Summary
Pressure myography wordt gebruikt om vasoactiviteit van kleine slagaders die aanhoudende vernauwing ontwikkelen wanneer onder druk te beoordelen. Het manuscript geeft een gedetailleerd protocol te beoordelen geïsoleerde segmenten van kleine mesenterische arteriën van ratten vaatactiviteit en het effect van de intraluminale druk op de vasculaire diameter.
Abstract
Kleine weerstand slagaders vernauwen en verwijden respectievelijk bij toenemende intraluminale of verlaagde druk; dit fenomeen bekend als myogene respons is een belangrijke regulator van de lokale doorbloeding. In isobare omstandigheden kleine weerstand slagaders ontwikkelen aanhoudende vernauwing bekend als myogene toon (MT), dat is een belangrijke determinant van de systemische vasculaire weerstand (SVR). Vandaar, ex vivo onder druk bereidingen van kleine weerstand slagaders zijn belangrijke instrumenten om microvasculaire functie te bestuderen in de buurt-fysiologische toestanden. Hiertoe wordt een vers geïsoleerde intacte segment van een kleine weerstand arterie (diameter ~ 260 urn) aangebracht op twee kleine glazen canules en onder druk. Deze arteriële voorbereidingen behouden meest in vivo kenmerken en vergunning beoordeling van vasculaire tonus in real-time. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het beoordelen van vasoactiviteit in onder druk kleine weerstand mesenterica slagaders van ratten; deze slagaders ontwikkelinglangdurige vasoconstrictie - ongeveer 25% van de maximale diameter - bij een druk van 70 mmHg. Deze arteriële preparaten kunnen worden gebruikt om het effect van de onderzochte verbindingen op tussen intra-arteriële druk en vaatactiviteit onderzoeken en vaststellen veranderingen in microvasculaire functie bij diermodellen van verschillende ziekten.
Introduction
Kleine weerstand slagaders zijn belangrijke determinanten van SVR en spelen een belangrijke rol in de pathofysiologie van vele ziekten 1,2. Aandoeningen zoals diabetes 3, zwangerschap 4, ischemie-reperfusie 5, obesitas en hypertensie 6,7 worden vaak geassocieerd met veranderde microvasculaire functie. Vasculaire myography kunnen niet alleen belangrijke inzichten in veranderingen in microvasculaire functie bij verscheidene ziekten, maar ook helpen bij het identificeren therapeutische targets en het effect van vasoactieve verbindingen te evalueren. Vaatfunctie is onderzocht met behulp van geïsoleerde kleine slagaders onder isometrisch of isobare omstandigheden vat 8. Gedetailleerde beschrijving van isometrische myography elders 9 verschaft. Er zijn echter verschillen in de gegevens die zijn verkregen uit isometrische versus isobare voorbereidingen 10-12. Aangezien onder druk arteriële voorbereidingen kan de studie van microvasculaire functie in de buurt-fysiologische omstandigheden, deverkregen bevindingen kunnen beter met in vivo gedrag van de vasculaire bed 8,13 correleren.
In 1902 eerst beschreven Bayliss het effect van transmurale druk op vasculaire diameter 14. Hij merkte in kleine weerstand arteriën uit verschillende vasculaire bedden van konijnen, katten en honden die een drukafname gevolgd door vasodilatatie en een verhoging van de druk werd gevolgd door vasoconstrictie. Dit fenomeen wordt myogene reactie. Bayliss en daaropvolgende onderzoekers opgemerkt dat in isobare omstandigheden kleine weerstand slagaders ontwikkelen aanhoudende vernauwing bekend als MT 15,16. Zowel myogene reactie en MT kunnen worden bepaald door de druk myography (PM) techniek. PM wordt voornamelijk gebruikt om vaso- activiteit van kleine slagaders, aders en andere vaartuigen bepalen. Naast het effect van vasoactieve verbindingen op vasculaire diameter, PM - zoals de naam al aangeeft - wordt gebruikt om de intravasculaire druk gemedieerde ch beoordelenanges op vasculaire diameter. In de afgelopen decennia is de vooruitgang in de computer software, die verbeterde video microscopie en glazen pipet trekken PM hebben gemaakt gemakkelijker uit te voeren. Echter, dissectie van levensvatbare intacte segmenten van kleine bloedvaten blijft vervelend en soms uitdagend. Hier schetsen we een gedetailleerd protocol om myogene respons in kleine mesenteriale weerstand slagaders geïsoleerd van ratten te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De hier getoonde voorbeelden zijn van experimenten van IACUC goedgekeurd Georgia Regents University - Protocol nr: # 2011-0408
1. Bereiding van reagentia
- Bereid dissectie oplossing stock: Voor 500 ml van de dissectie-oplossing (5x), ontbinden 21.18 g NaCl, 0,875 g KCI, 0,739 g MgSO4, 1,049 g MOPS en 0,019 g EDTA in 450 ml Milli-Q water. Pas de pH op 7,3-7,4 met behulp van 1 N NaOH. Maak het volume tot 500 ml met Milli-Q water. De oplossing kan worden bewaard tot 7-10 dagen. Zie tabel 1 voor een lijst van chemische stoffen en hun leveranciers. Zie tabel 2 voor concentratie mM.
- Bereid werken dissectie oplossing: Bereid verse werkende dissectie oplossing elke dag. Voor 100 ml werkoplossing, los 0,091 g glucose, 0,016 g NaH 2 PO 4 en 0,022 g natriumpyruvaat in 79,8 ml Milli-Q water. Voeg 0,2 ml 1M CaCl2 en 20 ml dissectie oplossing stock aan Volu brengenme tot 100 ml.
- Bereid fysiologische zoutoplossing (PSS): Ter voorbereiding 1.000 ml PSS, los 0,365 g KCI, 6,545 g NaCl, 0,296 g MgSO4, 0,163 g KH 2 PO 4, 2,072 g glucose, 2,184 g NaHCO3 en 2,383 g HEPES in 950 ml Milli-Q water. Pas de pH op 7,3-7,4 met behulp van 1 N NaOH. Maak het volume tot 1000 ml met Milli-Q water. Verwijder 2 ml oplossing en vervangen door 2 ml van 1 M CaCl2. (Fresh PSS moet dagelijks worden voorbereid)
- Bereid calcium (Ca 2+) gratis PSS: Voor 100 ml PSS zonder Ca 2+, los 0,036 g KCI, 0,654 g NaCl, 0,029 g MgSO4, 0,016 g KH 2 PO 4, 0,207 g glucose, 0,218 g NaHCO3, 0.238 g HEPES, 0,015 g EGTA en 0,0026 g Natrium nitroprusside (SNP) in 95 ml Milli-Q water. Pas de pH op 7,3-7,4 met behulp van 1 N NaOH. Maak het volume tot 100 ml met Milli-Q water.
2. Voorbereiding van de Glass Canules
- Trek glas pipettende 100-150 urn gekanteld canules met een pipet trekker volgens richtlijnen van de fabrikant gegenereerd.
- Bevel het glas canule tips met behulp van een micro-elektrode beveller, brand ze poetsen en buig het glas canule tips door ~ 45 ° met behulp van een verwarming sonde.
- Laad de canules in micropipet houder en bevestig de micropipet houder op de perfusie kamer.
3. Bereiding van perfusiekamer
- Spoel perfusie kamer met Milli-Q water, gevolgd door dissectie oplossing gedurende 5 minuten elk. Laad de kamer met 2 ml dissectie oplossing.
- Zuig dissectie oplossing door canule met 10 ml spuit en vul zorgvuldig de gehele canule en de bijgevoegde slang zonder bubbels. Afzuigen zachtjes om belletjes te voorkomen.
- Bereid twee hechtingen met een halve knoop elk met stompe tang. Aangezien oftalmische monofilament nylon hechtingen (10-0, 0,2 metrisch) worden gebruikt om de knopen die enkel voorbereiden1-2 mm in diameter, kan dissectie microscoop nodig.
- Visualiseren onder dissectie microscoop, gebruik dissectie tang om beide canules laden met gedeeltelijk gesloten hechtdraad knopen iets weg van de tip. Later deze knopen zal zorgvuldig worden geschoven op de canule arteriële uiteinden en volledig gesloten.
4. Het verzamelen van mesenterica Arcade uit Sprague-Dawley ratten
- Seek goedkeuring van de lokale Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) voor het uitvoeren van deze experimenten. Huis dieren in het dier faciliteit met gecontroleerde temperatuur en de verlichting en de vrije toegang tot water en een commercieel knaagdier chow.
- Verdoven ratten door intraperitoneale injectie van ketamine (80 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg). Bevestig diepe anesthesie door toe-pinch en indien nodig toedienen extra anesthetica.
- Na bevestiging van de chirurgische anesthesie, euthanaseren van de dieren door onthoofding. Volg AAALAC richtlijnen voor utiLizing geschikte methoden voor dierlijke euthanasie.
- Gebruik een dissectie schaar en een tang om een mid-lijn laparotomie uitvoeren vanuit het bekken naar borstbeen. Dit gebeurt in twee stappen: eerst incise de huid en anderzijds incise de onderliggende spierlaag. Zorg moet worden genomen van de intra-abdominale organen niet te verwonden.
- Snijd het proximale uiteinde van darmen nabij de pylorus en het distale uiteinde nabij het ileo-caecum junction. Bind beide uiteinden apart lekken van maagbrij en ontlasting daardoor vervuiling van extracellulaire badoplossing vermeden voorkomen. Incise het mesenterium bij zijn basis in de buurt van het voeden vaatstelsel dwz mesenterica superior en de overdracht van de gehele dunne darm mesenteriale bed in een bekerglas van 50 ml bevat ijskoude dissectie oplossing.
- Laat geoogste weefsel te verblijven in ijskoude dissectie oplossing gedurende 5 minuten en spoel met verse dissectie oplossing om zich te ontdoen van het bloed te krijgen.
5. Isolatie en Canulatie van 4 th
- Vastpinnen het proximale uiteinde van de darm aan de rechterkant in een Sylgard gecoate gerecht. Verleng de overblijvende darm linksom pad pinning het segment naar het mesenterium verspreiden en de bloedvaten bloot (figuur 1). Let op: We isoleren arteriële segmenten bij kamertemperatuur. Anders plaatsen we de mesenteric arcade met schotel op ijs. Sommige labs, ook op onze instelling gebruikt chiller eenheden slagaders ontleden bij 4 ° C.
- Onder een stereo-zoom microscoop ontleden uit 3 e en 4 e orde kleine mesenteriale slagaders (~ 260 micrometer) parallel aan de dunne darm met behulp van een klein schaartje. Eerst ontleden alle bekleding vet weg. Ontleden vervolgens uit de ader en het isoleren van de slagader met een V-vormige tak punt. Wees voorzichtig niet om het geselecteerde segment te doorboren. Start ontleden het vet bij een 2 e orde tak en vind de weg naar 3 e of 4 e order schepen.
- Opmerking: slagaders en aders kunnen worden onderscheiden op basis van hun wanddikte - slagaderwand kruipt ader. Bovendien, wanneer aangrenzende bindweefsel wordt zachtjes loodrecht getrokken om de schepen, aders ineenstorting gemakkelijk terwijl slagaders niet. Sinds slagaders met lumendiameter <400 pm zijn de belangrijkste bezienswaardigheden van de systemische vasculaire weerstand, voor dit protocol gebruikten we 4 e orde rat mesenteriale slagaders (lumen diameter <300 micrometer).
- Isoleer een doorsnede 4-5 mm slagader parallel aan de dunne darm. Visualiseer alle 5 de orde takken integreren dunne darm en snijd ze iets weg van de oorsprong van de takken en een deel behouden. Deze bewaarde delen van takken dienen als houdt sites (met dissectie tang) voor het overbrengen van arteriële segmenten naar een perfusie kamer en vervolgens te begeleiden hun canulatie.
- Knip dan de arteriële segmenten door het maken van 2 incisies distale aan5 de Ode orde takken aan weerszijden van de slagader en overbrengen naar de perfusie kamer (zie figuur 1C en legenda).
- Canule ene uiteinde van de vaten op een glazen micropipet (diameter: 100-150 um) gebruikt dissectie forceps die door de uiteinden van de arteriële segment dissectie pincet. Schuif de eerder geladen gedeeltelijk gesloten hechting op het gecanuleerde einde en zet hem vast. Opmerking: proximale einde van de slagader kan worden canule op het glas canule die verbonden is met servogestuurde-drukregelinrichting te bootsen in situ omgeving.
- Bevestig een dissectie oplossing geladen 10 ml spuit om de plugkraan die op deze canule zodanig dat dissectie oplossing in de buis verbinden van de canule en de plugkraan fuseert met die in de spuit. Voorzichtig verhogen de spuit. De zwaartekracht op de oplossing zal de intra vasculaire bloed uit het open uiteinde van het vat te verwijderen. Na verwijdering van de intra-arteriële, Sluit de kraan.
Opmerking: Als alternatief, bevestig de kraan om de druk controller, zet hem aan en voorzichtig verhogen van de druk tot 5-10 mm Hg om hetzelfde resultaat te bereiken. - Bind het distale uiteinde van de vaten naar een tweede glazen canule door voorzichtig brengen andere canule zo dicht mogelijk bij het ongebonden einde van het arteriële segment. Schuif de eerder geladen gedeeltelijk gesloten hechting op het gecanuleerde einde en zet hem vast. Zorg moet worden genomen niet sleepboot of trek op de arteriële segmenten. Zorg ervoor dat de kranen gehecht aan beide canules zijn gesloten.
- Transfer perfusie kamer op het stadium van omgekeerde microscoop voorzien van live video-opname.
- Sluit de plugkraan van canule verbonden met het proximale uiteinde van arteriële segment een servogestuurde-drukregelinrichting en controleer of afsluitkraan aan het andere canule gesloten blijft stabiel intraluminale druk te handhaven.
- Vervolgens sluit de vacuüm slang aan op de zuigkracht poort van eennd de perfusie slang aan op de perfusie haven van de kamer.
Opmerking: Beveled naald poort wordt gebruikt voor de zuig- en stompe naald poort voor perfusie. - Begin perfusie van vat met warme PSS met enkelvoudige inline oplossing verwarmingselement (37 ° C, geëquilibreerd met een gasmengsel: 5% CO 2, 5% O2 en 90% N tot neutrale pH en adequate oxygenatie 17 handhaven) van 2 ml / min met behulp een peristaltische pomp. Zet het vacuüm ook. Plaats een thermistor in de kamer om voortdurend te controleren temperatuur.
- Wanneer de temperatuur van PSS in de kamer nadert ~ 37 ° C (gewoonlijk binnen 5 minuten), langzaam op intraluminale druk 20-100 mmHg en controleer vaartuigen op lekkage. Dit wordt gedaan met behulp van de automatische druk instelling van drukregelaar. Gooi vaten met lek en vervangen door een ander segment. De schepen met lekken niet in staat om de druk houden.
- Beoordeel de arteriële segment van bochten, terwijl het handhaven van de druk op 100 mmHg.Met behulp van de schroef-hendel, zet de canule aan de arteriële segment recht. Laat dan niet de arteriële segmenten strekken; het doel is na te bootsen in vivo arteriële segmentlengte.
- Verlaag de druk tot 70 mmHg (na te bootsen in vivo druk in de mesenteriale arcade 18) en laat de arteriële segment te stabiliseren en te ontwikkelen myogene toon. Slagaders kan variabel worden onder druk (40-70 mmHg) volgens de experimentele strategie en vasculaire bed. Een eerder gepubliceerde beoordeling biedt een uitstekend overzicht van de variabiliteit in het MT van de arteriële segmenten van verschillende vasculaire bedden 8.
6. Meting van arteriële Diameter
- Bekijk slagaders bij 10x objectief op een microscoop uitgerust met een monochroom video charge-coupled device camera. Meet luminale diameter middels video framegrabber en real-time edge-detectiesysteem. Een lijst van de uitrusting is opgenomen in tabel 3.
- Monitor en opnemen vaartuig diameter continu.
- Let op voor de ontwikkeling van MT. Opmerking: We observeerden dat rat mesenterische arteriën weerstand bij 70 mmHg, ontwikkeling van MT wordt gekenmerkt door ~ 20% afname in diameter. MT afhankelijk van vasculaire bed en diersoorten.
- Bevestig vasculaire levensvatbaarheid door beoordeling vaatvernauwende en vaatverwijdende reacties op 1 uM fenylefrine (Phe) en 1 uM acetylcholine (ACh).
- Aan het eind van elk experiment Bepaal passieve diameter (PD) door incubatie slagaders in Ca2 + -vrij PSS 20 min.
7. Myogene Response
- Verlaag de druk tot 20 mm Hg en laat de diameter te stabiliseren. Verhoging van de intraluminale druk in verscheidene stappen (20, 40, 60, 80 en 100) en elke drukstap laten slagaders naar een stabiele diameter (gewoonlijk binnen 5 minuten) te bereiken.
- Verlaag de intraluminale druk tot 20 mmHg en incubeer de arteriële segment in Ca 2+ -vrije PSS met 0,39 mMEGTA en 0,1 mM SNP. Laat de arteriële diameter (meestal 15 min) te stabiliseren.
- Herhaal de druk-stap reactie in Ca 2+ -vrije PSS met 0,39 mM EGTA en 0,1 mM SNP.
8. Interpretatie van de resultaten en berekening van gegevens
- Bereken het MT als het percentage verschil in diameter waargenomen voor Ca 2+ bevattende versus Ca 2+ -vrije PSS bij elke druk op basis van volgende berekening:
- Voor slagaders ondergaan vatbeweging de diameter kan worden berekend door het middelen van de plateaufase gedurende 1 min. Druk het verzamelde data als percentage van maximale relaxatie (% PD) volgens de relatie:% PD = 100 x [AD / PD]; AD is het verschil tussen de diameter voor en na toevoeging van elke experimentele verbinding (bijv Phe); PD is passief diameter (ook demaximale diameter).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Schematische weergave van een typische druk myograaf opstelling is weergegeven in figuur 1. De twee uiteinden van het vaartuig canule met een glazen micropipet en vastgezet met hechtingen aan beide zijden. Via slangen en een open kraan, wordt een canule verbonden met een servo-gestuurde druk-regulator; de andere canule is verbonden met een gesloten kraan. De kamer wordt geperfuseerd met PSS en vasculaire diameter zijn beschadigd door een omgekeerde microscoop verbonden met een CCD camera.
De arteriële segment onder druk bij 70 mmHg wordt geïncubeerd in vers bereide warme PSS, die stroomt door de arteriële kamer bij 2-4 ml / min en weggezogen. Arteriële diameter wordt gecontroleerd en geregistreerd met behulp videomicroscopie en edge detectie software. Na ~ 40 min, arteriële segmenten vernauwen spontaan 20-40% van hun uitgangspositie diameter (figuur 2A). In onze handen vernauwen kleine rat weerstand slagaders met 25-30% (gemiddeld varies volgens de instellingen, de exploitant, en arteriële bed). Vervolgens wordt functionele levensvatbaarheid beoordeeld door vasodilator en vasoconstrictieve respons op ACh (1 uM) en Phe (1 uM), respectievelijk (Figuur 2A). Terwijl andere vasodilatoren worden gebruikt, ACh induceert endotheel-afhankelijke vaatverwijding en is dus nuttig om zowel endotheliale en vasculaire gladde spieren levensvatbaarheid. Vervolgens wordt de arteriële segment opnieuw wordt geïncubeerd in PSS en zodra de diameter stabiliseert, is het klaar voor experiment. Aan het eind van elk experiment worden slagadersegmenten geïncubeerd in Ca2 + vrij PSS PD (figuur 2B) te meten. De opgenomen in figuur 2A en 2B diameters zijn getabelleerd in figuur 2C. Absolute MT is het verschil tussen PD en stabiele diameter bereikt bij een spontane vasoconstrictie bij 70 mmHg. Vandaar dat de MT waargenomen van de getoonde tracing is 33% van de PD. Zoals hier te zien, respons op ACh (1 uM) is ge nerally vergelijkbaar met dat voor Ca 2+ vrije PSS. Merk op dat in experimenten beoordeling vasodilatatie, voorafgaande toevoeging van een vasoconstrictor nodig zijn.
Om myogene reactie te bepalen, worden ratten mesenteriale arteriële segmenten onderworpen aan toenemende intraluminale druktrappen tussen 20 en 100 mmHg. Een voorbeeld is getoond in figuur 3A. De arteriën mogen een stabiele diameter bereiken na elke stap (~ 5 min; stippellijnen). Vervolgens wordt dezelfde arteriële segment onder druk staande-respons in Ca2 + -vrij PSS met 0,39 mM EGTA en 0,1 mM SNP (figuur 3A). De diameter bereikte aan het einde van elke druk stap kan worden weergegeven als een lijngrafiek (figuur 3B). MT berekend het percentage verschil in diameter Ca2 + -bevattende vs. Ca 2+ -vrije PSS bij elke druk kan worden weergegeven als lijn of staafdiagram (Figuur 3C).
nt "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figuur 1: Een illustratie druk myograaf opstelling (A) De belangrijkste componenten zijn aangegeven.. Zie tabel 3 voor een overzicht van alle apparatuur. (B) Geoogste mesenteric bed vastgemaakt op een Sylgard gecoate gerecht wordt getoond. (C) Een beeldverhaal van mesenterische arteriële arcade wordt getoond. Zwarte stippen vertegenwoordigen pin posities. De gestippelde sectie vertegenwoordigt een arteriële segment te worden ontleed. Kleine groene balken geven de incisie sites op de slagader. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
/ftp_upload/50997/50997fig2.jpg "/>
Figuur 2: (A) Zoals aangegeven door het opsporen, diameter van kleine mesenteriale slagaders van ratten, bij een druk van 70 mmHg, vermindert spontaan. Toevoeging van ACh (1 uM) verhoogde de diameter (near-begindiameter). Toevoeging van Phe (1 uM) aan weefselbad vermindert arteriële diameter. (B) Incubation in Ca 2+ -vrije PSS verhoogt arteriële diameter. (C) De diameter van een arterieel segment onder druk in diverse perfusates getoond in A en B getabelleerd.
Figuur 3: (A) Arteriële diameter continu geregistreerd terwijl toenemende intraluminale druk stapsgewijs in aanwezigheid van PSS en Ca2 + -vrijePSS. (B) lijn curve van de arteriële diameter bereikt bij elke drukstap. (C) Bar grafiek van MT bereikt bij elke druk stap. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen, het oplossen van problemen en wijzigingen
In een typische bereiding isobare vat, wordt de slagader op druk 70 mmHg tussen twee glazen canules geperfuseerd met warm (37 ° C) PSS. Na 30-45 min, bloedvaten ontwikkelt MT, gekenmerkt door spontane verlaging in diameter die stabiliseert in 20-30 min. De weerstand slagaders van verschillende vasculaire bedden ontwikkelen variabele MT. Bijvoorbeeld weerstand rat mesenteriale slagaders ontwikkelen MT ~ 25% van de PD, terwijl cremastric slagaders kan bereiken MT ~ 40% van de PD. Slagaders die niet ontwikkelen MT binnen 60 min moet worden weggegooid; deze duur kan variëren afhankelijk van de vasculaire bed en soorten. Slagaders met onvoldoende respons op Phe en ACh moet ook worden weggegooid.
pH en temperatuur van de PSS hebben een aanzienlijke invloed op de ontwikkeling van MT. pH van PSS, die zit langdurig zonder beluchting, kan verhogen. Bovendien, bij kamertemperatuur slagaders waarschijnlijk dEvelop MT. Vandaar dat de PSS moet zo snel mogelijk worden belucht met behulp van het gasmengsel waarschuwingen in het protocol en de temperatuur van de perfusie kamer moet constant worden gecontroleerd en gehandhaafd op ~ 37 ° C met een flow heater.
Omdat deze experimenten zijn 3-5 uur duurden, zijn perfusiekamers en bijbehorende leidingen blootgesteld aan PSS voor lange periodes; zout-neerslagen kunnen opbouwen in zowel de kamer en slangen die kunnen interfereren met latere experimenten. Daarom is het essentieel om grondig de perfusie kamer en spoel de buis met gedeïoniseerd water na elk experiment. Ook moet erop worden genomen om de Sylgard-gecoate schaal gebruikt voor dissectie met gedeïoniseerd water na elke dissectie grondig te reinigen.
Beperkingen
Ondanks het belang ervan, PM heeft verschillende beperkingen. Ten eerste, de collectieve kosten aan te schaffen PM apparatuur is hoog (~ $ 22.000) en kunnen onbetaalbaar voor bepaalde la zijnbs; Een gedetailleerde lijst van materialen is weergegeven in tabel 3 Ten tweede zijn nieuwe vaten nodig voor de meeste experimenten.; derhalve een nieuw dier wordt gedood voor elk experiment, waardoor de totale kosten. Derde, dissectie van kleine mesenteriale slagaders is vervelend en vereist andere instrumenten zoals dissectie microscoop en microdissection gereedschappen, die gevoelig zijn voor schade zijn. Ten vierde is er een leercurve; het verkrijgen van expertise in en tot oprichting van PM in een laboratorium vereist toegewijde personeel, tijd en inspanning.
Belang opzichte van andere methoden en toekomstige toepassingen
Isobare en isometrische experimentele protocollen zijn twee belangrijke benaderingen gebruikt om vasculaire reactiviteit te bepalen. In tegenstelling tot isobare preparaten wordt vasoactiviteit in isometrische preparaten bepaald door vasculaire gladde spierspanning gebruik van een draad myograaf systeem. Naast verschillen in apparatuur die voor deze twee experimentele protocollen agonist-induced krimp is anders onder deze experimentele benaderingen met betrekking tot omvang, tijdsverloop en de richting van de vaatwand spanning 11,19. Vanwege technische gemakken en beperkingen, zowel voorbereidingen dienen een belangrijke rol. Bijvoorbeeld, omdat het gemakkelijker is om microscopische aandacht isometrische preparaten handhaven, worden ze vaak gebruikt voor gelijktijdige meting van vasculaire reactiviteit en veranderingen in vasculaire gladde spieren Ca2 +. Anderzijds wordt myogene activiteit best beoordeeld onder druk preparaten die worden beschouwd als in vivo fysiologische toestand na te bootsen. Een gedetailleerd overzicht van de verschillen tussen deze voorbereidingen is eerder 19 verstrekt.
Tot slot, druk myography is een betrouwbare techniek om myogene reactie in kleine weerstand schepen op de buurt-fysiologische omstandigheden te bestuderen. Ondanks zijn beperkingen heeft PM significant bijdragen aan het begrip van veranderingenvaatfunctie in normale en pathologische omstandigheden 3-7,20-23. Regulering van de systemische vasculaire toon is zeer complex en het gaat om lokale en neuro-hormonale factoren waardoor het isoleren van de rol van specifieke mechanismen voor het regelen van de toon van vasculaire bedden in vivo is moeilijk. In dit verband, ex vivo arteriële druk gebracht bereidingen worden als uitstekend surrogaten. Wie geïnteresseerd is in de transductie mechanismen van MT en myogene reactie wordt verwezen naar eerder gepubliceerde uitstekende recensies 15,19. In de toekomst kunnen we ontwikkelingen in apparatuur die beoordeling myogene reactie en veranderingen in stroomafwaartse boodschappers zoals Ca 2+ integreren maar het is zeer onwaarschijnlijk dat we kostenvermindering apparatuur zou zien zien. Aangezien deze methode door wetenschappers met uiteenlopende achtergrond wordt aangenomen zullen waarschijnlijk zien de toepassing wijzigingen in microvasculaire functie bij ziekten met hypertensie, diabetes en shock zoals cirrose, de beoordelenmentia etc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben geen financiële conflicten.
Acknowledgments
Sandeep Khurana wordt ondersteund door NIH (K08DKO81479). Vikrant Rachakonda wordt ondersteund door (T32DK067872).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Chemical | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 223506 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | E3889 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma Aldrich | M7506 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| MOPS | Sigma Aldrich | M5162 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Phenylephrine | Sigma Aldrich | P6126 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Potassium chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P3911 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) | Sigma Aldrich | S6014 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium nitroprusside | Sigma Aldrich | 13451 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma Aldrich | S9638 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P8574 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 1. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 2. Composition of Experimetnal solutions | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Equipment | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| CCD Monochrome Camera | The imaging Source | DMK 21AU04 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Single inline solution heater | Warner Instruments | 64-0102 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Thermistor | Warner Instruments | 64-0108 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dual automatic temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Fluorescence System Interface | IonOptix | model FSI-700 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Forceps and scissors | World Precision Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ion Wizard-Core and Analysis | IonOptix | Ion Wizard 6.0 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Laboratory tubing | Silastic | 508-005 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Male Sprague Dawley rat | Harlan Laboratories | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Master flex console drive | Cole-parmer | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Milli-Q Plus Ultrapure Water System | Millipore | ZD5211584 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ophthalmic monofilament nylon suture | Ethicon | 9007G | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Photometry and Dimensioning Microscope | Motic | AE31 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Stereomicroscope | Nikon Instruments Inc | SMZ660 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dissection dish | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW120-6 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Microforge | Stoelting | 51550 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 3. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Christensen, K. L., Mulvany, M. J.
- Rietzschel, E. R. Oxidized low-density lipoprotein cholesterol is associated with decreases in cardiac function independent of vascular alterations. Hypertension. 52, 535-541 (2008).
- Hill, M. A., Ege, E. A. Active and passive mechanical properties of isolated arterioles from STZ-induced diabetic rats. Effect of aminoguanidine treatment. Diabetes. 43, 1450-1456 (1994).
- Osol, G., Cipolla, M. Interaction of myogenic and adrenergic mechanisms in isolated, pressurized uterine radial arteries from late-pregnant and nonpregnant rats. Am J Obstet Gynecol. 168, 697-705 (1993).
- Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28, 176-180 (1997).
- Ren, Y., et al. Enhanced myogenic response in the afferent arteriole of spontaneously hypertensive rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298, H1769-H1775 (2010).
- Hayashi, K., Epstein, M., Saruta, T. Altered myogenic responsiveness of the renal microvasculature in experimental hypertension. J Hypertens. 14, 1387-1401 (1996).
- Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96, 313-326 (1999).
- Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. J Vis Exp. , (2011).
- Buus, N. H., Vanbavel, E., Mulvany, M. J. Differences in Sensitivity of Rat Mesenteric Small Arteries to Agonists When Studied as Ring Preparations or as Cannulated Preparations. British Journal of Pharmacology. 112, 579-587 (1994).
- Falloon, B. J., Stephens, N., Tulip, J. R., Heagerty, A. M. Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations. Am J Physiol. 268, H670-H678 (1995).
- Schubert, R., Wesselman, J. P. M., Nilsson, H., Mulvany, M. J. Noradrenaline-induced depolarization is smaller in isobaric compared to isometric preparations of rat mesenteric small arteries. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 431, 794-796 (1996).
- Khurana, S., Raina, H., Pappas, V., Raufman, J. P., Pallone, T. L. Effects of deoxycholylglycine, a conjugated secondary bile acid, on myogenic tone and agonist-induced contraction in rat resistance arteries. PLoS One. 7, e32006 (2012).
- Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. J Physiol. 28, 220-231 (1902).
- Hughes, J. M., Bund, S. J. Arterial myogenic properties of the spontaneously hypertensive rat. Exp Physiol. 87, 527-534 (2002).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
- Raina, H., Zacharia, J., Li, M., Wier, W. G. Activation by Ca2+/calmodulin of an exogenous myosin light chain kinase in mouse arteries. J Physiol. 587, 2599-2612 (2009).
- Fenger-Gron, J., Mulvany, M. J., Christensen, K. L. Mesenteric blood pressure profile of conscious, freely moving rats. J Physiol. 488 (Pt 3), 753-760 (1995).
- Davis, M. J., Hill, M. A. Signaling mechanisms underlying the vascular myogenic response). Physiol Rev. 79, 387-423 (1999).
- Osmond, J. M., Mintz, J. D., Dalton, B., Stepp, D. W. Obesity increases blood pressure, cerebral vascular remodeling, and severity of stroke in the Zucker rat. Hypertension. 53, 381-386 (2009).
- Ge, Y., et al. Endogenously produced 20-HETE modulates myogenic and TGF response in microperfused afferent arterioles. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 102-103, 42-48 (2013).
- Ryan, M. J., et al. Placental ischemia impairs middle cerebral artery myogenic responses in the pregnant rat. Hypertension. 58, 1126-1131 (2011).
- Bagi, Z., et al. Type 2 diabetic mice have increased arteriolar tone and blood pressure: enhanced release of COX-2-derived constrictor prostaglandins. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 1610-1616 (2005).
