM +2% FBS och hålla på is.
   4. Tillsätt 1 ml IMDM 2% FBS i en steril flödescytometri rör och spola benen med hjälp av pincett och en tuberkulinspruta med en 25-G x 5/8 "nål. Flush IMDM 2% FBS genom benen några gånger försiktigt ( genom att aspirera ~ 500 jil från cellsuspensionen och spola den igen genom benet), och samla in benmärgscellerna in i flödes cytometry-rör. Flushing är klar när benen verkar vit.
   5. Filtrera cellsuspension genom en 40-ìm cell sil uppsättning på toppen av en 50-ml koniska rör. Tvätta cellfilter med IMDM 2% FBS och med användning av samma medium justera slutlig volym av cellsuspension till 5 ml.
   6. Förbered låg densitet benmärgsceller (LDBM) genom densitetsgradientcentrifugering: försiktigt lagret de 5 ml cellsuspension på 5 ml densitetsgradient cellseparationsmediet 1.083 g / ml i en 15-ml rör och centrifugera vid 750 xg för 25 min vid rumstemperatur (RT) med ingen broms / låg acceleration.
   7. Överför supernatanten (allt upp till ungefär 2 ml-märke 15-ml tub för att förvärva buffy coat) till ett nytt 15-ml rör och utför ytterligare en tvätt med IMDM +2% FBS vid 525 xg under 5 minuter vid RT.
   8. Aspirera supernatanten och lysera eventuella återstående röda blodkroppar (RBC) genom suspendering av pelleten i 3 ml lyseringsbuffert under 5 min vid rumstemperatur. Om en större renhet erytroblaster ärkrävs vid det sista steget (t.ex. för biokemiska studier), rena LDBM celler vidare på detta steg till Lin ^neg celler genom magnetisk separation.
2. Ex vivo-erytroid differentiering kultur protokoll, med början från LDBM eller Lin ^neg celler (Figur 1A)
   1. Lägg 7 ml IMDM 2% FBS, centrifugering vid 525 xg under 5 min vid RT och suspendera pelleterade cellerna i 2 ml erytroblast tillväxtmedium (EGM), som består av:
      en. StemPro-34 medium, som innehåller
      b. 2,6% StemPro-34 mediumsupplement,
      c.. 20% BIT-9500,
      d. 900 ng / ml järnsulfat,
      e. 90 ng / ml ferrinitrat,
      f. 100 enheter / ml penicillin / streptomycin, 2 mM L-glutamin
      g. 10 ^-6 M hydrokortison
      tim. och nyligen lagt cytokiner:
      i) 100 ng / ml SCF,
      ii) 5 ng / ml IL-3, och
      iii) 3 IU / ml Epo.
   2. Räkna celler med användning av en automatiserad cellräknare eller manuellt vid ett mikroskop med användning av en fållocytometer.
   3. Platta i en 6-brunnars cellodlingsplatta i en koncentration av 5 x 10 ⁵ celler / brunn till en slutlig volym av 2,5 ml i EGM (2 x 10 ⁵ LDBM celler / ml) och inkubera vid 37 ° C (detta anses som dag # 0 av kultur).
   4. Ändra medium genom aspire 1,5 ml av supernatanten, spinning vid 525 xg under 5 min vid RT, återsuspendering i 1,5 ml färskt medium innehållande alla tre cytokiner och tillsats tillbaka till brunnarna varje dag, dag # 2, 3, 4, för att optimera proliferativa fas. På dag 3, ta bort alla celler, räkna och delas upp i lämpligt antal brunnar för att upprätthålla såväl cellkoncentrationer av ~ 2 x 10 ⁵ celler / ml. Bibehåll odling vid 37 ° C / 5% _CO2.
   5. På dag 4, tallrik MS5 celler (mus stromal cellinje) till brunnar i en ny cell-kultur 6-brunnar. Den MS5 cellodlingsmediet α-MEM innehållande 20% FBS, 100 enheter / ml penicillin / streptomycin och 2 mM L-glutamin.
   6. På dag 5, räkna antaletceller (nu väsentligt berikad på erytroblaster) i varje brunn i den ursprungliga odlingsplattan med hjälp av en automatiserad cellräknare eller manuellt vid ett mikroskop med användning av en hemocytometer.
   7. Lyft alla celler från varje brunn och överförs till 15 ml koniska rör med spinn ner vid 525 xg under 5 min vid RT, aspirera supernatanten och lös pelletar med färsk EGM innehållande enbart Epo (3 lU / ml) till en koncentration av 2 x 10 ⁵ celler / ml.
   8. Sug ut supernatant från brunnarna där MS-5 celler pläterade föregående dag (riktad till 70-80% sammanflytning vid co-kultur) och lägg erytroida cellerna i dessa brunnar i EGM som endast innehåller Epo (även om inte deras medium val, MS-5 celler överlever väl i EGM flera dagar).
   9. Ändra medel lägga till nytt EPO på dag # 6.
   10. Ändra medium på dag # 7, med hjälp av extra bolagsstämma utan tillsatta cytokiner. På dagarna 7 till 9, testprov för enucleation med flödescytometri efter färgning med anti-Ter119 och Syto-16 dagligen och proceed till färgning prover för Multi-Spectral Imaging flödescytometri (som beskrivs i avsnitt 3).
       Anmärkning:. Innan plätering och på dag 2, 4, 6, och 7 av kultur, övervaka odlade celler för erytroblast anrikning och differentiering med flödescytometri genom att bedöma ytmarkörer CD44 och Ter119 vs storlek (FSC) ⁹ Alternativt CD71, Ter119 och FSC kan också användas för ^{10, 11.}

2. Snabb Enucleation Assay, Enligt protokollet Beskrivs av Yoshida et al. ¹² med ändringar (Figur 1B)

1. Stress erytropoes induktion och stroma celler förberedelse för in vitro erytropoes kultur
   1. Söva en 2-6 månader gammal vildtyp C57/BL6 mus per IACUC riktlinjer (t.ex. med isofluran lösning). Se till att musen har blivit tillräckligt sövd genom att kontrollera frånvaron av reflexiva svar på en mild hind-tass nypa och förregelbundna andetag under förfarandet. Använd veterinär oftalmologiska salva på ögonen för att förhindra torrhet under narkos.
   2. Framkalla stress erytropoes via svansblödnings till en slutlig volym av 500 | il. Med hjälp av en insulinspruta, injicera lika volym normal saltlösning intraperitonealt för att säkerställa vätsketillförsel av djuret (hålla djur i chockläge innan injicering och injicera i nedre delen av magen för att inte skada inre organ).
   3. Lämna inte musen utan tillsyn tills den har återfått motorstyrning vilket indikeras av att djuret börjar att flytta runt i buren och att kunna stå och gå utan att falla. Den phlebotomized mus placeras i en bur utan andra möss.
   4. Efter två dagar, Plate MS-5-celler i brunnarna på en 24-brunnars cellodlingsplatta. Inkubera MS-5-celler vid 37 ° C / 5% _CO2 i MS5 cellmedium (a-MEM innehållande 20% FBS, 100 enheter / ml penicillin / streptomycin och 2 mM L-glutamin) för att med målet att vara från 70 till 80 % sammanflytande in plattbrunnar efter 48 tim.
2. Skörd av mjälte och bearbetning av splenocyter
   1. Fyra dagar (96 tim) efter stressen erytropoes induktion, avliva tidigare blödde musen genom IACUC-godkända protokoll (t.ex. CO ₂ inandning följt av halsdislokation).
   2. Harvest mjälte och lägga den i en 15-ml koniska rör innehållande IMDM 2% FBS och hålla på is.
   3. Tillbaka i laboratoriet, i vävnadsodling huva under sterila förhållanden, invertera mjälte innehållande röret på en 40-ìm cell sil ligger på toppen av en 50-ml tub. Krossa mjälte med användning av kolven i en 5-ml plastspruta.
   4. Tvätta cellfilter med IMDM 2% FBS och med användning av samma medium, justera den slutliga volymen av cellsuspension till 5 ml.
   5. Lagret försiktigt 5 ml splenocyt upphängning på 5 ml densitetsgradient cellseparationsmediet 1.083 g / ml i en 15-ml rör och centrifugera vid 750 xg under 25 min vid RT utan broms / låg acceleration.
   6. Överföringsupernatanten (lösning ned till ungefär 2 ml-märket av den 15-ml tub för att förvärva buffy coat) till ett nytt 15-ml rör och utför ytterligare en tvätt med IMDM +2% FBS vid 525 xg under 5 minuter vid RT .
   7. Aspirera supernatanten och lyserar röda blodkroppar genom suspendering av pelleten i 3 ml lyseringsbuffert under 5 min vid rumstemperatur.
   8. Lägg 7 ml IMDM 2% FBS för att tvätta cellerna och för att späda ut och neutralisera RBC-lyseringsbuffert och centrifugering vid 525 xg under 5 min vid 4 ° C.
   9. Aspirera supernatanten och suspendera pelleterade celler i 2 ml erytroblast tillväxtmedium (EGM).
3. Kultur av de isolerade låg densitet splenocyter, berikade i erytroblaster, på plast (första steget i snabb in vitro erytropoes kultur)
   1. Räkna celler i en automatiserad cellräknare eller manuellt av en hemocytometer. Vanligt antal celler som isolerats per mjälte i detta skede är ~ 15 x 10 ^6.
   2. Häng celler vidare i EGM innehåller cytokinerna (vid fInal koncentrationer): SCF 50 ng / ml, IL-3 5 ng / ml och Epo 2 U / ml.
   3. Plate 1-5 x 10 ⁶ celler i en slutlig volym av 1 ml / brunn (samma antal celler per brunn beroende på totala antalet celler) av en 24-brunnars cellkulturplatta och inkubera O / N vid 37 ° C / 5% _CO2.
4. Kultur av erytroblaster på MS5 celler (andra steget i snabb in vitro erytropoes kultur
   1. Aspirera supematant från plasten väl och lyfta cellerna (starkt anrikade på erytroblaster) genom att tillsätta 2 ml kall 10 mM EDTA i PBS under 5 min, på is till varje brunn.
   2. Sätt celler i nya rör, tvätta en gång i EGM (utan cytokiner) och slamma i samma.
   3. Tallrik 5 x 10 ⁵ -1 x 10 ⁶ celler i en 1-2 ml volym till varje MS5 cell belagd brunn i en 24-brunnsplatta. Om farmakologiska hämmare används i försöket, lägg till dem i lämpliga koncentrationer nu.
   4. Inkubera under 6 till 8 h (tid styrs avmikroskopisk observation av ungefär 30% -40% enucleation i den obehandlade WT prov). Den bindning av erytroblaster till MS-5 celler accelererar deras enucleation.
   5. Lyft-celler från varje brunn genom tillsats av 2 ml kall PBS + 10 mM EDTA under 5 min, på is. Tillsammans med erytroblasterna, kommer MS-5 celler också samlas men dessa kan senare enkelt uteslutas vid flödescytometrisk analys som FSC ^hi Ter119 ^- celler.
   6. I detta skede kan cellerna fixeras och färgas för analys av multi Spectral Imaging flödescytometri.

3. Färgning av erytroblaster för Lokalisering av intracellulära proteiner eller lipidrafts Under Enucleation av multispektrala Imaging flödescytometri

1. Tvätta cellerna i PBS, snurra 525 xg under 5 min vid RT och aspirera supernatanten.
2. Fix celler genom att återsuspendera cellpelletar i 500 | il av 3,7% formaldehyd i PBS under 15 min (fixeringstiden kan variera beroende på den antigen som övervakas) och pipettera försiktigt.
3. Överföring till 1,5-ml plast centrifugrör och inkubera under 15 min vid rumstemperatur.
4. Snurra på en bänk mikro 2.000 xg under 20 sekunder, aspirera supernatanten och utföra en tvätt genom att tillsätta 500 l PBS till varje rör och pipettera försiktigt.
5. Snurra på en bänk mikro 2.000 xg under 20 sekunder, aspirera supernatanten och hålla rören på is i minst 15 minuter. Permeablization steg 3,6-3,9 bör ske snabbt och effektivt, och efter spinning / aspiration vid RT, bör cellpellets omedelbart sättas tillbaka på isen, för att cellerna att bättre behålla sin integritet.
6. Ta acetonlösningar ut från -20 ° C frys och på is. Permeabilize celler genom resuspending cellpellets först i 500 ul iskall 50% aceton (1:1 med dH ₂ O) och pipettera försiktigt.
7. Spin på bänken mikro 2.000 xg under 20 sek, aspirera supernatanten och suspendera cell pellets i 500 l60, iskall 100% aceton genom att pipettera försiktigt.
8. Spin på bänken mikro 2.000 xg under 20 sek, aspirera supernatanten och suspendera cellpellets än en gång i 500 l iskall 50% aceton genom att pipettera försiktigt.
9. Spin på bänken mikro 2.000 xg under 20 sekunder, aspirera supernatanten och tvätta cellerna en gång i kallt FACS buffert (PBS + 0,5% BSA) genom att pipettera försiktigt.
10. Förbered märkning cocktail med antikroppar eller markörer för molekylerna av intresse: 0,1 U/100 pl AF488-falloidin för F-aktin färgning och 1 μl/100 pl Ter119-PECy7 för erytroid cellfärgning. Alternativa eller ytterligare färgning kan också göras med hjälp av AF-488-anti-β-tubulin antikropp (1:50), AF-594-konjugerad koleratoxin subenhet B att märka lipidaggregat (1:200), anti-pMRLC (Ser19) primära antikroppen för det fosforylerade myosin reglerande lätta kedjan (01:50), följt av anti-kanin-AF-488-konjugerad sekundär antikropp (1:400) och anti-γ-TubuLin primär kaninantikropp (1:100) följt av anti-kanin-AF-555-konjugerad sekundär antikropp (1:300).
11. Efter supernatanten aspiration, återsuspendera cellpelletar i 100 ul av markörcocktail, pipett försiktigt och inkubera i 30 min vid rumstemperatur.
12. Förbered FACS buffert innehållande 2,5 mikroM av kärn fläcken DRAQ5.
13. Tvätta cellerna i FACS buffert, spinn ner på bänken mikro 2.000 xg under 20 sekunder, aspirera supernatanten och suspendera i 60 pl FACS buffert innehållande DRAQ5.
14. Kör prover på bild flödescytometer för att samla in åtminstone 10000 händelser per experiment, kompensera de råa datafilerna som tidigare publicerats ^13, och analysera resultaten som visas i figur 2, med hjälp av analysmjukvara som är specifik för det bildgivande flödescytometer.

Representative Results

Först celler analyseras utifrån deras Brightfield Bildförhållande (förhållandet mellan längden på mindre kontra deras huvudaxel) och deras Brightfield Area (ett tecken på deras storlek). Händelser med en Brightfield Area värde lägre än 20 eller högre än 200 är mestadels skräp och cellaggregat, respektive, och exkluderas från analysen (Figur 2A). Enstaka celler (gate "R1") är sedan analyseras utifrån deras värde för Gradient RMS parameter, vilket tyder på skärpan i bilden. Gate "R2" skapas som innehåller celler med Gradient RMS värde mer än 50: ^e percentilen för att välja de bilder som tagits väl i fokus (Figur 2B). Celler sedan gated baserat på deras storlek, mätt med deras Brightfield gränsen, och deras positivitet för erytroida markör Ter119 mätt genom Ter119 fluorescerande fläck-Mean Pixel parameter (gate "Ter119 positiva", fig. 2C). Celler mycket låga eller mycket höga för Ter119, är antingen icke-erythroids eller återstående cellaggregat, respektive, och ingår inte i analysen. I nästa steg, är celler som väljs utifrån deras DRAQ5 Bildförhållande Intensitet (förhållandet mellan moll kontra storaxeln intensiteten i sin kärna) och intensiteten i DRAQ5 (figur 2D). DRAQ5 negativa celler (mestadels enucleated celler, t.ex. retikulocyter och röda blodkroppar), och celler med en låg DRAQ5 Aspect Ratio (mestadels dubbletter) ingår inte i analysen. DRAQ5 positiva celler (gate "DNA-positiva", mestadels erytroblaster på denna punkt) analyseras sedan utifrån deras Ter119 Area, som anger storleken på cellen, och deras Ter119 Mean Pixel / Area (densitet Ter119 uttryck), vilket indikerar ljusstyrka Ter119 färgning. Orthochromatic erytroblaster (gate "OrthoE") redovisas som små, Ter119 ^hi celler (Figur 2E). Slutligen, en subpopulation av den orthochromatic erytroblaster höganrikat i enucleating celler kännetecknas av låg Brightfield bildförhållande, vilket är ett mått på cellförlängning, beräknas av förhållandet mellan lillaxeln / storaxel cell bilden i Brightfield-kanalen M01, och vid hög Delta Centroid XY Ter119 / DRAQ5, vilken definieras av avståndet mellan centrum av den begynnande Ter119 ^{+-retikulocyt} och centrum av DRAQ5 ^+-kärna (gate "enucleating celler" i figur 2F).

Tillsammans med antikropp mot Ter119 och DNA-fläck DRAQ5 har cellerna också färgas för filamentöst aktin (F-aktin) med fluorescerande falloidin att utvärdera lokalisering av F-aktin under erytroblast enucleation ^7. Att notera, kan en progression av enucleation visualiseras i de fasta celler, som celler med en minskande förhållande (dvs. allt mer avlång) och öka deltatyngd XY Ter119/Draq5 observeras (Figurure 3). F-aktin observeras att koncentrera sig på klyvning fåra under enucleation och sedan försvinna när kärnan extruderas. Dessutom kan co-lokalisering av aktin och myosin vid klyvning fåra mellan begynnande reticulocyte och kärna demonstreras genom multispektrala avbildnings flödescytometri efter samtidig färgning av WT erytroblaster för pMRLC (fosforyleras myosin reglerande lätt kedja) och F-aktin ^7.

Andra proteiner och strukturer av intresse kan också färgas med lämpliga antikroppar eller fluorescerande markörer för att möjliggöra studier avbildning av deras roll under enucleation. Polariserat mikrotubulusformationen är synlig i WT orthochromatic erytroblaster före enukleation men inte i erytroblaster behandlade med kolkicin (Figur 4A). Hämning av tubulinpolymerisation av colchicin minskar cell polarisering, vilket framgår av att mäta parametern delta tyngd XY BF/Draq5 mellan center i cellkroppen ses i Brightfield kanal och centrum av nukleär färgning uppnås med DRAQ5 (Figur 4B).

Använda WT eller Rac-brist (efter genetisk eller farmakologisk manipulation) erytroblaster i multispektrala avbildnings flödescytometri tillåtna imaging studier som visar på betydelsen av Rac GTPases i enucleation. Rac GTPases reglera åtminstone delvis bildningen av en aktomyosin ring liksom sammanflödet av lipidaggregat i fåran mellan begynnande retikulocyt och pyrenocyte ^7.

Figur 1. Schematisk demonstration av erytropoes in vitro-protokoll som används för att producera enucleating erytroblaster för studier. A. Långfristiga i erytropoes vitro kultur initieratsed från LDBM eller Lin ^-.. celler B. Snabb enucleation analys som initierats av splenocyter höganrikat i erytroblaster efter spännings erytropoes induktion in vivo genom flebotomi Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Analys av data utnyttja analysprogram specifika för avbildning flödescytometer. Successiv gating av populationerna av intresse visas i paneler AF. Siffran inom parentes anger den ungefärliga procent av den motsvarande huvudpopulationen, i detta experiment. A. Initial gating av R1 befolkning avlägsnar cellaggregatoch cellmaterial. B. Spjäll R2 av R1 inkluderar celler som har avbildas tydligt, med undantag av fokus-celler. C. Ter119-positiva celler (av R2) väljs, med undantag för celler som antingen är negativ för Ter119 eller är alltför intensivt färgade på grund av deras närvaro i aggregat. D. DNA-positiva celler (av Ter119-positiva celler) väljs, efter att konspirera för Aspect Ratio Intensitet kontra intensitet kärn fläcken (här DRAQ5 läsa i kanal 5). E. DNA-och Ter119-positiva celler gated in basofila, polychromatophilic och orthochromatic erytroblaster baserat på deras läge i Ter119 Mean Pixel kontra Ter119 Area (här läst i kanal 3), som tidigare visats av McGrath et al ^5. F. De enucleating celler är de celler ur orthochromatic erytroblaster, som har låg bildförhållande (ett mått på cell elongatjon i ljusfält (BF) kanal) och hög Delta Centroid XY Ter119/Draq5 (avståndet mellan centrum för bildning Ter119 ^{+-retikulocyter} och mitt i kärnan). Denna forskning publicerades ursprungligen in Blood: Konstantinidis DG, Pushkaran S, et al Signa och cytoskelettala krav erytroblast enucleation Blood... 2012;. 119 (25) :6118-6127 av American Society of Hematology Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Representant bilder av enucleating erytroblaster med successivt ökande Delta Centroid XY Ter119/Draq5. WT mus orthochromatic erytroblaster, färgade med Ter119-PECy7, falloidin-AF488, och Draq5 är gated per deras bildformat och deltatyngd XY Ter119/Draq5. Celler visas fastställts till olika, olika stadierna av enucleation, med en progression som motsvarar minskande bildformat och öka deltatyngd XY Ter119/Draq5 (grön-cross i den gula porten visar positionen för cellen avbildas till höger). I cellbilder från toppen till botten, kan observeras F-aktin under enucleation att koncentrera sig på klyvning fåra och sedan försvinna när kärnan extruderas (som visas i cell # 4782 vid den nedre bilden). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4. Bildandet av en unipolär mikrotubuli montering och polarisering av orthochromatic erytroblaster föregår enucleation. A. Polarized mikrotubulusformationen syns i kontroll WT erytroblaster (färgas med anti-b-tubulin-Alexafluor-488 och den nukleära fläcken DRAQ5), medan b-tubulin är diffust färgas i erytroblasterna inkuberade med kolchicin (5 M) i 6 timmar i den snabba in vitro enucleation analys. B. Multi-spektral avbildning flödescytometri kan erbjuda en kvantitativ utvärdering av cell polarisering genom analys av fördelningen av parametern Delta Centroid XY BF/Draq5, som mäter avståndet mellan centrum av cellkroppen som sett i ljusfält och i mitten av nukleär färgning uppnås med DRAQ5 (schematisk i infälld). Delta Centroid BF/Draq5 värden av kolkicin-behandlade WT orthochromatic erytroblaster är statistiskt signifikant annorlunda än kontrollen Delta Centroid BF/Draq5 värden (p <0,001). Denna forskning publicerades ursprungligen i Blood:.. Konstantinidis GD, Pushkaran S, et al Signa och cytoskelettala krav erytroblast enucleation Blood. 2012;. 119 (25) :6118-6127 av American Society of Hematology Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

På senare år har studier av erytroblast enucleation har fått allt större fart eftersom det är steg i in vitro erytropoesstimulerande kulturer som är svårast att reproducera effektivt för att nå framgång, storskalig produktion av röda blodkroppar ex vivo. Fram tills nyligen, studiet av erytroblast enucleation utnyttjas huvudsakligen fluorescensmikroskopi och flödescytometri metoder. Fluorescensmikroskopi metoder, om än till hjälp för att identifiera de deltagande molekyler, kräver dagar av mikroskopisk observation för att identifiera ett fåtal orthochromatic erytroblaster genomgår enucleation inom hundratals celler fixerade vid en viss tidpunkt. Flödescytometri metoder, å andra sidan, är mycket värdefullt för att utvärdera graden av enucleation i en kultur, liksom effekter av farmakologisk eller genetisk manipulering av särskilda molekyler på denna process, men inte några uppgifter om intracellular lokalisering av dessa molekyler.

Multi-spektral avbildning flöde kombinerar cytometry fördelarna med flödescytometri och immunofluorescensmikroskopi eftersom den möjliggör snabb tillgång till både flödescytometrisk och morfologiska data om flera tusen celler. Detta är en betydande fördel jämfört med klassiska flödescytometri i erytropoesstimulerande studier, eftersom de olika stadierna av erytroblast differentiering (proerythroblasts, basofila, polychromatophilic och orthochromatic) har definierats med hjälp av morfologiska kriterier ^6. Men är multispektrala avbildnings flödescytometri optimal för visualisering av cellulära strukturer snarare än relativ kvantifiering jämförelser i invånarantal. För sådana jämförelser, rutinmässig flödescytometri som inte kräver permeabilization steg krävs för immunofluorescens av intracellulära strukturer presterar bättre. Exempelvis kan den relativa procentandelen av BasoE: Polye: OrthoE i figur 2E

Uppgifterna imaging kan bearbetas tillsammans med flödescytometri data med hjälp av analysmjukvara som är specifik för det bildgivande flödescytometer, vilket möjliggör uppsamling av celler med vissa morfologiska egenskaper i grindar. Ett hundratal enucleating celler kan identifieras inom en befolkning på 10.000 erytroblaster med den analysmetod som beskrivs ovan på ett snabbt och effektivt sätt ^7, vilket gör att mer meningsfulla iakttagelser och statistisk utvärdering.

Dessutom är bildbehandlingen underlättas med analysprogram specifika för bildbehandling flödescytometer tillåta kvantitativ analys av sådana egenskaper som Delta Centroid XY för att studera till exempel den relativa positionen av kärnan tillcytoplasman, som kan användas som ett mått på polarisation.

Kritiska steg i protokollet och felsökning

Det är väl känt att även försiktig pipettering kan resultera i separation av retikulocyt och pyrenocyte ^12. Detta har potential att kraftigt begränsa antalet enucleation händelser avbildas. Som ett resultat måste försiktighet vidtas, särskilt vid lyft erytroblaster bundna till MS5 celler i odling.

Fixering med formaldehydlösning kan orsaka ändringar i extracellulära regioner av ytmarkörer som resulterar i minskad specifik antikroppsbindning och / eller ökad icke-specifik antikroppsbindning. En fördel med den avbildning flödescytometer är att ytfärgning visualiseras och kan således utvärderas dess kvalitet. Prickig, i stället för uniform, färgning för rikliga ytmarkörer såsom Ter119 indikerar overfixation och bör åtgärdas genom en kombination av lägre formaldehydhyde koncentration och kortare fixering.

Efter fixering, hålla cellerna på is i minst 15 minuter är avgörande för att förhindra överskottscellbrott under permeabilization processen på grund av temperaturskillnader. Även aceton permeabilization bibehåller de ömtåliga sena erythroids bättre än tvättmedel-medierad permeabilization, kommer det steg där det krävs 100% aceton resultera i en märkbar, men inte skadligt, förlust av celler. Vid slutet, efter en tvätt med kall FACS-buffert, celler tilläts vid rumstemperatur under de antikropp inkubationssteg.

Den avbildning flödet har cytometer en uppsättning flödeshastighet (celler / sek), beroende på vilket objektiv som används (ränta minskar eftersom förstoringen ökar). Efter slutlig tvättning före mätning, rekommenderas det att cellpellets återsuspenderas i en liten volym (50 till 60 | il), i syfte att påskynda behandlingen av provet. För ett stort antal prover som reBOK långa varaktigheten av körningen (över 30 min) bör proverna hålls på is.

Den långsiktiga enucleation analysen ger fördel för en utökad produktion erytroidcell för att producera tillräckligt med celler som kan samlas i enucleation stadiet för biokemisk utvärdering som immunoblotting och pull-downs. Den snabba enucleation assay ger fördelen av tid kräver endast två dagar för att utföra, även om en mus måste phlebotomized 4 dagar före experimentet. Vi har inte observerat en signifikant skillnad i enucleation effektivitet mellan de två metoderna. Notera flödescytometri utvärdering, som inte kräver permeabilization steg krävs för immunofluorescens av intracellulära strukturer, som beskrivits tidigare ^7, är mest lämpliga för kvantitativ utvärdering av enucleation effektivitet.

Begränsningar av tekniken

Den metod som beskrivs här UVIlizes inducerade spännings erytropoies in vivo och kultur i medium som innehåller hydrokortison in vitro för att förstärka erytroida befolkningar och synkronisera dem i det skede av enucleation. Båda dessa tillstånd sannolikt imitera erytroblast-enucleation under stress. Dessutom ökar hydrokortison signifikant erytroid utbyte och överlevnad. För att få samma avkastning på enucleation händelser från benmärgsceller härledda från vildtyp möss med steady-state erytropoes och odlas utan hydrokortison (därmed undvika synkronisering), skulle vi behöva odla celler från flera möss och springa och behandla många fler evenemang genom Multi -Spectral Imaging flödescytometri. Även multispektrala avbildningsflöde accelererar cytometry insamling av morfologiska uppgifter oerhört jämfört med immunofluorescensmikroskopi hjälp av förstoringslins upp till 60x, jämförelse av de observationer som erhålls genom avbildning flödescytometer med klassisk, Z-stack,och konfokalmikroskopi bilder är värdefull för att erhålla bättre detalj, eftersom objektivlinsen i ett mikroskop kan ge förstoringen upp till 100x och z-stack bilder ger en 3-dimensionell bild av de strukturer, som inte kan uppnås genom avbildning flödescytometer i samma cell. Den relativt höga antal liknande celler som samlats in i en multi-spectral imaging flödescytometri experiment på en slumpmässig orientering, kompenserar delvis denna begränsning tillåter observationerna från en annan synvinkel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
αMEM medium	CellGro	15-012-CV
IMDM medium	Hyclone (Thermo Scientific)	SH30228.01
Stempro-34 SFM	GIBCO (Life Tech)	10640
Stempro-34 nutrient supplement	GIBCO (Life Tech)	10641-025
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	512450
BIT9500	Stemcell Technologies	09500
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP-1600-100
Phosphate buffered saline (PBS)	Hyclone (Thermo Scientific)	SH30028.02
Penicillin/Streptomycin	Hyclone (Thermo Scientific)	SV30010
L-glutamine	Hyclone (Thermo Scientific)	SH30590.01
Isothesia (Isoflurane)	Butler-Schein	029405
Histopaque 1.083 mg/ml	Sigma	10831
BD Pharmlyse (RBC lysis buffer)	BD Biosciences	555899
Acetone	Sigma-Aldrich	534064
Formaldehyde	Fisher Scientific	BP 531-500
Hydrocortisone	Sigma	H4001
Stem Cell Factor (SCF)	Peprotech	250-03
Interleukin-3 (IL-3)	Peprotech	213-13
EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO)	AMGEN	available by pharmacy
CD44-FITC antibody	BD Pharmingen	553133
CD71-FITC antibody	BD Pharmingen	553266
Ter119-PECy7 antibody	BD Pharmingen	557853
Phalloidin-AF488	Invitrogen (Life Technologies)	A12379
β-tubulin-AF488 antibody	Cell Signaling	#3623
anti-rabbit AF488-secondary antibody	Invitrogen (Life Technologies)	A11008
anti-rabbit AF555-secondary antibody	Invitrogen (Life Technologies)	A21428
AF594-cholera toxin B subunit	Invitrogen (Life Technologies)	C34777
pMRLC (Ser19) antibody	Cell Signaling	#3671
γ-tubulin antibody	Sigma	T-3559
Syto16	Invitrogen (Life Technologies)	S7578
Draq5	Biostatus	DR50200
Ferrous sulfate	Sigma	F7002
Ferric nitrate	Sigma	F3002
EDTA	Fisher Scientific	BP120500
15-ml tubes	BD Falcon	352099
50-ml tubes	BD Falcon	352098
6-well plates	BD Falcon	353046
24-well plates	BD Falcon	351147
Flow tubes	BD Falcon	352008
Tuberculin syringe	BD	309602
Insulin syringe	BD	329461
Syringe needle 25-G 5/8	BD	305122
Capped flow tubes	BD	352058
40-μm cell strainer	BD Falcon	352340
Scalpel (disposable)	Feather	2975#21
FACS Canto Flow Cytometer	BD
ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer	AMNIS (EMD Millipore)
Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up.	AMNIS (EMD Millipore)
Hemavet 950 Cell Counter	Drew Scientific	CDC-9950-002
NAPCO series 8000WJ Incubator	Thermo scientific
Allegra X-15R Centrifuge	Beckman Coulter	392932
Mini Mouse Bench centrifuge	Denville	C0801