Introduction
クラミジアは性感染症、骨盤内炎症性疾患、失明、肺炎、おそらくアテローム性動脈硬化症1-4を含む、世界の健康に大きな負担を惹起細胞内細菌の種によって引き起こされる感染症。液胞の中から、宿主細胞と相互作用するクラミジアの能力は、（封入と呼ばれる）、それらの成功した細胞の感染および宿主のための重要な決定要因です。包含は、クラミジアの成長を可能にし、動的にクラミジア 5の全体の2〜3日の発達サイクルを通じて変更された新たな病原性の区画です。クラミジアの偏性細胞内性質は直接含めることのユニークな生物学を研究するため、特に研究コミュニティに多くの課題を提示。主要なハンディキャップを効率的に蛍光アプローチによって、細胞内のクラミジアやその含有物のいずれかを可視化することができないことでした生きた細胞内のES。最近の発見は、Cを GFP発現を生成するための手段を最終的に明らかにしましたトラコーマ 6;しかし、この発見は、まだ包含の特異的な標識には至っていません。いくつかの技術は、細菌や介在物7,8の標識に記載されているが、彼 らは、このような光退色に対して非特異性、仮初や感受性などの欠点があります。私たちのグループによる重要な発見は、宿主細胞9 GFP発現を使用して含めることを照明するための新たな戦略を確立しました。この戦略は、合理的にダ10 520よりも大きい分子に包接膜の固有の不透過性を利用します。細胞を安定的に特定の細胞質の蛍光タンパク質（例えば、GFPまたはmCherryを）を発現するように操作された場合、 クラミジア介在物は、蛍光の彼らの完全な排除による著しい明快で見ることができます。この逆イメージング戦略は、すべてのクロロフィルのための介在物の即時の可視化を可能にしますamydia種と容易に関心のほとんど宿主細胞に適合させることができます。その有用性の実証として、この方法は、 クラミジア属 9のための細胞の出口経路を明らかにし、定義するために以前に使用されました。
ここでは、さらにこの方法が行われ、包接成長のダイナミクスについての重要な定量的データを得るために活用することができる方法を示しています。また、効果的にコストのかかる抗体ベースの列挙法の代わりにすることができ、そのようなクラミジア 11 mKate2発現などの他の蛍光標識と並行して使用することができます。ツールのこの強力な組み合わせは、宿主細胞を生きた内部クラミジア封入体膜の物性の探査を可能にします。
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Protocol
蛍光ホスト細胞株の1世代
- 2×10 の 6細胞/ウェル6ウェルプレートに1日目プレート293T細胞（または他のレトロウイルスパッケージングライン）、〜75％コンフルエント翌日にします。必要に応じて、各レトロウイルス用プレートの重複ウェルを使用します。
- 2日目を吸引細胞と2 mlを加え、新鮮な増殖培地（DMEM + 10％FBS + 2mM L-グルタミン）。リポフェクタミン2000または同様の試薬 を用いて、製造業者の指示に従って5-8μgのレトロウイルスベクター（GFPを含む）、パッケージングベクターのそれぞれ（ 例えば 、pVSVg）で細胞をトランスフェクトします。
- 37℃のCO 2インキュベーターで4〜6時間のためのDNAで細胞をインキュベートし、続いて1ミリリットルの成長培地で培地を交換してください。
- 37℃のCO 2インキュベーター中で 48時間、細胞をインキュベートします。
- ウェル10 5細胞 /のおおよその密度で6ウェルプレート上で3日目プレートの標的細胞（ 例えば 、HeLa細胞）、〜50％コンフルエントであるために次の日。倒立顕微鏡でGFP蛍光をモニターすることにより、293T細胞で陽性トランスフェクションを確認してください。
- 4日目は、ピペットを用いて293T細胞からレトロウイルス含有上清を収集し、0.45μmの酢酸セルロースシリンジフィルターを通して上清をフィルタリングします。
- HeLa細胞から培地を除去し、16 / mlのポリブレンを含む0.5 mlの増殖培地を追加します。賢明ドロップ、24時間、37℃のCO 2インキュベーターで細胞を培養する細胞にレトロウイルスのフィルタリング〜0.5ミリリットルを追加します。 4℃で（重複ウェルからすなわち 、）残りのレトロウイルスを保管してください。
- 二連のウェルは、余分なレトロウイルスを生成するために行われた場合は5日目には、シリアル残りのレトロウイルス粒子を感染させるためにステップ1.7を繰り返します。
- 選択抗生物質（例えば、500 / mlのネオマイシン）を含む10cmの皿に1：6日目通過は、HeLa細胞1をトランスフェクトしました。
- 形質導入した細胞は、選択antibioの存在に戻って成長するのに十分な時間を待って細胞は、選択抗生物質（ 例えば 、200 / mlのネオマイシン）の低い濃度で、標準的な技術によって増殖させることができ、その後、チック。
注：必要に応じて、細胞はまた、クローン、この時点で理想的な明るさのために選択することができます。
GFP発現クラミジアトラコマティスの2世代
- 2倍のCaCl 2バッファー（20 mMトリスpHは7.4、100 mMのCaCl 2を）と4SPバッファー（0.4 Mショ糖、16mMのの Na 2 HPO 4）を準備します。
- 1日目解凍冷凍C.トラコーマ株式氷上で、すぐに50μlの2倍のCaCl 2バッファーに10μlの細菌を希釈。よく混ぜ、3μgのプラスミドDNA（ 例えば 、PASK-GFP-mKate2-L2）を追加し、25℃で30分間インキュベートします。
- このステップの間に、遠心管にMcCoy細胞のT-75フラスコをトリプシン処理することにより、宿主細胞を準備します。 5分間50×gで細胞懸濁液を遠心し、上清を捨てます。 Resuspen1XのCaCl 2緩衝液の適切な容積中のd細胞ペレットを4×10 7細胞/ mlの最終濃度を得ました。
- （ステップ2.2）から30分間インキュベートした後、形質転換混合物管（総体積200μlの）にMcCoy細胞を用意100μlを添加し、25℃でさらに20分間インキュベートします。 2ミリリットルの成長培地で6ウェルプレートとオーバーレイから単一のウェルに、この形質転換細胞の混合物の100μlのを追加します。 2日間、CO 2インキュベーター中、37℃でインキュベートします。
- 3日目を溶解McCoy細胞は 、Cに感染しました1ミリリットルのdH 2 Oで培地を交換し、曲がっ千μlのピペットチップを用いて細胞を掻き取ってトラコーマ 。 Cの効率的な細胞溶解および放出のための5回1ミリリットル4SPバッファを追加して、〜27.5 G針を通してサスペンションを渡しますトラコーマ 。
- C.を含む細胞溶解物を2mlの転送たてメッキMCCのコンフルエントな単層を含むT-75フラスコにトラコマチスオイ細胞; （FBSなし）8 mlのDMEMを添加し、Cを可能にするために25℃で2時間インキュベート細胞に付着するトラコーマ 。
- 吸引し細胞および10 U / mlのペニシリンGと1 / mlのシクロヘキシミドを補充した新鮮な増殖培地を追加します。 37℃のCO 2インキュベーター中で 48時間、フラスコをインキュベートします。
- 4日目は、細胞が感染していると介在物が異常クラミジアが含まれている光学顕微鏡で確認してください。標準の光学顕微鏡に明るい空胞、および直径2μm以上である介在物内にリング状の物体などの異常クラミジア体として介在物を特定します。
- 2ミリリットルのdH 2 Oで培地を交換し、懸濁液中に細胞をこすり取ることにより、5日目を溶解文化。 2ミリリットル4SPバッファを追加し、約5倍の27.5 G針を通してサスペンションを渡します。
- 6ウェルプレート中で単一ウェルでMcCoy細胞の新鮮な単層を感染させるために、細胞溶解物の2ミリリットルを使用してください。 25℃で2時間溶解液で細胞をインキュベートし、吸引し、新鮮な成長を追加ペニシリンGおよびシクロヘキシミドを含む培地。
- 細胞の一般的な健康状態に応じて、3〜5日間、37℃のCO 2インキュベーター中で細胞をインキュベートします。
- 繰り返し（異常な体を欠いている）通常の探している介在物が出現するまで、6ウェルプレート中の新鮮なウェルに2.9から2.10 1回以上、必要に応じて、継代培養を繰り返します。この時点でことを確認するために倒立蛍光顕微鏡を使用するC.トラコーマは mKate2（赤）を発現します。
- T-150フラスコ中で増殖させ、感染したMcCoy細胞またはHeLa細胞からのクラミジアの形質転換体を採取することにより、たとえば、高力価のクラミジア株を生成するため、感染した培養物をスケールアップ。
3. クラミジアで細胞を感染させます
- IFUの決意とマルチウェルスクリーニングのための、例えばガラスボトムディッシュまたはチャンバースライドの高解像度画像化のために、または24ウェルプレートのための所望の培養容器にプレートGFP-HeLa細胞、。
- あちこち解凍Cを含む禅チューブトラコマティス、C。 muridarum、またはC.氷上ニューモニエ例えばMOI = 1、感染の所望の多重度（MOI）にHBSS中に希釈します。
- 使用される特定のクラミジア株に基づいて静的または遠心支援の感染症のいずれかを実行します。
- C.での感染についてトラコマチス LGV血清型L2またはC. muridarumは 、HBSSでGFP-HeLa細胞を洗浄し、25℃で2時間希釈した細菌とインキュベートします。吸引し、HBSSで細胞を洗浄し、37℃のCO 2インキュベーター中で増殖培地中で細胞をインキュベートします。
- C.トラコマチス血清型DまたはCと感染症肺炎連鎖球菌は 、HBSSでGFP-HeLa細胞を洗浄し、細胞に希釈した細菌を追加します。卓上遠心機で、スイングバケットロータ取付のマルチウェルプレートホルダーにマルチウェルプレートまたは（マルチウェルプレートの蓋にテープで固定）ガラスボトムディッシュを置きます。
- 1時間25℃で900×gで遠心分離した細胞。 1時間、37℃のCO 2インキュベーター中で遠心分離し、場所から培養容器を外します。
- 安全キャビネット内を吸引細胞は、HBSSで細胞を2回洗浄し、新鮮な増殖培地を追加します。 37℃のCO 2インキュベーター内で場所細胞。
クラミジア介在物の4生細胞の可視化
- CO 2インキュベーターからクラミジア感染GFP-HeLa細胞を削除し、フェノール5 +赤％のFBSを含まないRPMIで培地を交換してください。
- 20倍以上のオイル対物レンズを用いて倒立蛍光顕微鏡（ニコンエクリプスのTi-Eまたは類似の）上のマウント細胞。
- 大きなブラックホール（ クラミジア介在物）を含む緑色の細胞：イメージングソフトウェア（Volocity 6または類似）を使用して、に焦点を当て、特定クラミジアは、GFP-HeLa細胞を感染させました。
- マークイメージングソフトウェアを使用して、関心のクラミジアに感染した細胞を含む領域のXYZ場所（巻ocity 6または類似）。手動XYステージ表示モードでしばらく「ポイントの追加」をすることによって、これを実行します。このように、XYZ座標は、各マークされた場所のために保存されています。
- 取得設定]ダイアログボックスで、緑（GFP、ヒーラ細胞質ゾル）と赤（mKate2、 トラコーマクラミジア ）チャネル、およびチャネルごとに新しいフレームごとに5分の割合でを取得するソフトウェアを設定します。
- 取得プロトコルを使用して画像シーケンスを取得」キャプチャ/録音」ボタンをクリックすることで、上記で入力しました。
生細胞内封入成長パラメータの5定量
- 所望の時間感染後（ 例えば 、24、48 HPI）でインキュベーターからクラミジア感染GFP-HeLa細胞を除去し、倒立蛍光顕微鏡に取り付けます。注：高NAの20Xや40X空気目的は、24ウェルプレートのために最も適しており、40X油目的は、チャンバースライドをお勧めします。このお尻のためのいずれかの基板上に細胞を増殖させますAY。
- 介在物は、その最大径であり、鮮明なエッジをもたらす細胞のミッドプレーン、に焦点を当てています。
- 各ウェル（ウェル当たり少なくとも10）に多くの分野のための画像を取得します。ウェルは、通常、複製または実験変数を表します。
- 目で（介在物は、GFP-HeLa細胞における黒区画されている）、手動で介在物の個数を列挙したり、自動的に介在物を特定し、カウントするイメージングソフトウェア・アルゴリズムを使用しています。
- 蛍光強度によって、GFP-HeLa細胞を探す（コマンド「オブジェクトの検索」）を、細胞の相対強度に基づいて、蛍光閾値強度を調整します。
- 52μm以下だけ大きいものを維持するサイズのガイドラインを使用して、選択したオブジェクトをフィルタリングします。これは、「人口1」です。
- 入力として「人口1 'を使用して、コマンド「オブジェクトの穴フィル」を適用します。このステップは、「人口2 'を生成します。
- P 'から「人口1」を減算し「人口3 'と指定積極マークさクラミジア介在物を、生成する「opulation 2。
- 例えば、24時間以上のために感染した細胞内封入体のためには25μm2よりも大きなオブジェクトを保持するために、「人口3 '（コマンド「人口フィルター」を）にサイズのフィルタを適用します。これらの介在物がはるかに小さいなどの前に18時間早ければ感染の時間については、設定サイズのフィルタは、4μm2でより大きなオブジェクトを保持します。 「介在物」として指定されたオブジェクトの集団でのサイズフィルタリング結果。
- イメージングソフトウェアを使用して、例えば、画像から封入番号、封入サイズ、及び包含外周の定量的データを計算します。
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Representative Results
サイトゾル蛍光タンパク質 （例えば、GFP）を発現する哺乳動物細胞を生、感染細胞培養物においてクラミジア介在物の照明を可能にするように設計することができます。 クラミジアの感染の際に、介在物は、宿主細胞（ 図1）における黒点として容易に見ることができます。蛍光欠けている介在物の透明度は、ビューおよび/ または治療（ 図1）の多くの分野を横断介在物の自動識別のために利用することができます。蛍光ホスト細胞が生成されると、強力な新しいワークフローは、実験試料におけるクラミジア感染レベルの迅速な定量分析のために有効になっています。一つの主要なアプリケーションは、ライブ、感染した細胞におけるクラミジア封入形成単位（IFU）（ 図2）の決意です。この実験的な戦略は、日常的分野において使用される免疫蛍光手順、を不要に、時間がかかり、高価な。
記載の撮像方法の別の重要な特徴は、それが容易に任意のクラミジア種または株に適用することができ、かつ、さらに、クラミジア封入体の重要な生物学的特性の導出に利用することができることです。例として、GFP-HeLa細胞の経時的分析は 、Cに感染しましたトラコマチス LGV血清型L2、C。トラコマチス血清型D、C。 muridarum、および C. 肺炎は、16、24、及び48 HPI（ 図3）で行いました。これらのクラミジア種および株の各々について、介在物がマークされ、それらの平均面積、周囲長を計算するために分析し、時には細胞当たりの個数（図4）に示しました。これらの属性は、クラミジア封入体の生物学に関する重要な情報を提供し、それらが宿主細胞と対話する方法を通知します。記載の方法は、SUの方法でこの情報にアクセスするための容易な方法を提供します他の実験技術によって達成することができるものrpasses。逆ラベリング戦略の最終的な有用性は、生細胞におけるクラミジア介在物のリアルタイムイメージングのためのものです。この例は、 ムービー1に示されています。
Cの図1.自動検出トラコーマ封入体 （A）GFP-HeLa細胞を（B）mKate2発現を感染させたC.トラコマチスL2と 24 HPIでのライブ画像化しました。イメージングソフトウェアベースのアルゴリズムは、自動的にオレンジ色でマークされたGFP-HeLa細胞、ブラックホールを選択する（C）によってクラミジア介在物を同定するために使用しました。 （D）パネルAおよびBからの感染した細胞の合成画像も示されています。 =20μmのスケールバー。 .jove.com /ファイル/ ftp_upload / 51131 / 51131fig1large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
GFP-HeLa細胞におけるユニット（IFU）を形成するクラミジア封入の図2定量。GFP-HeLa細胞を感染させたC.トラコマチス感染の二つの異なる多重度でL2および24 HPIで画像化しました。感染あたり10フィールドの介在物が検出され、自動化されたソフトウェアを使用して列挙し、結果が与えられた（n = 3）。エラーバーは平均の標準誤差を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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C.図3.時間経過トラコマチス血清型L2、C。トラコマチス血清型D、C。 muridarum、および C. 肺炎 GFP-HeLa細胞における感染。GFP-HeLa細胞を感染させたC.トラコマチス LGV血清型L2および（A）16 HPI、（B）24 HPI、および（C）48 HPIでライブ蛍光顕微鏡で撮像されました。 C.に感染したGFP-HeLa細胞トラコマチス血清型 Dは、（D）16 HPI、（E）24 HPI、及び（F）48 HPIで画像化しました。 C.に感染したGFP-HeLa細胞muridarumは 16 HPI、（H）24 HPI、 および （I）48 HPI（G）で 画像化しました。 C.に感染したGFP-HeLa細胞ニューモニエ（J）16 HPI、（K）24 HPI、および（L）48 HPIで画像化しました。代表的な画像は、すべての感染症との時間のために示されています。スケールバー=20μmでは。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4の代表的な定量的データは、時間経過実験から導いた。（A）に感染したC. GFP-HeLa細胞からの介在物トラコマチス LGV血清型L2、（B）C.トラコマチス血清型D、（C）C. muridarum、及び（D）C.肺炎が検出され、16、24に列挙し、そして48 HPI（5フィールドの時間間隔ごとに、N = 3）しました。 chlamの物理的特性ydial介在物が包含面積、周囲長包含し、細胞当たり封入体の数の定量化しました。エラーバーはSEMを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。GFPに感染したC. mCherryを-HeLa細胞のムービー1時間経過のビデオ48 HPIで採取されたトラコーマ L2、。動画は125分間、5分間隔で撮影したタイムラプス一連の画像からコンパイルされました。 mCherryを、HeLa細胞を横切るループ映像を交互に（赤）、C.トラコマチス L2（緑）、両方のフィールドのマージ。
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Discussion
ここでは、リアルタイムの可視化とクラミジア介在物の分析のための蛍光宿主細胞を生成するための実験的な戦略について説明します。この液胞の可視化手法は、点灯トラックと定量的に細胞の集団間または経時単一細胞におけるクラミジア介在物の動的特性を測定するための強力な能力を付与する。蛍光タンパク質標識細胞におけるクラミジア介在物が著しく十分に定義され、それらは容易に識別されるように追加免疫処理を必要としません。さらに、このアプローチは、細胞と包括曲率あたりの液胞の数など、さまざまなクラミジア種および株が保有することを署名形態学的相違を解決するのに十分な感度です。加えて、我々は、イメージングソフトウェアは自動的にGFPを発現する宿主細胞内で封入体を同定するために適合させることができる方法を示します。 ILのための免疫蛍光ラベリングステップの疎遠化クラミジア封入体の部分の光量は、このような包含形成単位（IFU）の決意として、エンドポイントアッセイのためにユーザに多大な時間とコストの節約につながります。また、生細胞の画像介在物の能力は、それによって、時間経過の研究のために必要な井戸またはプレートの数を減らす、クラミジア発達サイクルにわたって正確な時刻に分析すべき感染した細胞の同じ母集団を可能にします。細胞質GFP、mCherryを、 等は 、光退色を受けない明るい、安定した信号が得られます。この機能は、長いタイムラプスイメージング実験のために非常に重要です。技術はクラミジア発達遺伝子発現の独立しているため最後に、それはクラミジアによる細胞の感染のすべての段階でも同様に効果的です。
細胞内のクラミジアおよび膜7,8を標識するための既存の戦略と比較すると、この技術は、実験Aのシンプルさと柔軟性を提供していますpplications。 クラミジアに感染した宿主細胞の蛍光は、色素ローディング、標識または他の細胞の操作を必要とせず、すぐに撮像することができます。このアプローチは、明らかに点灯し、非標識インクルージョン（細菌）の管腔スペースを維持しながら、介在物のエッジを定義します。 クラミジア感染細胞を照射し、列挙のために、このアプローチの利点は、主に生きた培養物との相溶性にあり、それが提供し、したがってかなりの時間の節約。しかし、標識及びクラミジアを含む液胞自体の定量的なパラメータの導出のために、このコンパートメントのための市販の抗体は、広く利用できません。その結果、反転GFPのアプローチは、この病原体コンパートメントの膜を画定するための最も容易で直接的な手段のまま。
クラミジアこの撮像方法を適用するための重要な考慮事項がありvisualizatイオンのワークフロー。それ等はGFP、mCherryを、の安定した発現を有する宿主細胞株は、予め生成されていることが重要です。クラミジア介在物が簡単に一過性の蛍光タンパク質を用いてトランスフェクトされた宿主細胞内で検出されていますが、このようにして作製した細胞は、人口全体の不完全なトランスフェクションと同様に、可変発現レベルに苦しみます。また、トランスフェクションは、全体的な手順への不必要なステップを追加します。記載された方法の別の制限は、内包物は、異なるクラミジア属に由来することです。それらの形態学的外観、それらが、宿主細胞と相互作用する様式で著しく異なっていてもよいです。このイメージング手法は、Cを含む介在物を検出して画像化するために非常に堅牢ですトラコマティス、C。 muridarumまたはC.肺炎連鎖球菌 ;しかし、いくつかのクラミジア種 （最も顕著なのC.オウム病および C. キャビエ ）のための介在物は、Gを除く少ないことが可能ですその管腔スペースからFP。 Cを含む介在物オウム病またはC.・キャビエは、GFP-HeLa細胞中で容易に表示されますが、これらの介在物へのいくつかのGFPの侵入は、介在物のソフトウェアベースの検出の誤り率を増加させます。
全体的な実験戦略が適切に実施された後、新たな機会が生細胞におけるクラミジア介在物の定量分析のために作成されています。イメージングソフトウェアを使用して、または手動スコアリングによって自動化された方法のいずれかで - 私たちは、この技術が包含列挙のための合理化されたワークフローを可能にする方法を示します。このアプローチの新規アプリケーションは、例えば、包含領域、ボリュームや形状のため、インクルージョンに関する意味のある定量的データの導出のためのものです。最後に、この視覚化の方法は、高度に適応可能であり、例えば、 クラミジア感染宿主細胞の生物学へのさらなる洞察を明らかに他の蛍光マーカーと組み合わせて使用することができますGFP-またはmKate2発現クラミジア6,11、蛍光アクチン12またはGFPは、株式会社タンパク質13をタグ付け。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を有していないことを宣言します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| 0.45 µm filters | Fisher | 09-719D | |
| G418 | Invitrogen | 10131 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| RPMI 1640 w/o phenol red | Cellgro | 17-105-CV | |
| Penicillin G | Sigma | 13752 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Chamber slides, Lab-Tek II | Nunc | 154526, 154534 |
References
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