Summary
يستخدم تخطيط العضل الضغط لتقييم vasoactivity من الشرايين الصغيرة التي تطور انقباض مستمر عند الضغط. توفر هذه المخطوطة بروتوكول مفصلة لتقييم في قطاعات معزولة الشرايين المساريقي صغيرة من الفئران، vasoactivity وتأثير الضغط داخل اللمعة على قطر الأوعية الدموية.
Abstract
الشرايين مقاومة صغيرة انقباض وتمدد على التوالي ردا على زيادة أو نقصان الضغط داخل اللمعة. هذه الظاهرة المعروفة باسم استجابة عضلي هو المنظم الرئيسي لتدفق الدم المحلي. في ظروف إسوي الضغط الشرايين مقاومة صغيرة تتطور يستمر انقباض عضلي يعرف لهجة (MT)، والذي هو أحد المحددات الرئيسية لمقاومة الأوعية الدموية الجهازية (SVR). وبالتالي، خارج الحي الاستعدادات الضغط في الشرايين مقاومة صغيرة هي الأدوات الرئيسية لدراسة وظيفة الاوعية الدموية الدقيقة في ولايات شبه الفسيولوجية. لتحقيق ذلك، هي التي شنت على قطاع سليمة المعزولة حديثا في الشريان مقاومة صغيرة (قطر ~ 260 ميكرون) على اثنين قنية كوب صغير والضغط. هذه الاستعدادات الشرايين تحتفظ معظم الخصائص في الجسم الحي وتقييم تصريح لهجة الأوعية الدموية في الوقت الحقيقي. هنا نقدم بروتوكول مفصلة لتقييم vasoactivity في ضغط الشرايين الصغيرة مقاومة المساريقي من الفئران. هذه الشرايين تطويرتضيق الأوعية المستدام - ما يقرب من 25٪ من القطر الأقصى - عند الضغط على 70 مم زئبقي. ويمكن استخدام هذه الاستعدادات الشرايين لدراسة تأثير مجمعات الفحص على العلاقة بين الضغط داخل الشريان وvasoactivity وتحديد التغيرات في وظيفة الاوعية الدموية الدقيقة في النماذج الحيوانية من الأمراض المختلفة.
Introduction
الشرايين مقاومة صغيرة هي المحددات الرئيسية للSVR وتلعب دورا هاما في الفيزيولوجيا المرضية لكثير من الأمراض 1،2. أمراض مثل السكري 3، 4 الحمل، نقص التروية، ضخه 5، والسمنة وارتفاع ضغط الدم 6،7 كثيرا ما ترتبط مع وظيفة الاوعية الدموية الدقيقة المتغيرة. يمكن تخطيط العضل الأوعية الدموية ليس فقط توفير معلومات هامة إلى تغيرات في وظيفة الاوعية الدموية الدقيقة في أمراض مختلفة ولكنها تساعد أيضا في تحديد الأهداف العلاجية وتقييم فعالية مركبات فعال في الأوعية. وقد درس وظيفة الأوعية الدموية باستخدام الشرايين الصغيرة المعزولة في ظل ظروف سفينة متساوي القياس أو إسوي الضغط 8. وتقدم وصفا تفصيليا للتخطيط العضل متساوي القياس في أماكن أخرى 9. ولكن هناك اختلافات في البيانات التي تم الحصول عليها من متساوي القياس مقابل الاستعدادات إسوي الضغط 10-12. منذ الاستعدادات الشرايين الضغط تسمح للدراسة وظيفة الاوعية الدموية الدقيقة في ظروف شبه الفسيولوجية، والنتائج التي تم الحصول عليها قد ترتبط بشكل أفضل مع السلوك في الجسم الحي من السرير الوعائي 8،13.
في عام 1902 وصف بايليس أول تأثير الضغط على الأوعية الدموية بطريق قطر 14. ولاحظ في الشرايين مقاومة صغيرة من مختلف سرير الأوعية الدموية من الأرانب والقطط والكلاب التي تم إتباع انخفاض في الضغط من قبل توسع الأوعية، وأعقب زيادة في الضغوط التي تضيق الأوعية. وتعرف هذه الظاهرة باسم استجابة عضلي. لاحظ بايليس والمحققين لاحقا أنه في الظروف إسوي الضغط الشرايين مقاومة صغيرة تتطور انقباض مستمر المعروفة باسم MT 15،16. كلا استجابة عضلي وMT يمكن تقييمها باستخدام الضغط تخطيط العضل (PM) تقنية. يستخدم PM أساسا لتحديد vasoactivity من الشرايين الصغيرة والأوردة والأوعية الأخرى. بالإضافة إلى تقييم أثر فعال في الأوعية المركبات على قطر الأوعية الدموية، وPM - كما يشير الاسم - يستخدم لتقييم داخل الأوعية الفصل الضغط بوساطةفي نفس الفئة على قطر الأوعية الدموية. على مدى العقود القليلة الماضية التقدم في برامج الكمبيوتر، مما عزز المجهر الفيديو والزجاج ماصة سحب، جعلت PM اسهل أداء. ومع ذلك، تشريح قطاعات سليمة قابلة للحياة من الأوعية الدموية الصغيرة لا تزال شاقة وصعبة في بعض الأحيان. نحن هنا الخطوط العريضة لبروتوكول مفصلة لدراسة استجابة عضلي في الشرايين مقاومة المساريقي صغيرة معزولة عن الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الأمثلة المعروضة هنا هي من التجارب التي وافقت عليها IACUC في جورجيا الحكام جامعة - البروتوكول رقم: # 2011-0408
1. إعداد الكواشف
- إعداد الأسهم حل تشريح: للحصول على 500 مل من محلول المخزون تشريح (5X)، ويحل 21.18 جم كلوريد الصوديوم، 0.875 غرام بوكل، 0.739 غرام MgSO 4، 1.049 غرام اجتماعات الأطراف و0.019 غ EDTA في 450 مل من الماء ملي-Q. ضبط درجة الحموضة إلى 7،3-7،4 باستخدام 1 N هيدروكسيد الصوديوم. جعل وحدة التخزين إلى 500 مل بالماء الملي-Q. ويمكن تخزين محلول المخزون تصل الى 7-10 أيام. انظر الجدول رقم 1 للحصول على قائمة من المواد الكيميائية والباعة بهم. انظر الجدول رقم 2 للتركيز في ملي.
- يعد حل تشريح العمل: يعد حل تشريح عمل جديدة كل يوم. 100 مل من محلول العمل، ويحل 0،091 ز الجلوكوز، 0.016 غرام ناه 2 PO 4 و 0.022 غرام البيروفات الصوديوم في 79.8 مل من الماء ملي-Q. إضافة 0.2 مل 1M CaCl 2 و 20 مل الأسهم حل تشريح لجلب voluلي إلى 100 مل.
- إعداد محلول ملحي الفسيولوجية (PSS): لإعداد 1000 مل PSS، ويحل 0،365 ز بوكل، 6.545 غرام كلوريد الصوديوم، 0.296 غرام MgSO 4، 0.163 غرام KH 2 PO 4، 2.072 غرام جلوكوز، 2.184 غرام NaHCO 3 و 2،383 غرام HEPES في 950 مل من الملة-Q المياه. ضبط درجة الحموضة إلى 7،3-7،4 باستخدام 1 N هيدروكسيد الصوديوم. جعل وحدة التخزين إلى 1000 مل بالماء الملي-Q. إزالة 2 مل من محلول واستبدالها 2 مل من 1 M CaCl 2. (الطازجة PSS يحتاج إلى أن تكون مستعدة يوميا)
- يعد الكالسيوم (الكالسيوم 2+) PSS الحرة: ل100 مل PSS دون الكالسيوم 2+، ويحل 0.036 ز بوكل، 0.654 غرام كلوريد الصوديوم، 0.029 غرام MgSO 4، 0.016 غرام KH 2 PO 4، 0.207 غرام جلوكوز، 0.218 غرام NaHCO 3، 0،238 ز HEPES، 0.015 غرام EGTA و0.0026 غرام الصوديوم نتروبروسيد (SNP) في 95 مل من الماء ملي-Q. ضبط درجة الحموضة إلى 7،3-7،4 باستخدام 1 N هيدروكسيد الصوديوم. جعل وحدة التخزين إلى 100 مل بالماء الملي-Q.
2. إعداد زجاج قنية
- سحب الماصات الزجاجيةلتوليد 100-150 ميكرون قنية يميل باستخدام مجتذب ماصة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- شطبة النصائح الزجاج قنية باستخدام beveller مسرى مكروي، النار تلميع لهم وثني الزجاج نصائح قنية التي كتبها ~ 45 درجة باستخدام مسبار سخان.
- تحميل قنية إلى صاحب micropipette وإرفاق حامل micropipette إلى غرفة نضح.
3. إعداد غرفة الإرواء
- شطف غرفة نضح بالماء الملي-Q يليه حل تشريح لمدة 5 دقائق لكل منهما. تحميل غرفة مع 2 مل من محلول تشريح.
- شفط حل تشريح من خلال قنية باستخدام 10 مل حقنة وملء بعناية قنية كامل وأنابيب المرفقة دون أي فقاعات. تطبيق شفط بلطف لمنع توليد فقاعات.
- إعداد اثنين من الغرز مع عقدة نصف كل باستخدام الملقط حادة. منذ العيون خيوط النايلون حيدة (10-0، 0.2 المتري) وتستخدم لإعداد عقدة التي هي فقط1-2 مم في القطر، قد تكون هناك حاجة إلى مجهر تشريح.
- تصور تحت المجهر تشريح، واستخدام ملقط تشريح لتحميل كل من قنية مع عقدة الخيط مغلقة جزئيا بعيدا قليلا عن طرف. في وقت لاحق سيتم انزلق هذه عقدة بعناية على نهايات الشرايين مقنى ومغلقة تماما.
4. جمع مساريقي الشريان ممر من الجرذان سبراج داولي
- الحصول على موافقة اللجنة المحلية المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) قبل إجراء هذه التجارب. حيوانات المنزل في منشأة الحيوان مع درجة الحرارة للرقابة والإضاءة والسماح بحرية الوصول إلى المياه وطعام القوارض التجاري.
- تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين (80 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ). تأكيد التخدير العميق بواسطة إصبع القدم قرصة وإذا إدارة التخدير اللازمة إضافية.
- بعد التأكد من التخدير الجراحي، الموت ببطء الحيوان بقطع الرأس. اتبع الإرشادات AAALAC لالتهاب المسالك البوليةLIZING الأساليب المناسبة للقتل الرحيم الحيوان.
- استخدام مقص تشريح وملقط لإجراء عملية فتح البطن منتصف خط من الحوض إلى القص. ويتم ذلك في خطوتين: أولا، شق الجلد والثانية، شق الطبقة العضلية الأساسية. يجب الحرص على عدم جرح الأجهزة داخل البطن.
- قطع نهاية القريبة من قريب الأمعاء إلى بوابة المعدة والنهاية البعيدة على مقربة من مفترق ileo الأعور. ربط طرفي منفصل لمنع تسرب الكيموس والبراز وبالتالي تجنب تلوث حل الاستحمام خارج الخلية. شق مساريق عند قاعدته قرب تغذية الأوعية الدموية أي الشريان المساريقي العلوي ونقل السرير المساريقي الأمعاء الصغيرة بأكمله إلى دورق 50 مل تحتوي على حل تشريح الجليد الباردة.
- تسمح الأنسجة حصاد للبقاء في الجليد حل تشريح البارد لمدة 5 دقائق ويشطف بمحلول تشريح جديدة للتخلص من الدم.
5. عزل وكيفية تركيب الكانيولا من 4 عشر
- ماهيتها نهاية الداني من الأمعاء على الجانب الأيمن في طبق المغلفة sylgard. تمديد الأمعاء المتبقية في مسار عكس اتجاه عقارب الساعة، تعلق في الجزء الأسفل لنشر مساريق وفضح الأوعية الدموية (الشكل 1). ملاحظة: نحن عزل قطاعات الشرايين في درجة حرارة الغرفة. وإلا فإننا وضع الممرات المساريقي تحتوي على طبق على الجليد. بعض المعامل، بما في ذلك تلك الموجودة في مؤسستنا، واستخدام وحدات التبريد لتشريح الشرايين عند 4 درجات مئوية.
- تحت المجهر التكبير ستيريو تشريح من 3 و 4 تشرين أجل الشرايين المساريقي صغيرة (~ 260 ميكرون) بالتوازي مع الأمعاء الدقيقة باستخدام مقص صغير. أولا تشريح بعيدا عن الدهون غطاء. ثم تشريح خارج الوريد وعزل الشريان مع-V على شكل نقطة تفرع. يجب الحرص على عدم ثقب الجزء المحدد. بدء تشريح الدهون قرب فرع ترتيب 2 الثانية، والعثور على وسيلة إلى 3 أو 4 تشرين أوردسفن إيه.
- ويمكن التمييز بين الشرايين والأوردة على أساس سمك الجدار بهم - الجدار الشرياني هو أكثر سمكا من في الوريد: مذكرة. وعلاوة على ذلك، عندما المجاورة النسيج الضام يتم سحبها عمودي بلطف إلى انهيار الأوعية والأوردة بسهولة بينما لا الشرايين لا. منذ الشرايين مع قطر التجويف <400 ميكرون من المواقع الرئيسية في المقاومة الوعائية الجهازية، لهذا البروتوكول استخدمنا 4 تشرين أجل الفئران الشرايين المساريقي (التجويف قطرها <300 ميكرون).
- عزل القسم 4-5 ملم من الشريان بالتوازي مع الأمعاء الدقيقة. تصور كل أمر عشر فرعا 5 التضمين في الأمعاء الدقيقة وقطع منها بعيدا قليلا عن أصل الفروع والحفاظ على جزء. هذه الأجزاء المحفوظة من الفروع بمثابة عقد المواقع (مع ملقط تشريح) لنقل شرائح الشرايين إلى غرفة التروية، وتوجه بعد ذلك إقناء؛ إدخال القنية الخاصة بهم.
- ثم قطع شرائح الشرايين بجعل 2 الشقوق البعيدة لفروع أجل ال 5 على كل جانب من الشريان ونقلها إلى غرفة نضح (انظر الشكل 1C والأسطورة).
- يقني؛ يدخل القنية نهاية واحدة من السفن على واحد من الزجاج micropipette (القطر: 100-150 ميكرون) باستخدام ملقط تشريح عن طريق الضغط على نصائح من الجزء شرياني مع ملقط تشريح. حرك تحميلها سابقا خياطة مغلقة جزئيا إلى نهاية مقنى وثبته. ملاحظة: نهاية القريبة من الشريان يمكن مقنى على قنية الزجاج التي يتصل بها جهاز تنظيم الضغط التي تسيطر عليها أجهزة لمحاكاة البيئة في الموقع.
- إرفاق حل تشريح تحميل 10 مل حقنة لمحبس المتصلة بهذا قنية مثل هذا الحل تشريح في الأنبوب الذي يربط بين قنية ومحبس يدمج مع أنه في حقنة. بلطف رفع حقنة. فإن قوة الجاذبية على حل إزالة الدم في الأوعية الدموية داخل من نهاية مفتوحة للسفينة. بعد إزالة الدم داخل الشرايينإغلاق محبس.
ملاحظة: بدلا من ذلك، ونعلق محبس للتحكم الضغط، قم بتشغيله وزيادة الضغط بلطف إلى 5-10 ملم زئبق لتحقيق نفس النتيجة. - ربط نهاية البعيدة للسفن على قنية الزجاج الثانية من خلال جلب بعناية قنية أخرى في أقرب وقت ممكن إلى نهاية غير مشروطة للجزء الشرايين. حرك تحميلها سابقا خياطة مغلقة جزئيا إلى نهاية مقنى وثبته. يجب الحرص على عدم الجرار أو سحب على قطاعات الشرايين. تأكد من أن الصمامات تعلق على كل قنية مغلقة.
- نقل غرفة نضح إلى مرحلة مجهر مقلوب مجهزة تسجيل لقطات فيديو حية.
- ربط محبس من قنية مرتبطة نهاية القريبة من قطاع الشرياني إلى جهاز تنظيم الضغط التي تسيطر عليها أجهزة وتأكد من أن محبس تعلق على قنية أخرى لا تزال مغلقة للحفاظ على الضغط داخل اللمعة مستقر.
- المقبل، نعلق على أنابيب فراغ إلى ميناء الشفط لالثاني نضح أنابيب إلى ميناء نضح من الغرفة.
ملاحظة: يستخدم مشطوف ميناء إبرة شفط وميناء إبرة حادة لنضح. - بدء نضح من السفينة مع دافئ PSS من خلال واحد سخان حل مضمنة (37 ° C، معايرتها مع خليط الغاز: 5٪ CO 2، 5٪ O 2 و 90٪ N للحفاظ على درجة الحموضة محايدة والأوكسجين الكافي 17) في 2 مل / دقيقة باستخدام مضخة تحوي. تحويل الفراغ على كذلك. وضع الثرمستور في غرفة لمراقبة درجة الحرارة بشكل مستمر.
- كما أن درجة الحرارة من جهاز الأمن الوقائي في الغرفة اقتراب ~ 37 درجة مئوية (عادة في غضون 5 دقائق)، وزيادة الضغط ببطء داخل اللمعة 20-100 مم زئبق وتحقق من السفن من وجود تسرب. ويتم ذلك باستخدام الإعداد التلقائي للضغط منظم الضغط. تجاهل السفن مع تسرب واستبدالها مع مقطع آخر. فإن السفن مع التسريبات لن تكون قادرة على الاستمرار على الضغط.
- تقييم الجزء الشرياني لالمنعطفات مع الحفاظ على الضغط عند 100 مم زئبق.باستخدام المسمار رافعة، نقل قنية لتصويب الجزء الشرياني. لا على امتداد قطاعات الشرايين. والهدف من ذلك هو تقليد في الجسم الحي طول الجزء الشرياني.
- تخفيف الضغط إلى 70 مم زئبق (لتقليد في ضغط الجسم الحي في الممرات المساريقي 18) والسماح للقطاع الشرايين لترسيخ الاستقرار والتنمية لهجة عضلي. يمكن ضغط الشرايين بنسب مختلفة (40-70 مم زئبق) وفقا لاستراتيجية التجريبية والسرير الوعائي. يوفر مراجعة نشرت سابقا استعراض ممتاز من التباين في MT في قطاعات الشرايين من أسرة الأوعية الدموية المختلفة 8.
6. قياس القطر الشرياني
- مشاهدة الشرايين في الهدف 10X على المجهر مزودة بكاميرا الجهاز المسؤول عن جانب أحادية الفيديو. قياس قطرها اللمعية باستخدام إطار الفيديو المختطف في الوقت الحقيقي ونظام الحافة الكشف. وهناك قائمة من المعدات المستخدمة في الجدول 3.
- رصد والأوعية سجل دiameter بشكل مستمر.
- مراقبة لتطوير MT. ملاحظة: لاحظنا أنه في الفئران الشرايين مقاومة المساريقي، في 70 مم زئبق، وتتميز تطوير MT التي كتبها ~ انخفاض بنسبة 20٪ في قطر. MT يختلف وفقا لنوع السرير والحيوان الأوعية الدموية.
- تأكيد بقاء الأوعية الدموية عن طريق تقييم مضيق للأوعية وعائي الردود على 1 ميكرومتر فينيليفرين (الفنيل ألانين) و 1 ميكرومتر أستيل كولين (ACH).
- في نهاية كل تجربة، وتحديد قطرها السلبي (PD) التي يحتضنها الشرايين في كا 2+ خالية PSS لمدة 20 دقيقة.
7. الاستجابة عضلي
- تخفيف الضغط إلى 20 ملم زئبق، والسماح للقطر لتحقيق الاستقرار. زيادة الضغط داخل اللمعة في خطوات تدريجية (20، 40، 60، 80 و 100) وعند كل خطوة ضغط الشرايين تسمح لتحقيق القطر مستقر (عادة في غضون 5 دقائق).
- تقليل الضغط داخل اللمعة إلى 20 مم زئبق واحتضان شريحة الشرايين في كا 2+ خالية PSS تحتوي على 0.39 ملمEGTA و 0.1 ملي SNP. السماح قطر الشرايين لتحقيق الاستقرار (عادة 15 دقيقة).
- تكرار استجابة الضغط خطوة في كا PSS 2+ خالية تحتوي على 0.39 ملي EGTA و 0.1 ملي SNP.
8. تفسير النتائج وحساب البيانات
- حساب MT بالفرق في المئة في قطر لوحظ ل Ca 2+ المحتوية على الكالسيوم مقابل 2+ خالية PSS في كل الضغط وفقا لحساب التالية:
- لالشرايين التي تمر تغير القطر الوعائي قطر قد تحسب عن طريق حساب متوسط مرحلة الهضبة لمدة 1 دقيقة. التعبير عن البيانات التي تم جمعها كنسبة مئوية من الاسترخاء الأقصى (٪ PD) وفقا للعلاقة:٪ PD = 100 × [ΔD / PD]. ΔD هو الفرق بين القطر قبل وبعد إضافة أي مركب إينفستيغأيشنل (مثل الفنيل ألانين)؛ PD هو القطر السلبي (أيضاقطر القصوى).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد التمثيل التخطيطي الضغط نموذجي مخطاط العضل انشاء في الشكل 1. ومقنى طرفي السفينة مع micropipette الزجاج والمضمون مع الغرز على الجانبين. عبر أنابيب ومحبس مفتوحة، يتم توصيل قنية واحد إلى الضغط المنظم التي تسيطر عليها مضاعفات. يتم توصيل قنية أخرى إلى محبس مغلقة. وperfused لغرفة مع ويلاحظ من خلال مجهر مقلوب متصلة كاميرا CCD PSS وقطر الأوعية الدموية التغييرات.
وحضنت الجزء الشرياني الضغط على 70 مم زئبقي في طازجة PSS الدافئ، الذي يتدفق من خلال غرفة الشرايين في 2-4 مل / دقيقة وشفط بها. ويتم رصد قطر الشرياني وتسجيلها باستخدام videomicroscopy والكشف عن الحافة البرمجيات. بعد ~ 40 دقيقة، وقطاعات الشرايين تضيق بشكل عفوي بنسبة 20-40٪ من قطرها بدايتها (الشكل 2A). في أيدينا الشرايين مقاومة الفئران الصغيرة انقباض بنسبة 25-30٪ (متوسط فاريوفاق وفقا للإعدادات، المشغل، وسرير الشرياني). ثم، يتم تقييم الجدوى الفنية من خلال عائي ومضيق للأوعية الردود على أدن تشافيز (1 ميكرومتر) والفنيل ألانين (1 ميكرومتر)، على التوالي (الشكل 2A). في حين موسعات أخرى يمكن استخدامها، أدن تشافيز يحث تعتمد على البطانة توسع الأوعية وبالتالي من المفيد في تقييم كل من البطانية وكذلك قابلية العضلات الملساء في الأوعية الدموية. في وقت لاحق هذا الجزء الشرياني وإعادة المحتضنة في PSS وبمجرد أن يستقر في قطر، وانها مستعدة للتجربة. في نهاية كل تجربة، يتم تحضين شرائح الشرايين في كا 2+ مجانا PSS لقياس PD (الشكل 2B). يتم جدولتها أقطار المسجلة في الشكل 2A و 2B في الشكل 2C. مطلق MT هو الفرق بين PD وقطر مستقر يتحقق على تضيق الأوعية عفوية في 70 مم زئبق. وبالتالي، فإن MT يلاحظ من تتبع المبين هو 33٪ من PD. كما رأينا هنا، استجابة لأدن تشافيز (1 ميكرومتر) هي شركة جنرال الكتريك تشبه nerally لتلك التي لوحظت ل Ca 2+ مجانا PSS. لاحظ أنه في التجارب تقييم توسع الأوعية، قد تكون هناك حاجة إلى ذلك مسبقة من مضيق للأوعية.
لتحديد استجابة عضلي، تتعرض الفئران شرائح الشرايين المساريقي إلى زيادة الضغط داخل اللمعة الخطوات ما بين 20 و 100 مم زئبق. يتم عرض مثال في الشكل 3A. يسمح الشرايين لتحقيق القطر مستقر بعد كل خطوة (~ 5 دقائق، الخطوط المتقطعة). وفي وقت لاحق، يتعرض هذا الجزء الشرياني نفسه لضغوط للاستجابة في كا 2+ خالية PSS مع 0.39 ملي EGTA و 0.1 ملي SNP (الشكل 3A). قطر حققت في نهاية كل خطوة الضغط قد يكون كما هو مبين في الرسم البياني خط (الشكل 3B). MT المحسوبة على النحو الفرق في المئة في قطر ل Ca 2+ المحتوية مقابل الكالسيوم 2+ خالية PSS في كل الضغوط قد تكون على النحو المبين خط أو شريط الرسم البياني (الشكل 3C).
الإقليم الشمالي "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما ">
الشكل 1: مثال على الضغط مخطاط العضل انشاء (A) يشار إلى المكونات الرئيسية. انظر الجدول 3 للاطلاع على قائمة بجميع المعدات. ويرد (B) سرير المساريقي المقطوع معقود على طبق المغلفة sylgard. يظهر (C) A الكرتون من المساريقي الممرات الشرايين. وتمثل النقاط السوداء مواقف دبوس. يمثل القسم متقطع شريحة الشرايين إلى أن تشريح. أشرطة خضراء صغيرة تشير إلى مواقع شق على الشريان. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
/ftp_upload/50997/50997fig2.jpg "/>
الشكل 2: (A) كما أشار البحث عن المفقودين، وقطره من الشرايين المساريقي صغيرة من الفئران، عندما ضغط على 70 مم زئبقي، ويقلل من تلقاء أنفسهم. إضافة أدن تشافيز (1 ميكرومتر) زادت قطر (إلى قطر بدءا القريب). إضافة الفنيل ألانين (1 ميكرومتر) إلى حمام الأنسجة تنخفض قطر الشرايين. (B) الحضانة في كا 2+ خالية PSS يزيد قطرها الشرايين. وتبويبها (C) ويبلغ قطر شريحة الشرايين ضغط واحد في مختلف perfusates هو مبين في A و B.
الرقم 3: (A) قطر الشرياني يتم تسجيلها بشكل مستمر مع زيادة الضغط داخل اللمعة بشكل متزايد في وجود جهاز الأمن الوقائي والكالسيوم 2+ خاليةPSS. (B) منحنى خط قطرها الشرايين التي تحققت في خطوة كل الضغوط. (C) بار الرسم البياني للMT يتحقق في كل خطوة الضغط. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خطوات حاسمة، استكشاف الأخطاء وإصلاحها وتعديلها
في إعداد سفينة إسوي الضغط نموذجي، يتم ضغط الشريان في 70 مم زئبق بين اثنين قنية الزجاج مع perfused دافئ (37 درجة مئوية) PSS. بعد 30-45 دقيقة والشرايين تطوير MT، التي تتميز بانخفاض عفوية في قطر أن يستقر في 20-30 دقيقة. الشرايين المقاومة من مختلف سرير الأوعية الدموية تطوير MT متغير. على سبيل المثال مقاومة الفئران الشرايين المساريقي تطوير MT ~ 25٪ من PD، في حين الشرايين cremastric قد تحقق MT ~ 40٪ من PD. يجب التخلص من الشرايين التي لا تتطور MT غضون 60 دقيقة. قد تختلف هذه المدة وفقا لسرير والأنواع الأوعية الدموية. الشرايين مع عدم كفاية استجابة لPHE وأدن تشافيز كما ينبغي التخلص منها.
الرقم الهيدروجيني ودرجة حرارة PSS يكون لها تأثير كبير على تطوير MT. درجة الحموضة من جهاز الأمن الوقائي، الذي يجلس لفترات طويلة دون تهوية، قد يزيد. بالإضافة إلى ذلك، في غرفة من غير المرجح أن د الشرايين درجة الحرارةevelop MT. وبالتالي PSS ينبغي الغازية في أقرب وقت ممكن باستخدام خليط الغاز المشار إليها في القسم البروتوكول ودرجة حرارة غرفة نضح ينبغي رصدها بشكل مستمر والحفاظ على ~ 37 درجة مئوية باستخدام سخان التدفق.
وبما أن هذه التجارب هي 3-5 ساعة في مدة، تتعرض غرف نضح والأنابيب المرتبطة PSS لفترات طويلة؛ يمكن الملح رواسب تتراكم في كل من غرفة والأنابيب التي قد تتداخل مع تجارب لاحقة. ومن هنا فمن الأهمية بمكان أن يغسل جيدا غرفة نضح وشطف الأنابيب مع دي المتأينة المياه بعد كل تجربة. وبالمثل، يجب الحرص على تنظيف شامل الطبق المغلفة sylgard تستخدم لتشريح مع دي المتأينة المياه بعد كل تشريح.
القيود
على الرغم من أهميته، PM ديها قيود مختلفة. أولا، فإن تكلفة الجماعية لحيازة PM معدات عالية (~ 22،000 $) ويمكن أن تكون باهظة على وجه اليقين لاإفطار. ويظهر على قائمة مفصلة من المعدات في الجدول 3 ثانيا، هناك حاجة إلى الأوعية جديدة لمعظم التجارب؛ ومن ثم الموت الرحيم حيوان جديد لكل تجربة، إضافة إلى التكلفة الإجمالية. الثالث، تشريح الشرايين المساريقي صغيرة مملة ويتطلب أدوات أخرى مثل المجهر تشريح وتسليخ مجهري الأدوات، التي هي عرضة للضرر. رابعا، هناك منحنى التعلم. اكتساب الخبرات في إنشاء وPM في المختبر يتطلب الموظفين المتفانين والوقت والجهد.
أهمية فيما يتعلق بأساليب أخرى والتطبيقات المستقبلية
البروتوكولات التجريبية إسوي الضغط ومتساوي القياس هما النهج الرئيسية المستخدمة لتحديد تفاعل الأوعية الدموية. وعلى النقيض من الاستعدادات إسوي الضغط، يتم تحديد vasoactivity في الأعمال التحضيرية متساوي القياس عن طريق قياس الأوعية الدموية توتر العضلات الملساء باستخدام نظام الأسلاك مخطاط العضل. بالإضافة إلى الاختلافات في المعدات المطلوبة لهذه البروتوكولات التجريبية اثنين، ناهض-Iانكماش nduced مختلفة بين هذه المناهج التجريبية في ما يخص الحجم، الوقت مسار واتجاه جدار الأوعية الدموية التوتر 11،19. بسبب الراحة التقنية والقيود، سواء الاستعدادات تخدم أدوارا هامة. على سبيل المثال، لأنه من الأسهل للحفاظ على التركيز على التحضيرات المجهرية متساوي القياس، وغالبا ما تستخدم لقياس وقت واحد من تفاعل الأوعية الدموية وتغيرات في الأوعية الدموية العضلات الملساء الكالسيوم 2+. من ناحية أخرى، وأفضل طريقة لتقييم نشاط عضلي في الأعمال التحضيرية الضغط التي تعتبر لتقليد في الجسم الحي الحالة الفسيولوجية عن كثب. ويرد استعراض مفصل من الاختلافات بين هذه الاستعدادات سابقا 19.
في الختام، الضغط تخطيط العضل هو أسلوب موثوق بها لدراسة استجابة عضلي في الأوعية مقاومة صغيرة في ظروف شبه الفسيولوجية. على الرغم من قصوره، قدمت PM مساهمات كبيرة في فهم التغيرات فيوظيفة الأوعية الدموية في ظروف طبيعية ومرضية 3-7،20-23. تنظيم نغمة الأوعية الدموية الجهازية معقد للغاية وينطوي على عوامل محلية والعصبية الهرموني وبالتالي عزل دور آليات محددة تنظم لهجة الأسرة الأوعية الدموية في الجسم الحي صعبة. في هذا الصدد، خارج الحي الاستعدادات الشرياني الضغط تخدم بدائل ممتازة. ويشار إلى المهتمين في آليات تنبيغ MT والاستجابة عضلي لسبق نشرها ملاحظات ممتازة 15،19. في المستقبل قد نرى التقدم في المعدات التي تعمل على دمج تقييم استجابة عضلي والتغيرات في رسل المصب مثل الكالسيوم 2+ على الرغم من أنه من غير المرجح أننا سوف تشهد تخفيضا في تكاليف المعدات. لكن، وكما تم اعتماد هذه التقنية من قبل العلماء مع خلفية متنوعة، ونحن من المرجح أن نرى تطبيقه لتقييم التغيرات في وظيفة الاوعية الدموية الدقيقة في أمراض أخرى غير ارتفاع ضغط الدم والسكري وصدمة مثل تليف الكبد، وديmentia الخ
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم الصراعات المالية.
Acknowledgments
ويدعم سانديب كورانا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (K08DKO81479). ويدعم فيكرانت Rachakonda التي كتبها (T32DK067872).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Chemical | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 223506 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | E3889 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma Aldrich | M7506 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| MOPS | Sigma Aldrich | M5162 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Phenylephrine | Sigma Aldrich | P6126 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Potassium chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P3911 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) | Sigma Aldrich | S6014 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium nitroprusside | Sigma Aldrich | 13451 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma Aldrich | S9638 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P8574 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 1. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 2. Composition of Experimetnal solutions | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Equipment | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| CCD Monochrome Camera | The imaging Source | DMK 21AU04 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Single inline solution heater | Warner Instruments | 64-0102 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Thermistor | Warner Instruments | 64-0108 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dual automatic temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Fluorescence System Interface | IonOptix | model FSI-700 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Forceps and scissors | World Precision Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ion Wizard-Core and Analysis | IonOptix | Ion Wizard 6.0 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Laboratory tubing | Silastic | 508-005 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Male Sprague Dawley rat | Harlan Laboratories | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Master flex console drive | Cole-parmer | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Milli-Q Plus Ultrapure Water System | Millipore | ZD5211584 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ophthalmic monofilament nylon suture | Ethicon | 9007G | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Photometry and Dimensioning Microscope | Motic | AE31 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Stereomicroscope | Nikon Instruments Inc | SMZ660 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dissection dish | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW120-6 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Microforge | Stoelting | 51550 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 3. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Christensen, K. L., Mulvany, M. J.
- Rietzschel, E. R. Oxidized low-density lipoprotein cholesterol is associated with decreases in cardiac function independent of vascular alterations. Hypertension. 52, 535-541 (2008).
- Hill, M. A., Ege, E. A. Active and passive mechanical properties of isolated arterioles from STZ-induced diabetic rats. Effect of aminoguanidine treatment. Diabetes. 43, 1450-1456 (1994).
- Osol, G., Cipolla, M. Interaction of myogenic and adrenergic mechanisms in isolated, pressurized uterine radial arteries from late-pregnant and nonpregnant rats. Am J Obstet Gynecol. 168, 697-705 (1993).
- Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28, 176-180 (1997).
- Ren, Y., et al. Enhanced myogenic response in the afferent arteriole of spontaneously hypertensive rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298, H1769-H1775 (2010).
- Hayashi, K., Epstein, M., Saruta, T. Altered myogenic responsiveness of the renal microvasculature in experimental hypertension. J Hypertens. 14, 1387-1401 (1996).
- Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96, 313-326 (1999).
- Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. J Vis Exp. , (2011).
- Buus, N. H., Vanbavel, E., Mulvany, M. J. Differences in Sensitivity of Rat Mesenteric Small Arteries to Agonists When Studied as Ring Preparations or as Cannulated Preparations. British Journal of Pharmacology. 112, 579-587 (1994).
- Falloon, B. J., Stephens, N., Tulip, J. R., Heagerty, A. M. Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations. Am J Physiol. 268, H670-H678 (1995).
- Schubert, R., Wesselman, J. P. M., Nilsson, H., Mulvany, M. J. Noradrenaline-induced depolarization is smaller in isobaric compared to isometric preparations of rat mesenteric small arteries. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 431, 794-796 (1996).
- Khurana, S., Raina, H., Pappas, V., Raufman, J. P., Pallone, T. L. Effects of deoxycholylglycine, a conjugated secondary bile acid, on myogenic tone and agonist-induced contraction in rat resistance arteries. PLoS One. 7, e32006 (2012).
- Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. J Physiol. 28, 220-231 (1902).
- Hughes, J. M., Bund, S. J. Arterial myogenic properties of the spontaneously hypertensive rat. Exp Physiol. 87, 527-534 (2002).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
- Raina, H., Zacharia, J., Li, M., Wier, W. G. Activation by Ca2+/calmodulin of an exogenous myosin light chain kinase in mouse arteries. J Physiol. 587, 2599-2612 (2009).
- Fenger-Gron, J., Mulvany, M. J., Christensen, K. L. Mesenteric blood pressure profile of conscious, freely moving rats. J Physiol. 488 (Pt 3), 753-760 (1995).
- Davis, M. J., Hill, M. A. Signaling mechanisms underlying the vascular myogenic response). Physiol Rev. 79, 387-423 (1999).
- Osmond, J. M., Mintz, J. D., Dalton, B., Stepp, D. W. Obesity increases blood pressure, cerebral vascular remodeling, and severity of stroke in the Zucker rat. Hypertension. 53, 381-386 (2009).
- Ge, Y., et al. Endogenously produced 20-HETE modulates myogenic and TGF response in microperfused afferent arterioles. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 102-103, 42-48 (2013).
- Ryan, M. J., et al. Placental ischemia impairs middle cerebral artery myogenic responses in the pregnant rat. Hypertension. 58, 1126-1131 (2011).
- Bagi, Z., et al. Type 2 diabetic mice have increased arteriolar tone and blood pressure: enhanced release of COX-2-derived constrictor prostaglandins. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 1610-1616 (2005).
