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Immunology and Infection

Descoberta de Novos intracelulares Patógenos por amebas Coculture e Abordagens de amebas de enriquecimento

Published: October 27, 2013 doi: 10.3791/51055
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Microbiology, University Hospital Center and University of Lausanne

Summary

Cocultura amebas é um sistema de cultura de células usando as amebas aderente para crescer selectivamente patogénios intracelulares capazes de resistir as células fagocíticas, tais como amebas e macrófagos. Representa, portanto, uma ferramenta-chave para descobrir novos agentes infecciosos. Enriquecimento amebas permite a descoberta de novas espécies de amebas e das suas bactérias intracelulares específicos.

Abstract

Patógenos intracelulares como legionella, micobactérias e organismos Chlamydia-como são difíceis de isolar, porque eles geralmente crescem pouco ou nada em meios seletivos que são normalmente utilizados para cultivar bactérias. Por esta razão, muitos destes patógenos foram descobertos apenas recentemente, ou na sequência de surtos importantes. Estes patógenos são frequentemente associados com amebas, que servem como-célula hospedeira e permitir a sobrevivência eo crescimento das bactérias. Pretendemos aqui para dar uma demonstração de duas técnicas que permitem o isolamento e caracterização de patógenos intracelulares presentes em amostras clínicas e ambientais: a co-cultura amebas eo enriquecimento amebas. Cocultura amebas permite a recuperação de bactérias intracelulares, inoculando a amostra investigada para um relvado amebas que podem ser infectadas e lisadas por bactérias intracelulares presentes na amostra. Enriquecimento amebas permite a recuperação de amebas presente numa amostra clínica ou ambiental. ThÉ possível levar à descoberta de novas espécies de amebas, mas também de novas bactérias intracelulares crescem especificamente nestas amebas. Juntas, essas duas técnicas ajudam a descobrir novas bactérias intracelulares capazes de crescer em amebas. Devido à sua capacidade para infectar as amebas e resistir a fagocitose, estas bactérias intracelulares também pode escapar a fagocitose pelos macrófagos e, assim, ser patogénico para eucariotas superiores.

Introduction

Antes do advento de diagnóstico molecular, os microrganismos presentes em nichos ambientais ou em amostras clínicas foram frequentemente detectado cultivando-os em diferentes meios selectivos, principalmente em agar em pratos de Petri. O fenótipo das colónias de bactérias e a sua actividade metabólica depois deixada classificação bacteriana ao nível da espécie. Caldo também pode ser usado para aumentar a sensibilidade de detecção. No entanto, ambas as técnicas não permitem a recuperação de bactérias que crescem lentamente ou não em todos nestes meios. Esta é a razão pela qual abordagens moleculares são tão amplamente utilizados hoje em dia. No entanto, a detecção de ADN não fornece nenhuma pista sobre a viabilidade das bactérias. Além disso, ao contrário da cultura, as abordagens moleculares não resultar numa estirpe que pode ser ainda caracterizada.

Estudar patógenos que crescem pouco em meios sólidos ou que as células precisam para crescer é complicado. A maioria destes "difícil crescer" bactérias são intr exigenteacelular bactérias, muitas vezes descoberto e caracterizado seguinte grandes surtos como era o caso de Legionella pneumophila. Esta bactéria foi marcado após um surto que ocorreu durante uma convenção da Legião Americana. Tal como muitos como 182 pessoas foram infectadas e 29 morreram devido a uma pneumonia grave 1,2. Mais tarde, foi demonstrado que as amebas foram os anfitriões naturais desta bactéria e que a sua presença nas redes de hotel do sistema de ar-condicionado e água esteve na origem do surto da doença a chamada do Legionário 3.

Amebas estão presentes em todo o mundo e foram isolados do solo, do ar, da água e da mucosa nasal de voluntários humanos (revisada em 4). Essas amebas "vida livre" são geralmente dividindo de forma autônoma no ambiente, mas ocasionalmente pode invadir hospedeiros permissivos 5. Alimentação Amebas em vários microorganismos através de fagocitose e digestão lisossômico subseqüente por hydrolases 6. Muitas bactérias intracelulares facultativos ou obrigatórios são capazes de resistir a digestão e, assim, infectar e se dividir em amebas como por exemplo bactérias ou micobactérias relacionadas com Chlamydia Legionella, (revisto em 7 e 8). Amebas de vida livre provavelmente representam um importante reservatório potencial de bactérias intracelulares que ainda não foram descobertos. Isso levou nosso grupo a implementar em Lausanne duas técnicas principais, chamados de co-cultura amebas e enriquecimento amebas, o que permitiu diferentes grupos para isolar vários novos microrganismos intracelulares obrigatórios a partir de várias amostras ambientais 9-15.

Desde amebas são fagócitos profissionais que pastam em bactérias, uma bactéria capaz de resistir a fagocitose e crescer dentro destes protistas também pode colonizar fagócitos humanos e ser patogênico para seres humanos. Este efeito foi parcialmente demonstrada para algumas bactérias relacionadas com a Chlamydia, como Waddlia chondrophila. W. chondrophila pode crescer não apenas em amebas, mas também em vários tipos de células, tais como células de mamíferos epiteliais, macrófagos, e linhas celulares de peixe 16-18. A co-cultura amebas também parece relevante para a detecção de bactérias intracelulares em amostras clínicas 19,20, incluindo fezes que são fortemente contaminados com diferentes espécies de bactérias 21.

Aqui nós descrevemos as principais etapas de co-cultura amebas e enriquecimento amebas, incluindo (a) tratamento de amostras ambientais e clínicas, (b) o crescimento de amebas em mídia axênicas e em um gramado bacteriano de Escherichia coli e (c) a seleção e caracterização de bactérias intracelulares.

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Protocol

1. Amebas Coculture

1.1 Preparação da amostra

  1. Amostra ambiental
    1. As amostras de água
      Filtra-se a amostra de água (500 ml a 1 litro), por meio de uma membrana de 0,22 de tamanho de poro. Em seguida, agitar a membrana nos ameba salinas PAS médias de página (120 mg de NaCl, 4 mg de MgSO4 • 7H 2 O, 4 mg de CaCl 2 • 2H 2 O, 142 mg de Na 2 HPO 4, e 136 mg de KH 2 PO 4 em 1 L de água destilada).
    2. As amostras sólidas
      Ressuspender as amostras sólidas como amostras do solo de areia e de amostras semi-sólidos tais como lamas activadas em água destilada ou PBS e filtrá-las através de uma membrana de 0,22 de tamanho de poro. Em seguida, agitar a membrana em PAS.
    3. As amostras altamente contaminadas com amebas e protozoários endógeno
      Primeiro sedimentar as amostras por centrifugação a baixa velocidade (180 xg) for 10 minutos ou filtra-se por uma membrana de 5 um de tamanho de poro. Além disso processar o sobrenadante (respectivamente filtrado), como descrito em 1.1.1.
      Nota: Outras técnicas de descontaminação pode ser usado para descontaminar mais amostras ambientais: Aquece-se a amostra a 50 ° C durante 30 min ou tratar com soluções ácidas ou básicas 14.
  2. Amostra clínica
    Processe amostras clínicas, dependendo de suas propriedades físico-químicas. Filtrar ou centrifugar líquidos para remover grandes impurezas. Ressuspender as amostras sólidas. Para usar tecidos, triturá-los, por exemplo, usando um homogeneiser dounce ou contas de vidro, e lisar as células para libertar as bactérias intracelulares.

1.2 Amebas preparação

  1. Preparação Caldo
    Prepare as seguintes mídias: a mídia rica contendo peptona, extrato de levedura e glicose (PYG; 100 g de protease peptona, 10 g de extrato de levedura, 4,9 g de MgSO4 • 7H 2O, 5 g de citrato de sódio • 2H 2 O, 0,1 g de Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 • 6H 2 O, 1,7 g de KH 2 PO 4, 1,97 g de Na 2 HPO 4 • 7H 2 O , 45 g de glicose, e 0,295 g de CaCl 2 em 5 L de água destilada) e um meio não-nutritivo tais como PAS para espécies de Acanthamoeba.
  2. Cultura de amebas
    1. Cultive amebas (preferencialmente Acanthamoeba castellanii ATCC 30010 ou A. polyphaga Linc-AP1) a 25 ° C em frascos de cultura de células contendo 30 ml de meio PYG.
    2. Recolher as amebas, por agitação vigorosa do balão e centrifugar a suspensão de células durante 10 min a 1500 x g. Lava-se a pelete duas vezes com meio PAS. Contar as células num diapositivo Kova e ajustar o volume para se obter uma suspensão de 5 x 10 5 células por ml.
    3. Transferir a suspensão de amebas em microplacas. Use 1 ml por poço para 12 - e 24-wplacas ell, 500 ul para placas de 48 poços e 300 ul para placas de 96 poços. Incubar a microplaca durante pelo menos 2 horas a 25 ° C. Isto permite que a sedimentação e a fixação do amebas para o fundo de cada poço.

1.3 Coculture

  1. Inoculação da amostra
    1. Inocular a placa a partir de 2.3.3, com uma série de diluições da amostra a partir de 1.1 ou 1.2, geralmente com 10 vezes diluições em série, começando com 100 ul de amostra não diluída.
    2. Centrifugue a microplaca a 1.800 xg durante 10 min para sedimentar no relvado amebas os microrganismos potencialmente presentes na amostra. Isso aumenta o contato e fagocitose de microorganismos por amebas.
    3. Incubar as placas durante 45 min a 25 ° C e lava-se três vezes com PAS, substituindo o meio com PAS fresco. Adicionar 1 ml por poço de PAS com ou sem adição de antibióticos (estreptomicina, penicilina, gentamicina e / ou vancomicina), dependendo das bactericidaespécies ai que são procurados.
    4. Incubar a microplaca a 32 ° C numa atmosfera húmida de evitar enquistamento do amebas. Observe cada poço diariamente com um objetivo 20X para detectar a presença de bactérias invasoras e lise amebas.
    5. No caso da lise, realizar uma subcultura em amebas fresco inoculando 100 ul de co-culturas a uma monocamada de cerca de 10 5 amebas / cm 2. Para isolar especificamente uma determinada espécie bacteriana, também inocular ágar específico projetado para estas bactérias (ou seja, ágar BCYE para Legionella spp.).
    6. Na ausência de lise, tomar 100 ml de co-culturas de quatro a sete dias após a primeira inoculação e inocular uma cultura fresca amebas de 900 ul numa placa de 24 poços. Se a lise rápida das amebas é observada sem a proliferação de bactérias, vírus pode estar presente. Neste caso, filtrar o sobrenadante a 0,22 mM e utilizar a suspensão foi filtrada para infectar amibas fresco.

    1.4 isolamento e caracterização de bactérias

    1. Coloração bacteriana
      Realize coculturas diretamente em lamínulas em microplacas de 24 poços. Remover o meio e realizar coloração ou imunofluorescência.
      1. Coloração Romanowsky Modificado
        1. Deixe o lamela seca. Mergulhe a lamela cinco vezes na solução fixadora (2 mg / L Fast Green em metanol).
        2. Imergir a lamela cinco vezes em que a solução de coloração (1,22 g / L Eosina L em tampão fosfato pH 6,6)
        3. Finalmente, mergulhe a lamela 5 vezes na solução de coloração II (1,1 g / L tiazina em tampão fosfato pH 6.6).
        4. Lavar a amostra com água destilada. Deixe secar e observar ao microscópio.
      2. Coloração de Ziehl-Neelsen
        1. Deixe o lamela seca. Cobrir a amostra com Ziehl fucsina. Aqueça o corante com uma chama até vapores aparecer.
        2. Arrefece-se à temperatura ambiente durante pelo menos 5 mine enxágüe com água destilada. Cobrir a amostra com uma solução de ácido clorídrico a 3%, em isopropanol durante 2 minutos e lavar com água destilada.
        3. Capa para 30 seg com azul de metileno e enxágüe com água destilada. Deixe secar e observar ao microscópio 22.
      3. Coloração Gimenez
        1. Prepara-se uma solução estoque de fucsina básica através da mistura de 100 ml de 10% de fucsina básica (10 g de fucsina básica em 100 ml de etanol a 95%), 250 ml de 4% de fenol aquoso e 650 ml de água destilada. Incubar a 37 ° C durante 48 horas antes da utilização.
        2. Deixe o lamela secar e fixar por passagem através de chama. Cobrir a amostra com fucsina básica recentemente filtrada (4 ml de solução de estoque de fucsina básica em 10 ml de 0,1 M de tampão fosfato de sódio, pH 7,45) durante 2 min.
        3. Lavar a amostra com água e incubar em verde malaquita (0,8% em água destilada) por 10 segundos. Enxágüe novamente com água e repita a coloração verde malaquita. Enxágüe novamente com água. Deixe o lamela seca, mount-lo, e observar ao microscópio 23.
      4. Imunofluorescência
        1. Fixar a lamela por incubação em metanol durante 5 min ou com paraformaldeído a 4% durante 10 min.
        2. Lavar três vezes com PBS e incuba-se durante 2 horas em solução de bloqueio (5% BSA, 0,1% de saponina em PBS) à temperatura ambiente.
        3. Incubar a lamela por 1 hora em solução contendo anticorpos produzidos contra o microorganismo de interesse bloqueio.
        4. Lavar novamente três vezes em PBS e incubar durante 1 hora com um anticorpo secundário dirigido contra o anticorpo primário e ligada a um fluoróforo. Lavar três vezes com PBS, montar a lamela e observa por microscopia de fluorescência.
    2. A detecção de ADN por PCR
      Extrair DNA de 100 a 200 ul de cocultura amebas. Detectar microorganismos com primers universais visando o gene 16S rRNA ou primers específicos para as espécies de interesse, como micobactérias 24, Legionella 25 ou membros da Chlamydiales 26.

    2. Enriquecimento de amebas

    2.1. A preparação das amostras

    Ressuspender amostras sólidas e semi-sólidos em PAS em vortex. Centrifugar a suspensão a baixa velocidade (180 xg) durante 10 min. Isso permite que o enriquecimento de amebas de vida livre na pelota. O sobrenadante pode ser utilizado para co-cultura amebas e o sedimento de enriquecimento amebas 21.

    2.2. Preparação Médio

    1. Adicionar 1,5 g de agar a 100 mL de PAS e autoclave o meio de 15 min a 121 ° C. Despeje o meio quente em placas de Petri e deixar solidificar à temperatura ambiente.
    2. Grow Escherichia coli (ATCC 25922) em meio LB ou tioglicolato de caldo durante a noite a 37 ° C. Lavar as bactérias duas vezes com PBS e re-suspender-los em meio PAS. Diluir 10x no PAS e espalhar 2-3 ml desta diluição em uma placa de ágar PAS e deixe secar.

    Adicionar uma gota de amostra (ou de um pedaço de filtro) de um lado da placa e deixe fluir por cima da placa de Petri de modo a formar uma linha no centro do prato.

    2.4. Crescimento de amebas e subcultura amebas

    1. Observe a placa de Petri diária. Se uma frente de migração amebas é detectado, cortar um pequeno pedaço de agar na frente de migração e inocular um novo prato NNA Petri cobertas com uma camada de E. coli.
    2. Repetir o reinoculação várias vezes, dependendo da pureza da amostra, a fim de ter uma cultura pura de uma dada estirpe amebas.

    2.5. Amebas e bactérias caracterização

    1. Raspe as células e ressuspender-los em PAS.
    2. Extrair DNA e determinar a identidade de amebas e / ou endosimbiontes bacterianas por PCR e sequenciação (amplificação de rRNA 16S por bactérias, resp. RRNA 18S por amebas e sequenciação, por exemplo).
      3. <li> Use essas células raspadas no PAS para inocular amebas fresco e realizar uma co-cultura amebas para detectar bactérias possivelmente presentes na amostra.

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Representative Results

Utilizando co-cultura amebas e enriquecimento amebas, toda uma gama de bactérias do ambiente e / ou patogénicos foram descobertos (Tabela 1).

Co-cultura de amebas foi utilizada pelo nosso grupo e outros, para analisar amostras ambientais, estações de tratamento de água e sistemas de distribuição de água. Uma ampla gama de microorganismos pode ser isolado, com esta técnica. As bactérias mais comuns isoladas por co-cultura amebas são membros do gênero Mycobacterium que poderiam ser recuperados a partir de estações de tratamento de água e de redes de água 13,14,24,27,28. Legionella e espécies α proteobactérias também pode ser isolado a partir de estações de tratamento de água e de redes de água do hospital 14,24,28-31. Várias espécies relacionadas com a clamídia também foram isoladas de água do rio e instalações de tratamento de água, como por exemplo Estrella lausannensis (Figuras 2B-C 12,15,32,33.

34-36. Esses vírus são capazes de infectar e se multiplicar dentro de amebas e apresentar uma fase de eclipse típico de seu estilo de vida viral. Os Mimivírus é considerado como um agente patogénico de pulmão humano leve, uma vez que foi implicada numa infecção acidental de um técnico de laboratório que sofriam de pneumonia 37. Patogenicidade potencial de outros vírus gigantes ainda precisa ser investigado.

Enriquecimento de amebas foi muitas vezes utilizado em paralelo com amebas co-cultura. Assim, ao investigar um sistema de estação de tratamento de água e da rede de água a jusante, de 25 diferentes cepas de amebas foram detectados, dos quais 12 correspondem a novas espécies 14. Amebas estavam presentes em todas as etapas de purificação e distribuição de água, indicando uma resistência desses protistas de ozonização e cloração. Bactérias co intracelularuld também ser detectada nestes amebas, mostrando a importância da amebas indígena na transmissão de bactérias intracelulares 14. Em outro estudo, amebas pode ser isolado a partir do sistema de distribuição de água de um hospital 24. A grande maioria das estirpes isoladas neste estudo correspondeu vermiformis Hartmannella, que é naturalmente capazes de sobreviver a temperaturas relativamente elevadas. Várias bactérias, tais como Legionella pneumophila poderia ser detectado na amebas indígena 24. Outro exemplo de bactérias encontradas em uma ameba específico é Parachlamydia acantamoebae. Esta bactéria relacionada com infecção por clamídia foi isolado a partir da mucosa nasal de voluntários do sexo feminino por enriquecimento amebas (Figura 2A), 9 e é um potencial agente de pneumonias 38. Isto novamente mostra a importância de amebas na manutenção e na dispersão de agentes patogénicos bacterianos, que pode ser especialmente patogénico para immunocompromised pacientes 39.

Figura 1
Figura 1. Esboço de co-cultura amebas e enriquecimento amebas descrevendo os passos importantes destas duas técnicas. (Adaptado de 40). Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2
Figura 2. Exemplos de bactérias descobertos por co-cultura amebas e sua observação com diferentes métodos de coloração. A) Coloração de cocos infectar amebas de Parachlamydia acanthamoebae Hall com modificado Romanowsky método 24 horas após a infecção, com uma ampliação de 1000 X. As bactérias são coradas em azul (arrows). aC) microscopia eletrônica de Estrella lausannensis mostrando a morfologia típica estrela de corpos elementares (setas).

Tabela 1. Exemplos de bactérias de diferentes classes descobertos por co-cultura amebas.

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Discussion

Co-cultura de amebas e enriquecimento amebas são métodos eficientes que permitiram o isolamento de muitas novas espécies de bactérias e amebas. Os resultados obtidos com estes métodos confirmam a presença ubíqua de ambos amebas e bactérias resistentes ameba do ambiente, e mais interessante em redes de água feitos pelo homem, que são considerados para ser controlada por meio de tratamentos químicos tais como a cloração e ozonização. Co-cultura de amebas e enriquecimento amebas são ferramentas essenciais para isolar e cultivar esses microrganismos potencialmente patogênicos e para a obtenção de cepas em cultura pura, para depois estudar ainda mais a sua biologia e patogenicidade. Recentemente, este método foi adaptado para o isolamento de alto rendimento de vírus gigantes 41. Da mesma forma, pode ser co-cultura amebas automatizado e usado como uma técnica de rotina para testar a qualidade microbiológica de amostras ambientais e sistemas de água sintéticos, tais como água potável.

Co-cultura de amebas podeser realizada com diferentes espécies de amebas. Nós geralmente preferem usar Acanthamoeba castellanii ou A. polyphaga uma vez que são menos propensas a enquistamento de vermiformis Hartmannella e uma vez que eles exibem um espectro relativamente largo de acolhimento. Outras espécies podem ser utilizados, mas o protocolo e caldo deve ser adaptado. Foi recentemente demonstrado que a A. lenticulana (ATCC 30841) podem ser utilizados nas mesmas condições como A. castellanii ou A. polyphaga mas tem sensibilidade diferente à infecção por 42. Para evitar enquistamento, é importante o uso de uma temperatura de incubação relativamente baixo (inferior a 30 ° C) e para manter uma atmosfera húmida.

Notável, a replicação contínua de simbiontes amebas não levará necessariamente à lise amebas e quando procurando especificamente simbiontes, triagem por microscopia e / ou PCR deve ser realizada de forma sistemática. Para evitar a lise ou descolamento de ce amebas lls devido ao crescimento excessivo de bactérias, é útil para realizar a inoculação de amostras contaminadas utilizando diluições em série 10 vezes.

No entanto, estas técnicas apresentam limitações. Devido à utilização de uma única espécie de amebas, a co-cultura de amebas pode não permitir o isolamento de bactérias que usam como reservatório de outra espécie de amebas. Além disso, essas espécies de amebas específicos podem não ser capazes de proliferar em E. gramados coli e pode ser perdida por enriquecimento amebas. Dependendo das propriedades das bactérias ou amebas investigados, que poderia ser necessário para testar diferentes meios, diferentes espécies de amebas e diferentes espécies de bactérias para alimentar amebas (Enterobacter doacae e algumas estirpes de Pseudomonas são boas alternativas). A contaminação bacteriana das amebas ou a mídia utilizada para co-cultura amebas podem ocorrer e podem levar a resultados falsos positivos. Um controle negativo é, portanto, obrigatório para evitar tais resultados falsos positivos.

conteúdo "> Em conclusão, co-cultura amebas e enriquecimento amebas são duas abordagens complementares que representam ferramentas interessantes para especificar a ecologia e biodiversidade de amebas de vida livre e de bactérias resistentes amebas. Estas técnicas permitem a descoberta de muitas novas espécies, incluindo as amebas, bactérias e vírus gigantes, formando a base para futuros estudos para investigar a patogenicidade destes novos microorganismos.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Agradecemos Pr. Bernard La Scola para conselhos técnicos úteis e interessante discussão sobre co-cultura amebas e enriquecimento amebas. Agradecemos também o Dr. Vincent Thomas por sua ajuda na implementação da técnica em nosso laboratório.

Materials

Classe Exemplos Espécies Referência
α-proteobactérias Odyssella thelassonicensis 10
b-proteobactérias Burkholderia cepacia 36
g-proteobactérias Legionella drancourtii 26
Chlamydiae Estrella lausannensis 30
Flavobacteriae Amoebophilus asiaticus 37
Actinobacteria Mycobacteria spp. 38
Name Company Catalog Number Comments
Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 108342
0.22 μm pore size membrane Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCVPU11RE
proteose peptone Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 211693
yeast extract Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 212750
Cell culture flasks Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 353135
Kova slide Hycor, Indianapolis, IN 87144
cell culture microplates Corning Inc, Corning, NY 3524
Diff-Quik staining kit Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany 130832
Ziehl fuchsin Fluka, St-Louis, MI 21820
basic fuchsin Sigma, St-Louis, MI 857843
Phenol Sigma, St-Louis, MI P1037 Corrosive and mutagenic
malachite green oxalate Fluka, St-Louis, MI 63160
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 15710
Saponin Sigma, St-Louis, MI 84510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fraser, D. W., et al. Legionnaires' disease: description of an epidemic of pneumonia. New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
  2. McDade, J. E., et al. Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).
  3. Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
  4. Rodriguez-Zaragoza, S. Ecology of free-living amoebae. Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).
  5. Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections. J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).
  6. Brussow, H. Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity. Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).
  7. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).
  8. Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).
  9. Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae. Lancet. 349, 925-926 (1997).
  10. Amann, R., et al. Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp. Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).
  11. Birtles, R. J., et al. Candidatus Odyssella thessalonicensis' gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).
  12. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture. Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).
  13. Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure. Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).
  14. Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).
  15. Corsaro, D., et al. Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant. Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).
  16. Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages. Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).
  17. Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila. Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).
  18. Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).
  19. Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia. FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).
  20. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures. Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).
  21. Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture. Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).
  22. Isenberg, H. D. Clinical microbiology procedures handbook. , (1992).
  23. Gimenez, D. F. Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures. Stain Technol. 39, 135-140 (1964).
  24. Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).
  25. Miyamoto, H., et al. Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).
  26. Lienard, J., et al. Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples. J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).
  27. Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan. Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).
  28. Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants. Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).
  29. La Scola, B., et al. Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).
  30. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture. Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).
  31. La Scola, B., et al. Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia. Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).
  32. Collingro, A., et al. Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp. Microbiology. 151, 301-309 (2005).
  33. Lienard, J., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order. Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).
  34. La Scola, B., et al. A giant virus in amoebae. Science. 299, 2033 (2003).
  35. Boyer, M., et al. Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).
  36. Thomas, V., et al. Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets. Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).
  37. Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. Laboratory infection of a technician by mimivirus. Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).
  38. Greub, G. Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia. Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).
  39. Lamoth, F., Greub, G. Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia. FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).
  40. Lienard, J. G. Ch. 6. Environmental microbiology, current technology and water applications. Ashbolt, K., Sen, N. J. , Caister Academic Press. 143-162 (2011).
  41. Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ. Microbiol. , (2012).
  42. Ovrutsky, A. R., et al. Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata. Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).

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Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches. J. Vis. Exp. (80), e51055, doi:10.3791/51055 (2013).

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